木尿造血干细胞和祖细胞和MLL-AF9驱动白血病线粒体反应氧物种的流细胞学分析

摘要

我们描述了一种使用多参数流细胞测定法来检测小鼠健康造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中的线粒体活性氧物种（ROS）和白血病细胞的方法，这些细胞来自急性骨髓性白血病（AML）的小鼠模型。MLL-AF9。

摘要

我们提出了一种流式细胞学方法，用于分析健康小鼠以及MLL-AF9驱动的AML小鼠的各种活骨髓（BM）衍生干细胞和祖细胞群中的线粒体ROS。具体来说，我们描述了一个两步细胞染色过程，其中健康或白血病BM细胞首先用荧光染料染色，检测线粒体超氧化物，然后染色与氟铬链接单克隆抗体使用区分各种健康和恶性造血祖群。我们还提供了一个通过流式细胞测定采集和分析样品的策略。整个协议可以在3-4小时的时间内执行。我们还强调了要考虑的关键变量，以及监测活造血干细胞和白血病茎线粒体中ROS生产的优点和局限性，并使用流式细胞测定的氟原染料进行祖生子种群.此外，我们提供的数据，线粒体ROS丰度在不同的健康HSPC亚群体和白血病祖细胞之间变化，并讨论了该技术在血液学研究的可能应用。

引言

活性氧物种（ROS）是从分子氧中提取的高度活性分子。ROS生产最明确的细胞位置是线粒体，在氧化磷酸化（OXPHOS）期间通过电子传输链（ETC）的电子被分子氧吸收，从而形成特定的ROS类型称为超^{氧化物1。}通过一系列酶（称为超氧化物歧化酶或SOD）的作用，超氧化物转化为过氧化氢，随后通过催化酶或谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等酶中和成水。ROS 调节机制中的扰动可导致 ROS 的过量生产，通常称为氧化应激，具有有害且潜在的致命细胞后果，如大分子损伤（即 DNA、蛋白质、脂质）。此外，氧化应激与多种疾病有关，如糖尿病、炎症性疾病、衰老和^{肿瘤2、3、4。}为了保持氧化平衡和防止氧化应激，细胞拥有各种ROS调节^机制5。

某些ROS的生理水平是必要的适当的胚胎和成人造^核6。然而，过量的ROS与DNA损伤、细胞分化和造血干细胞和祖细胞池的衰竭有关。也有证据显示，在白血病和健康细胞之间，氧化还原生物学的改变可能有所不同。例如，在急性骨髓性白血病（AML）细胞中，ROS水平往往高于其健康细胞，其他研究表明，白血病干细胞维持低稳态的ROS水平，以^{生存7，8。}重要的是，利用这些氧化还原差异的治疗策略在几个人类癌症环境中显示出了^{希望9，10。}因此，允许评估小鼠模型中ROS水平的检测可以增进我们对这些物种如何促进细胞生理学和疾病发病机制的理解，并可能为评估新型氧化还原靶向抗癌疗法。

研究方案

本议定书中描述的所有动物程序均已获得福克斯大通癌症中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注:协议工作流程分为4个部分，如图1所示，所需试剂列在材料表中。

1. 骨髓 （BM） 隔离

注:MLL-AF9白血病小鼠的产生，如^前11所述。

1. 如前^文所述，从野生型C57.Bl6小鼠（表示CD45.2共基因标记）和C57中恢复单核骨髓细胞，如前所述12、13、14、15。Bl6-SJL小鼠（表示CD45.1致基因标记）已移植与MLL-AF9表达白血病细胞（CD45.2+）。
   注:BM可以通过^{粉碎12，13}或冲洗^{骨头14，15}从小鼠中恢复。在这里提出的实验，BM通过冲洗从健康和白血病小鼠中恢复。

2. 线粒体 ROS 荧光染料染色

1. 一旦从健康和/或白血病小鼠中恢复单核骨髓细胞，用Trypan Blue染色一个等分位细胞，并使用血细胞计计数，以确定总BM细胞的起始数量。
2. 在300 x g下将细胞离心5分钟。在F-PBS中吸收上清液并重新悬浮颗粒（PBS补充2%胎儿牛血清和1%青霉素/链霉素鸡尾酒），浓度为2 x 10⁶细胞/mL。
3. 每管的电池悬浮液200μL，分为9个单色控制管，标签如下:
   无污渍，B220-Cy5-PE，cKit-Cy7-APC，Sca1-PacBlue，CD150-APC（仅适用于健康的HPC），CD45.2-APC（仅适用于白血病细胞），CD34-FITC，线粒体ROS染料和活/死细胞染色。
   注:（可选）通过在 5% CO₂培养箱中用 20 μM 的 Menadione 双硫酸钠 （MSB） 在 37°C 下处理 2 x 10⁵细胞，可以制备线粒体 ROS 诱导的阳性控制。通过用20μM MSB加100μM N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）在5%CO₂培养箱中处理200μL中的2 x 10⁵细胞，可以制备第二种控制，以逆转线粒体ROS的MSB介导诱导。
4. 将剩余的细胞与300 x g的离心机（实验管）中的细胞等同分5分钟。
5. 根据制造商的说明，用活/死细胞染色重新悬浮F-PBS中的细胞。在冰上孵育30分钟，一定要在单色控制管中添加活/死污渍。
6. 在单色和实验管中加入1.0 mL的室温（RT）F-PBS，并涂上活/死染料。在 RT 时，在 300 x g下离心 5 分钟。
7. 在13μL二甲基硫酸盐（DMSO）中重新悬浮50μg线粒体ROS染料，以获得5 mM库存溶液。
8. 在RT F-PBS中稀释线粒体ROS染料，最终浓度为5μM，无论是否不含Verapamil（50μM）。
9. 吸出活/死细胞污渍的洗涤。在每个实验管以及线粒体ROS染料单色控制管中加入含有Verapamil的线粒体ROS染料染色剂200μL。
10. 在黑暗中37°C下混合和孵育10分钟。
11. 将 1.0 mL 的 RT F-PBS 添加到线粒体 ROS 染色单色控制和实验管中。在 RT 时，在 300 x g下离心 5 分钟。
12. 吸出上清液，用额外的1.0 mL的RT F-PBS清洗细胞。在 RT 时，在 300 x g下离心 5 分钟。

3. 系界线抗体染色

1. 准备表1所列抗体鸡尾酒。
   注:这些抗体鸡尾酒已经优化之前14，15，16。
2. 从含有健康BM的实验管的最终线粒体ROS染料洗涤中吸出上液，并在每个管中加入200μL的抗体鸡尾酒#1。漩涡混合。还准备单色控制管。在黑暗中在冰上孵育60分钟。
3. 从含有白血病BM的实验管的末线粒体ROS染料洗涤中吸出上液，并在每个管中加入200μL的抗体鸡尾酒#2。漩涡混合。在黑暗中在冰上孵育60分钟。
4. 用 1.0 mL 的冷 F-PBS 清洗，在 RT 时以 300 x g的速度清洗离心机 5 分钟。
5. 在 500 μL 的冷 F-PBS 中重新悬浮细胞，并使用 40 μm 过滤器过滤流式细胞计管中的细胞以排除聚合。

4. 流式细胞采集与分析

注:几个造血干细胞和祖细胞子集是罕见的，如长期造血干细胞。因此，理想情况下，在流式细胞学采集期间，每个实验管应收集300万到500万个事件，以便充分分析各种HSPC子集中的线粒体ROS。

1. 使用无染色控制管根据所分析的细胞群的大小和复杂性设置正向 （FSC-A） 和侧 （SSC-A） 散射图。
2. 使用无污渍和单色控制管补偿流量细胞仪。
3. 从正向和侧面散射图中挖出无关碎片（图2A，B，左侧第一面板）。
4. 使用双鉴控器（如前锋鉴别器）的双打门（图2A，B，左侧第二面板）。
5. 按照图2A、B中提出的门控策略，选择活细胞、系系低细胞以及各种HSPC和白血病子集。
6. 对于每个感兴趣的群体，分析直方图图中 TRPE 通道 （x 轴） 的荧光强度 （MFI）， 以评估线粒体 ROS 信号的差异（图 3A-C，左侧面板）。线粒体ROS的水平可以通过比较线粒体ROS染色与散射图中特定系划的标记在单细胞水平上进行评估。

结果

提出了一种分析多个健康型和MLL-AF9表达性白血病祖体群线粒体ROS的方法。图 1显示了协议工作流的原理图视图，该视图由 4 个主要步骤组成:1） BM 与小鼠分离;2） 用能识别线粒体ROS的荧光染料染色BM细胞，特别是超氧化物;3） 表面标记抗体染色，以划定各种健康和白血病造血人群;4） 流式细胞学采集和分析。

图 2A，B描...

讨论

为检测ROS而开发的荧光染料，经常通过显微镜或流式^细胞22在固定细胞中进行评估。使用线粒体ROS氟致染料对BM细胞中线粒体ROS进行流式细胞测量具有两个主要优点:1）它是一种快速简便的技术，适合活细胞分析;2）它允许区分和分析罕见使用表面标记染色在BM的单细胞水平上。此处介绍的分步协议旨在研究两只健康小鼠的造血干细胞和祖体种群的活体氧化还原状态，以及使...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye