JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz murine sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücreleri (HSPCs) ve akut miyeloid lösemi bir fare modeli lösemi hücreleri (ROS) tarafından tahrik mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için multiparametre akış sitometri sitometri kullanmak için bir yöntem tanımlamak MLL-AF9.

Özet

Sağlıklı farelerin yanı sıra MLL-AF9 tarafından yönlendirilen AML'li farelerden elde edilen çeşitli canlı kemik iliği (BM) kaynaklı kök ve ata hücre popülasyonlarında mitokondriyal ROS'u analiz etmek için akış sitometrik bir yaklaşım sitometrik bir yaklaşım sintometrik olarak sintometrik olarak sifonal bir yaklaşım sintometrik olarak sifonal bir yaklaşım sinat ıyoruz. Özellikle, sağlıklı veya lösemi BM hücrelerinin ilk olarak mitokondriyal süperoksitleri tespit eden florojenik boya ile boyandığı ve ardından florokrom bağlantılı monoklonal antikorlarla boyandığı iki aşamalı bir hücre boyama işlemini tanımlıyoruz. çeşitli sağlıklı ve malign hematopoetik döl popülasyonlarını ayırt etmek. Ayrıca, akış sitometrisi ile numunelerin elde edilip analiz edilebisbir strateji sitometrisi sağlarız. Tüm protokol 3-4 saat gibi kısa bir zaman diliminde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, akış sitometrisi ile florojenik boyalar kullanan canlı hematopoetik ve lösemi sapı ve progenitor alt popülasyonlarının mitokondriyal bölmesinde ROS üretiminin izlenmesinin avantajları ve sınırlamaları gibi önemli değişkenleri de vurguluyoruz. . Ayrıca, mitokondriyal ROS bolluğunun farklı sağlıklı HSPC alt popülasyonları ve lösemi ataları arasında değiştiğine dair veriler sunmakta ve hematolojik araştırmalarda bu tekniğin olası uygulamalarını tartışılmaktadır.

Giriş

Reaktif Oksijen Türleri (ROS) moleküler oksijenden elde edilen yüksek reaktif moleküllerdir. ROS üretiminin en iyi tanımlanmış hücresel konumu, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sırasında elektron taşıma zincirinden (ETC) geçen elektronların belirli bir oluşumuna yol açan moleküler oksijen tarafından emildiği mitokondridir. süperoksit ler1olarak adlandırılan ROS türü. Süperoksit dismutazveya SOD siyonları olarak adlandırılan bir dizi enzimin eylemleri sayesinde, süperoksitler hidrojen peroksitlere dönüştürülür ve bunlar daha sonra katalaz veya glutatyon peroksidaz (GPX) gibi enzimler tarafından suya nötralize edilir. ROS düzenleyici mekanizmalardaki pertürbasyonlar, makromolekül hasarı (DNA, protein, lipidler) gibi zararlı ve potansiyel olarak ölümcül hücresel sonuçlara sahip oksidatif stres olarak adlandırılan ROS'un aşırı üretimine yol açabilir. Ayrıca, oksidatif stres diyabet, inflamatuar hastalıklar, yaşlanma ve tümörler2,3,4gibi çeşitli patolojiler ile ilgilidir. Redoks homeostazını korumak ve oksidatif stresi önlemek için, hücreler çeşitli ROS düzenleyici mekanizmalara sahip5.

Uygun embriyonik ve erişkin hematopoyon için bazı ROS fizyolojik düzeyleri gereklidir6. Ancak, aşırı ROS DNA hasarı ile ilişkilidir, hücresel farklılaşma ve hematopoetik kök ve ata havuzu yorgunluk. Redoks biyolojisindeki değişikliklerin lösemi ve sağlıklı hücreler arasında farklılık gösterdiğine dair kanıtlar da vardır. Örneğin, ROS düzeyleri akut miyeloid lösemi (AML) hücrelerinde sağlıklı muadillerine göre daha yüksek olma eğilimindedir ve diğer çalışmalar lösemi kök hücrelerinin hayatta kalmak için ROS düşük sabit devlet düzeyini korumak olduğunu ileri sürmüşlerdir7,8. Daha da önemlisi, terapötik bu redoks farklılıkları yararlanmak için stratejiler çeşitli insan kanseri ortamlarında umut göstermiştir9,10. Bu nedenle, fare modellerinde ROS düzeylerinin değerlendirilmesine olanak sağlayan tahliller, bu türlerin hücresel fizyoloji ve hastalık patogenene nasıl katkıda bulunduklarına dair anlayışımızı geliştirebilir ve potansiyel olarak yeni redoks hedefleyen anti-kanser tedavileri.

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm hayvan prosedürleri Fox Chase Kanser Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Protokol iş akışı Şekil 1'de sunulduğu gibi 4 bölüme ayrılmıştır ve gerekli reaktifler Malzeme Tablosu'ndalistelenmiştir.

1. Kemik İliği (BM) İzolasyon

NOT: MLL-AF9 lösemi fareler daha önce açıklandığı gibi oluşturuldu11.

  1. Mono-nükleer kemik iliği hücreleri kurtarmak, daha önce açıklandığı gibi12,13,14,15, yabani tip C57.Bl6 fareler (CD45.2 konjenik marker ifade) yanı sıra C57. MLL-AF9 ifade eden lösemi hücreleri (CD45.2+) ile nakledilen Bl6-SJL fareler (CD45.1 konjenial belirteç ifade)
    NOT: BM farelerden 12,13 veya kemikleri 14,15yıkarak kurtarılabilir. Burada sunulan deneyler için, BM hem sağlıklı hem de lösemili farelerden kızarma yoluyla kurtarıldı.

2. Mitokondriyal ROS Florojenik Boya Boyama

  1. Mono-nükleer kemik iliği hücreleri sağlıklı ve / veya lösemi fareler kurtarıldı sonra, Trypan Mavi ile hücrelerin bir aliquot leke ve toplam BM hücrelerinin başlangıç sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanarak saymak.
  2. Hücreleri 5 dk. 300 x g.'da santrifüj edin ve F-PBS'deki peleti (PBS %2 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin/Streptomisin kokteyli ile desteklenmiş) 2 x 106 hücre/mL konsantrasyona geri alın.
  3. Aliquot 200 μL hücre süspansiyonu tüp başına 9 tek renkli kontrol tüpü ne kadar etiketli olarak etiketlenmiştir:
    Leke yok, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (sadece sağlıklı HSPC'ler için), CD45.2-APC (sadece lösemi hücreleri için), CD34-FITC, Mitokondriyal ROS boya ve Canlı/ölü hücre lekesi.
    NOT: (İsteğe bağlı) Mitokondriyal ROS indüksiyonu için pozitif kontrol, 200 μL'de 200 μL'lik 2 x 10 5 hücre ile %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 1 saat boyunca 200°L'de 2 x 105 hücrenin tedavi edilmesiyle hazırlanabilir. Mitokondriyal ROS'un MSB aracılı indüksiyonuna ters çevirmek için ikinci bir kontrol, 200 μL'de 200 μL'lik 2 x 105 hücre nin 200 μM MSB artı 100 μM N-asetil-L-sistein (NAC) %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 1 saat için tedavi edilerek hazırlanabilir.
  4. Aliquot bir tüp (deneysel tüp) ve santrifüj içinde kalan hücreleri 300 x g 5 dk için.
  5. Üreticinin talimatlarına göre canlı/ölü hücre lekesi ile F-PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
  6. Canlı/ölü boya ile boyanmış tek renkli ve deneysel tüplere oda sıcaklığında 1,0 mL (RT) F-PBS ekleyin. Sentrifuge 5 dk 300 x g RT de.
  7. 5 mM stok çözeltisi elde etmek için 13 μL dimetil sülfoksitte (DMSO) 50 μg mitokondriyal ROS boyasını yeniden askıya alın.
  8. Verapamil (50 μM) içeren RT F-PBS'de mitokondriyal ROS boyasını 5 μM'lik son konsantrasyona seyreltin.
  9. Canlı/ölü hücre lekesinin yıkandığını aspire edin. Her deney tüpüne ve mitokondriyal ROS boyatek renkli kontrol tüpüne Verapamil içeren 200 μL mitokondriyal ROS boya lekesi ekleyin.
  10. Girdap karıştırmak ve karanlıkta 37 °C'de 10 dakika kuluçka.
  11. Mitokondriyal ROS lekeli tek renkli kontrol ve deneysel tüplere 1,0 mL RT F-PBS ekleyin. Sentrifuge 5 dk 300 x g RT de.
  12. Supernatant kapalı Aspire ve RT F-PBS ek bir 1.0 mL ile hücreleri yıkayın. Sentrifuge 5 dk 300 x g RT de.

3. Soy Antikor Boyama

  1. Tablo 1'delistelenen antikor kokteylleri hazırlayın.
    NOT: Bu antikor kokteyller daha önce optimize edilmiştir14,15,16.
  2. Sağlıklı BM içeren deneysel tüplerin son mitokondriyal ROS boya yıkamasından süpernatant aspire ve her tüp #1 antikor kokteyl 200 μL ekleyin. Girdap karıştırmak için. Ayrıca tek renkli kontrol tüpleri hazırlayın. Karanlıkta buz üzerinde 60 dakika kuluçka.
  3. Lösemi BM içeren deneysel tüplerin son mitokondriyal ROS boya yıkama supernatant aspire ve antikor kokteyl #2 her tüp #2 200 l ekleyin. Girdap karıştırmak için. Karanlıkta buz üzerinde 60 dakika kuluçka.
  4. RT'de 1,0 mL soğuk F-PBS ve santrifüj 5 dk 300 x g ile yıkayın.
  5. Hücreleri 500 μL soğuk F-PBS'de yeniden askıya alın ve agregaları dışlamak için 40 μm'lik bir filtre kullanarak akış sitometre tüpündeki hücreleri filtreleyin.

4. Akış Sitometri Kazanım ve Analizi

NOT: Uzun süreli hematopoetik kök hücreler gibi çeşitli hematopoetik kök ve atasetor alt kümeleri nadirdir. Bu nedenle, çeşitli HSPC alt kümelerinde mitokondriyal ROS yeterli analizi için akış sitometri edinimi sırasında her deneysel tüp için ideal 3-5 milyon olay toplanmalıdır.

  1. Analiz edilen hücre popülasyonunun boyutuna ve karmaşıklığına göre ileri (FSC-A) ve yan (SSC-A) dağılım çizimlerini ayarlamak için lekesiz kontrol tüpünü kullanın.
  2. Akış sitometresini dengelemek için lekesiz ve tek renkli kontrol tüplerini kullanın.
  3. Ön ve yan dağılım çiziminden dışa doğru enkaz kapısı(Şekil 2A,B, soldan ilk panel).
  4. İleri ayırıcı(Şekil 2A,B, soldan ikinci panel) gibi çift ayırıcı kullanarak kapı dışarı çiftler.
  5. Canlı hücreleri, soy düşük hücreleri ve çeşitli HSPC ve lösemi alt kümelerini seçmek için Şekil 2A,B'de önerilen gating stratejisini uygulayın.
  6. Her ilgi çeken popülasyon için, mitokondriyal ROS sinyalindeki farklılıkları değerlendirmek için TRPE kanalının (x-ekseni) ortanca floresan yoğunluğunu (MFI) analiz edin (Şekil 3A-C, sol paneller). Mitokondriyal ROS düzeyleri, bir dağılım çiziminde mitokondriyal ROS boyama ile belirli soy belirteçleri karşılaştırılarak tek hücre düzeyinde değerlendirilebilir.

Sonuçlar

Sunulan birden fazla sağlıklı ve MLL-AF9 ifade eden lösemi atası popülasyonlarının mitokondrisinde ROS'u analiz etmek için kullanılan bir yöntemdir. Şekil 1, 4 ana adımdan oluşan protokol iş akışının şematik görünümünü görüntüler: 1) Farelerden BM yalıtımı; 2) Bm hücrelerinin mitokondriyal ROS'u, özellikle de süperoksitleri tanıyan florojenik boyaile boyanması; 3) Çeşitli sağlıklı ve lösemi hematopoetik popülasyonları belineatetmek için yüzey mar...

Tartışmalar

ROS tespiti için geliştirilen florojenik boyalar sabit hücrelerde sıklıkla mikroskopi veya canlı hücrelerde akış sitometrisi22ile değerlendirilir. Mitokondriyal ROS florojenik boyalar kullanılarak BM hücrelerinde mitokondriyal ROS akış sitometrik değerlendirilmesi iki önemli avantajı vardır: 1) Canlı hücre analizi için uygun hızlı ve basit bir tekniktir ve 2) nadir ayırt ve analiz sağlar yüzey marker boyama kullanarak BM'de tek hücredüzeyinde popülasyonlar. Burada sunu...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Fox Chase Kanser Merkezi Yönetim Kurulu (DDM), Amerikan Hematoloji Bilginleri Derneği Ödülü (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) ve Savunma Bakanlığı (Ödül#: W81XWH-18-1-0472) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Heat inactivated FBSVWR Seradigm LIFE SCIENCE97068-085Media
Penicillin StreptomycinCorning30-002-CIMedia
PBSFisher ScientificBP399-20Buffer
15 mL conical tubeBD falcon352096Tissue Culture Supplies
50 mL conical tubeBD falcon352098Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainersFisher Scientific22-363-547Tissue Culture Supplies
RBC Lysis BufferFisher Scientific50-112-9751Tissue Culture Supplies
Menadione sodium BisulfiteSigma aldrichM5750Pro-oxidant
NACSigma aldrichA7250Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11Biolegend100310Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5eBioscience15-0041-81Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7eBioscience15-0081-81Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5Biolegend115510Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2Biolegend103210Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5Biolegend108410Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119Biolegend116210Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1Biolegend103420Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8Biolegend105825Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7Biolegend108120Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2Biolegend115909Antibody
CD34 FITC clone RAM34BD Bioscience553733Antibody
CD45.2 APC clone 104Biolegend1098313Antibody
MitoSOX RedThermoFisher ScientificM36008Dye
Mitotracker GreenThermoFisher ScientificM7514Dye
Live/dead Yellow DyeThermoFisher ScientificL34967Dye

Referanslar

  1. Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
  2. Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
  3. Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
  4. Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
  5. Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
  6. Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
  7. Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
  8. Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
  9. Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
  10. Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
  11. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  12. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  13. Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
  14. Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
  15. Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
  16. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
  17. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  18. Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  19. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  20. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  21. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
  22. Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
  23. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  24. Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
  25. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  26. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  27. Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
  28. Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmaSay 151AMLHSCsROSs peroksitlermitokondriak sitometresi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır