Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen flow cytometrischen Ansatz zur Analyse von mitochondrialem ROS in verschiedenen lebenden Knochenmark (BM)-abgeleiteten Stamm- und Vorläuferzellpopulationen von gesunden Mäusen sowie Mäusen mit AML, die von MLL-AF9 angetrieben werden. Insbesondere beschreiben wir einen zweistufigen Zellfärbeprozess, bei dem gesunde oder Leukämie-BM-Zellen zuerst mit einem fluorogenen Farbstoff gefärbt werden, der mitochondriale Superoxide erkennt, gefolgt von der Färbung mit fluorchromegebundenen monoklonalen Antikörpern, die verwendet werden. verschiedene gesunde und bösartige hämatopoetische Vorläuferpopulationen zu unterscheiden. Wir bieten auch eine Strategie für den Erwerb und die Analyse der Proben durch Durchflusszytometrie. Das gesamte Protokoll kann in einem Zeitrahmen von nur 3-4 h durchgeführt werden. Wir heben auch die wichtigsten zu berücksichtigenden Variablen sowie die Vorteile und Grenzen der Überwachung der ROS-Produktion im mitochondrialen Teil von lebenden hämatopoetischen und Leukämiestamm- und Vorläufersubpopulationen mit fluorogenen Farbstoffen durch Durchflusszytometrie hervor. . Darüber hinaus präsentieren wir Daten, dass die mitochondriale ROS-Fülle zwischen verschiedenen gesunden HSPC-Subpopulationen und Leukämie-Vorläufern variiert, und diskutieren die möglichen Anwendungen dieser Technik in der hämatologischen Forschung.

Einleitung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind hochreaktive Moleküle, die aus molekularem Sauerstoff gewonnen werden. Der am besten definierte zelluläre Standort der ROS-Produktion ist die Mitochondrien, wo Elektronen, die während der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) durch die Elektronentransportkette (ETC) gehen, von molekularem Sauerstoff absorbiert werden, was zur Bildung einer spezifischen Art von ROS genannt Superoxide¹. Durch die Aktionen einer Reihe von Enzymen, sogenannten Superoxid-Dismutasen oder SODs, werden Superoxide in Wasserstoffperoxide umgewandelt, die anschließend durch Enzyme wie Kataalase oder Glutathionperoxidasen (GPX) in Wasser neutralisiert werden. Störungen in ROS-Regulierungsmechanismen können zu einer übermäßigen Produktion von ROS führen, der oft als oxidativer Stress bezeichnet wird und schädliche und potenziell tödliche zelluläre Folgen wie Makromolekülschäden (z. B. DNA, Protein, Lipide) hat. Darüber hinaus ist oxidativer Stress mit mehreren Pathologien verbunden, wie Diabetes, entzündliche Erkrankungen, Alterung und Tumoren^2,3,4. Um Die Homöostase von Redox aufrecht zu erhalten und oxidativen Stress zu verhindern, besitzen die Zellen eine Vielzahl von ROS-regulierenden Mechanismen⁵.

Physiologische Konzentrationen bestimmter ROS sind für eine ordnungsgemäße embryonale und erwachsene Hämatopoese⁶notwendig. Überschüssiges ROS ist jedoch mit DNA-Schäden, zellulärer Differenzierung und Erschöpfung des hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferpools verbunden. Es gibt auch Hinweise darauf, dass Veränderungen in der Redoxbiologie zwischen Leukämie und gesunden Zellen unterscheiden können. Zum Beispiel, ROS-Spiegel neigen dazu, höher in akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellen im Vergleich zu ihren gesunden Gegenstücken und andere Studien haben vorgeschlagen, dass Leukämie-Stammzellen halten einen niedrigen stationären Zustand ROS für das Überleben^7,8. Wichtig ist, Strategien zur therapeutischen Kapitalisierung dieser Redoxunterschiede haben in mehreren menschlichen Krebsumgebungen versprechend gezeigt^9,10. Daher können Assays, die die Bewertung der ROS-Spiegel in Mausmodellen ermöglichen, unser Verständnis darüber verbessern, wie diese Arten zur zellulären Physiologie und Krankheitspathogenese beitragen, und potenziell eine Plattform für die Bewertung der Wirksamkeit von neuartige Nobox-targeting-Anti-Krebs-Therapien.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen tierexperimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Fox Chase Cancer Center genehmigt.

HINWEIS: Der Protokollworkflow ist in 4 Teile unterteilt, wie in Abbildung 1 dargestellt, und die erforderlichen Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

1. Knochenmark (BM) Isolierung

HINWEIS: MLL-AF9 Leukämiemäuse wurden wie zuvor beschrieben¹¹erzeugt.

1. Rückgewinnung mononuklearer Knochenmarkzellen, wie zuvor beschrieben^12,13,14,15, von wilden Typ C57.Bl6-Mäusen (die den cd45.2-Kongenenmarker ausdrücken) sowie von C57. Bl6-SJL-Mäuse (die den cd45.1-Kongenenmarker ausdrücken), die mit MLL-AF9-exprimierenden Leukämiezellen transplantiert wurden (CD45.2⁺).
   HINWEIS: BM kann von Mäusen entweder durch Zerkleinern^{von 12,13} oder durch Spülen von Knochen^14,15zurückgewonnen werden. Für die hier vorgestellten Experimente wurde BM sowohl von gesunden als auch von Leukämiemäusen durch Spülung geborgen.

2. Mitochondriale ROS FluorogenfarbstoffFärbung

1. Sobald mono-nukleare Knochenmarkzellen von gesunden und/oder Leukämiemäusen geborgen wurden, färben Sie eine Aliquot von Zellen mit Trypan Blue und zählen mit einem Hämozytometer, um die Startzahl der gesamten BM-Zellen zu bestimmen.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und das Pellet in F-PBS (PBS ergänzt mit 2% fetalem Rinderserum und einem 1% Penicillin/Streptomycin-Cocktail) auf eine Konzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml wieder aufsetzen.
3. Aliquot 200 l Zellsuspension pro Rohr in 9 einfarbige Kontrollröhrchen, die wie folgt gekennzeichnet sind:
   Kein Fleck, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (nur für gesunde HSPCs), CD45.2-APC (nur für Leukämiezellen), CD34-FITC, Mitochondrial ROS Farbstoff und Live/Dead Cell Stain.
   HINWEIS: (Optional) Eine positive Kontrolle für die Induktion von mitochondrialem ROS kann durch Behandlung von 2 x 10⁵ Zellen in 200 l mit 20 M Menadion-Natriumbisulfit (MSB) für 1 h bei 37 °C in einem 5%_{CO2-Inkubator} hergestellt werden. Eine zweite Steuerung zur Umkehrung der MSB-vermittelten Induktion von mitochondrialem ROS kann durch Behandlung von 2 x 10⁵ Zellen in 200 l mit 20 M MSB plus 100 M N-Acetyl-L-Cystein (NAC) für 1 h bei 37 °C in einem 5%_{CO2-Inkubator} hergestellt werden.
4. Aliquot die verbleibenden Zellen in einem Rohr (experimentelles Rohr) und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
5. Setzen Sie die Zellen in F-PBS mit einem lebenden/toten Zellfleck gemäß den Anweisungen des Herstellers aus. Inkubieren Sie auf Eis für 30 min. Achten Sie darauf, lebend / tote Fleck auf dem einfarbigen Kontrollrohr hinzufügen.
6. Fügen Sie 1,0 ml Raumtemperatur (RT) F-PBS sowohl in einfarbigen als auch in experimentellen Röhrchen hinzu, die mit dem lebenden/toten Farbstoff gefärbt sind. Zentrifuge 5 min bei 300 x g bei RT.
7. Resuspendieren Sie 50 g des mitochondrialen ROS-Farbstoffs in 13 l Dimethylsulfoxid (DMSO), um eine 5 mM-Stammlösung zu erhalten.
8. Mitochondrialen ROS-Farbstoff in RT F-PBS mit oder ohne Verapamil (50 m) auf eine Endkonzentration von 5 m verdünnen.
9. Aspirieren Sie die Wäsche des lebenden/toten Zellflecks. Fügen Sie jedem Versuchsröhrchen 200 L mitochondrialen ROS-Farbstoff mit Verapamil sowie dem mitochondrialen ROS-Farbstoff-Einfarben-Kontrollrohr hinzu.
10. Wirbel zu mischen und für 10 min bei 37 °C im Dunkeln zu mischen.
11. Fügen Sie 1,0 ml RT F-PBS zu den mitochondrialen ROS-gebeizten einfarbigen Kontroll- und Versuchsröhrchen hinzu. Zentrifuge 5 min bei 300 x g bei RT.
12. Den Überstand absaugen und die Zellen mit zusätzlichen 1,0 ml RT F-PBS waschen. Zentrifuge 5 min bei 300 x g bei RT.

3. Lineage Antikörper Färbung

1. Bereiten Sie die in Tabelle 1aufgeführten Antikörpercocktails vor.
   HINWEIS: Diese Antikörper Cocktails wurden zuvor optimiert^14,15,16.
2. Aspirieren Sie den Überstand aus der letzten mitochondrialen ROS-Farbstoffwäsche der Versuchsröhrchen, die gesunde BM enthalten, und fügen Sie jedem Röhrchen 200 l Antikörpercocktail #1 hinzu. Wirbel zu mischen. Bereiten Sie auch die einfarbigen Steuerrohre vor. Inkubieren Sie für 60 min auf Eis in der Dunkelheit.
3. Aspirieren Sie den Überstand aus der letzten mitochondrialen ROS-Farbstoffwäsche der leukämiehaltigen Versuchsröhrchen BM und fügen Sie jedem Röhrchen 200 l des Antikörpercocktails #2 hinzu. Wirbel zu mischen. Inkubieren Sie für 60 min auf Eis in der Dunkelheit.
4. Mit 1,0 ml kaltem F-PBS und Zentrifuge 5 min bei 300 x g bei RT waschen.
5. Resuspend Zellen in 500 l kalteF-PBS und Filtern der Zellen in einem Durchflusszytometerrohr mit einem 40-mm-Filter, um Aggregate auszuschließen.

4. Durchflusszytometrie Erfassung und Analyse

HINWEIS: Mehrere hämatopoetische Stamm- und Vorläufer-Untergruppen sind selten, wie z. B. langfristige hämatopoetische Stammzellen. Daher sollten idealerweise 3-5 Millionen Ereignisse für jede Versuchsröhre während der Durchflusszytometrieerfassung gesammelt werden, um eine ausreichende Analyse von mitochondrialem ROS in den verschiedenen HSPC-Teilmengen zu ermöglichen.

1. Verwenden Sie das Fleckenkontrollrohr, um die nach vorne (FSC-A) und seitlichen (SSC-A) Streudiagramme basierend auf der Größe und Komplexität der analysierten Zellpopulation einzustellen.
2. Verwenden Sie die fleckenfreien und einfarbigen Steuerröhrchen, um das Durchflusszytometer zu kompensieren.
3. Tor ieren Sie fremde Trümmer aus dem vorderen und seitlichen Streudiagramm heraus (Abbildung 2A,B, erstes Panel von links).
4. Gate out Doublets mit einem doppelten Diskriminator wie dem vorderen Diskriminator(Abbildung 2A,B, zweites Panel von links).
5. Befolgen Sie die in Abbildung 2A,B vorgeschlagene Gating-Strategie zur Auswahl von lebenden Zellen, Linienniedriger Zellen und den verschiedenen HSPC- und Leukämie-Untergruppen.
6. Analysieren Sie für jede von Interesse bedachte Grundgesamtheit die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) des TRPE-Kanals (x-Achse) in einem Histogrammdiagramm, um Unterschiede im mitochondrialen ROS-Signal zu bewerten(Abbildung 3A-C, linke Panels). Ebenen von mitochondrialem ROS können auf einzelzelliger Ebene ausgewertet werden, indem mitochondriale ROS-Färbung mit bestimmten Linienmarkierungen in einem Streudiagramm verglichen wird.

Ergebnisse

Präsentiert wird eine Methode zur Analyse von ROS in den Mitochondrien mehrerer gesunder und MLL-AF9-exemittierender Leukämie-Vorläuferpopulationen. Abbildung 1 zeigt eine schematische Ansicht des Protokollworkflows, die aus 4 Hauptschritten besteht: 1) BM-Isolierung von Mäusen; 2) Färbung von BM-Zellen mit einem fluorogenen Farbstoff, der mitochondriale ROS, insbesondere Superoxide erkennt; 3) Oberflächenmarker-Antikörperfärbung zur Abgrenzung verschiedener gesunder und Leukämie h?...

Diskussion

Fluorogene Farbstoffe, die für den Nachweis von ROS entwickelt wurden, werden häufig in festen Zellen durch Mikroskopie oder in lebenden Zellen durch Durchflusszytometrie²²ausgewertet. Die zytometrische Fließbewertung von mitochondrialem ROS in BM-Zellen mit mitochondrialen ROS-Fluorenfarbstoffen hat zwei wesentliche Vorteile: 1) Es ist eine schnelle und einfache Technik, die für die Analyse von lebenden Zellen geeignet ist und 2) es ermöglicht, seltene Populationen auf einzelzeller Ebene im ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye