JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن وصف طريقه في الحل لتطبيق القص موحده لمستقبلات سطح الصفائح الدموية باستخدام مخروط لوحه الرؤية. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة علي نطاق أوسع لتطبيق القص علي أنواع الخلايا الأخرى وشظايا الخلايا ولا تحتاج إلى استهداف زوج محدد للمستقبلات.

Abstract

العديد من الخلايا البيولوجية/الانسجه الشعور الخواص الميكانيكية للبيئات المحلية عن طريق المستقبلات اليه ، والبروتينات التي يمكن ان تستجيب لقوي مثل الضغط أو الاضطرابات الميكانيكية. المستقبلات الميكانيكية الكشف عن المحفزات ونقل الإشارات عبر تنوع كبير من أليات. بعض الأدوار الأكثر شيوعا للمستقبلات الميكانيكية هي في الاستجابات العصبية ، مثل اللمس والم ، أو خلايا الشعر التي تعمل في التوازن والسمع. الميكانيكية هي أيضا مهمة لأنواع الخلايا التي تتعرض بانتظام للإجهاد القص مثل الخلايا البطانية ، التي الاوعيه الدموية الخط ، أو خلايا الدم التي تواجه القص في الدورة الدموية العادية. عدادات الرؤية هي الاجهزه التي تكتشف لزوجه السوائل. كما يمكن استخدام مقاييس الرؤية التناوبية لتطبيق قوه قص معروفه علي السوائل. وقد استغلت قدره هذه الاداات علي إدخال القص الموحد علي السوائل لدراسة العديد من السوائل البيولوجية بما في ذلك الدم والبلازما. كما يمكن استخدام القياس البصري لتطبيق القص علي الخلايا في المحلول ، ولاختبار تاثيرات القص علي أزواج محدده من الحروف والمستقبلات. هنا ، ونحن نستخدم مخروط لوحه الرؤية لاختبار اثار المستويات المحلية من الإجهاد القص علي الصفائح الدموية التعامل مع الأجسام المضادة ضد الصفائح الدموية الميكانيكية مجمع مستقبلات GPIb التاسع.

Introduction

المستقبلات اليه هي البروتينات التي تستجيب للمؤثرات الميكانيكية ، مثل الضغط أو الاضطراب الميكانيكي/التشوه. بالنسبة لبعض المستقبلات اليه ، فان استشعار هذه الاضطرابات الميكانيكية واضح لوظيفة أنواع الخلايا التي يتم التعبير عنها. تاخذ ، علي سبيل المثال ، مستقبلات تمتد في الخلايا العصبية مستقبلات البارونات. هذه القناات أيون الميكانيكية تنظيم ضغط الدم عن طريق استشعار الاوعيه الدموية "تمتد"1,2. في الاذن الداخلية ، وقناات أيون علي خلايا الشعر الكشف عن تشوات الميكانيكية الناجمة عن الموجات الصوتية3، والجلدية عتبه منخفضه الميكانيكية المستقبلات (ltmrs) تسهيل نقل المعلومات عن طريق اللمس4. وفي حالات أخرى ، توفر المستقبلات الميكانيكية معلومات هامه للخلية لإنشاء التصاق أو النمو. خلايا يستطيع تحسست الصلابة من بيئتهم محليه, ويمكن اعتمدت علي مقلص قوات عن طريق ال [اكتيتن] [سيتوكلتون] وتكامل ان يملي نمو أو [سبردينغ]5,6.

عند دراسة مستقبلات-يجند التفاعلات في النماذج القائمة علي الخلايا أو الانسجه ، توجد اختبارات المشتركة التي يمكن الإبلاغ بسرعة ودقه اثار تغيير درجه الحرارة ، والحموضة ، والتركيز ، والنغمات ، والقدرة علي الغشاء ، والعديد من المعلمات الأخرى والتي يمكن ان تختلف في الجسم المجري. ومع ذلك ، فان هذه المقايسات نفسها قد تكون قصيرة عندما يتعلق الأمر بالكشف عن مساهمه القوه الميكانيكية لتنشيط مستقبلات. ما إذا كانت الخلايا الاستشعار عن البيئة الدقيقة ، والكشف عن الموجات الصوتية ، أو الاستجابة لتمتد ، شيء واحد المستقبلات الميكانيكية المذكورة أعلاه مشتركه هو انهم يشاركون في التفاعلات حيث الligand ، مستقبلات ، أو كليهما ، ترتكز علي السطح. وغالبا ما تعكس المقايسات المطورة لاختبار اثار القوي الميكانيكية علي تفاعلات المستقبلات هذا النموذج. وتستخدم ميكروفلويديكس وتدفق الغرف لدراسة اثار تدفق القص علي الخلايا والمستقبلات7,8. وتتمتع هذه الأنواع من التجارب بميزه السماح بضبط معدلات القص عن طريق سرعات التدفق الثابتة. وتستخدم التقنيات الأخرى المسبارات الجزيئية الفلورية للكشف عن القوات التي تطبقها الخلايا علي الأسطح الغنية بالحروف ، مما ينتج عنه قراءات دقيقه لحجم وتوجات القوات المشاركة في التفاعل9و10.

بالاضافه إلى الميكانيكية التي تحدث حيث يتم ربط واحد أو كلا الشريكين إلى السطح ، والإجهاد القص قد تؤثر علي البروتينات والخلايا في الحل. وغالبا ما يلاحظ هذا في خلايا الدم/البروتينات التي هي باستمرار في الدورة الدموية ، ويمكن ان تظهر عن طريق تفعيل المستقبلات الميكانيكية التي هي عاده سطح الراسية11، أو من خلال التعرض للتسلسل الهدف الذي سيكون مسدود تحت شروط ثابته12. ومع ذلك ، اقل نسبيا تقنيات فحص اثار قوه القص علي الجزيئات في الحل. بعض النهج في الحل إدخال القص عن طريق الخلايا الفورتكينغ في تعليق السوائل بسرعات ومدد متفاوتة ، علي الرغم من ان هذه النهج قد لا تسمح بتحديد دقيق جدا من الإجهاد القص المتولدة. يقيس اللزوجة التناوب بتطبيق قوه قص محدده علي السوائل. هنا نقوم بوصف طريقه تطبيقية لتحديد تاثير معدلات القص الرقائقي محدده علي الخلايا أو شظايا الخلية في الحل.

واحد من البروتينات الأكثر تعبيرا علي سطح الصفائح الدموية هو بروتين سكري (GP) مجمع Ib-IX. GPIb-التاسع هو مستقبلات الاساسيه للبروتين البلازما فون Willebrand عامل (VWF). معا, وقد تم منذ فتره طويلة المعترف بها هذا الزوج ومستقبلات كاساس للاستجابة الصفائح الدموية للضغط القص13. في حاله تلف الاوعيه الدموية ، VWF يربط لكشف الكولاجين في مصفوفة البطانة الفرعية14، التالي تجنيد الصفائح الدموية إلى موقع الاصابه عن طريق التفاعل Vwf-GPIb-IX. VWF الاشتباك إلى موقعها ملزمه في الوحدة الفرعية GPIbα إذا GPIb-التاسع تحت الإجهاد القص الفسيولوجية يدفع تتكشف من المجال الميكانيكي القريب الغشاء (MSD) الذي بدوره ينشط GPIb-التاسع15. في دراسة حديثه, وقد أظهرنا ان الأجسام المضادة ضد GPIbα, مثل تلك التي ولدت في العديد من المرضي الصفيحات المناعية (آيب), هي أيضا قادره علي حمل الصفائح الدموية إشارات عبر MSD تتكشف تحت الضغط القص11. ومع ذلك ، علي عكس VWF ، والتي تسهل القص الناجمة عن GPIb-التاسع التنشيط عن طريق التعبئة المعقدة تحت الدورة الدموية العادية ، والأجسام المضادة التكافؤ قادره علي عبور الصفائح الدموية عبر GPIb-التاسع وتتكشف MSD في الدورة الدموية. وبهذه الطريقة ، يمكن تنشيط مستقبلات ميكانيكيه التي يتم تنشيطها عاده عن طريق التجميد السطحي تحت القص في الحل. وفي هذا التقرير ، سنبين كيف تمت الاستفادة من فحص القص الموحد القائم علي الرؤية للكشف عن اثار مستويات معينه من إجهاد القص علي تنشيط المستقبلات في الحل.

Protocol

تمت الموافقة علي جميع الطرق التي تستخدم الصفائح الدموية المستمدة من المتبرعين الموصوفة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعه أموري/الرعاية الصحية للأطفال في أتلانتا.

1. سحب الدم وعزل الصفائح الدموية

  1. رسم الدم البشري من المتبرعين الكبار صحية بالتراضي عن طريق بزل في يوم التجربة إلى 3.8 ٪ سيترات الصوديوم. أنبوب واحد 4.5 mL من الدم يكفي لإنتاج ما يكفي من البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) لظروف 20-25 في الجهات المانحة التي تهم الصفائح الدموية قريبه من 250 x 103 لكل μl.
    ملاحظه: تجنب رسم الدم عن طريق الابر مقياس ضيق (أصغر من 21 G).
  2. اعداد PRP عن طريق طرد في 22 درجه مئوية و 140 x g لمده 12 دقيقه مع الفرامل الطويلة. وهذا سوف يؤدي إلى طبقتين متميزتين ، مع خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي والضوء PRP الملونة في الجزء العلوي.
  3. عزل الطبقة العلوية والغائمة والصفراء من PRP عن طريق التعبئة الدقيقة من خلال طرف ماصه مقطع بزاوية 45 درجه والحصول علي عدد الصفائح الدموية عن طريق عدد الدم الكامل (CBC).
  4. إذا لزم الأمر ، وغسل الصفائح الدموية في أنابيب المالحة المخزنة (150 mM كلوريد الصوديوم ، أنابيب 20 ملم) في وجود بروستانانفي E1 (PGE1) وأعاده التعليق في العازلة تيرودي (134 mM كلوريد الصوديوم ، 0.34 mM Na2hpo4، 2.9 mm Kcl ، 1 مم mgcl2، 5 مم الجلوكوز ، 12 مم 3، 20 مم Hepes ، pH 7.35) مع الجلوكوز 5 ملم ، والا ، انتقل إلى الخطوة 1.5. تصف الخطوات التالية الغسل باختصار.
    1. ضبط حجم PRP إلى 10 مل مع أنابيب المالحة مخزنه وأضافه 0.6 μM PGE1.
    2. الطرد المركزي لمده 8 دقائق في 1,900 x g، ثم تجاهل ماده طافي والسماح بيليه الصفائح الدموية الجلوس في 400 μl من محلول تيرودي والجلوكوز لمده 5 دقائق.
    3. أعاده التعليق برفق بيليه الصفائح الدموية والحفاظ عليه دون عائق لمده 30 دقيقه.
  5. ضبط عدد الصفائح الدموية إلى ~ 250 × 103 الصفائح الدموية لكل μl مع البلازما الفقراء الصفيحات البشرية المجمعة (PPP) والحفاظ علي تعليق عند 22 درجه مئوية دون عائق أو تحت دوران لطيف.

2. ligand العلاج القص موحده

ملاحظه: يجب القيام بكل الخطوات في القسم 2 التي تتطلب التنضيد ببطء ، حتى لا لإدخال اي القص.

  1. أضف الأجسام المضادة أو الاربطه المطلوبة إلى PRP أو الصفائح الدموية المغسولة واخلطها برفق عن طريق التحريك للأعلى والأسفل أو التقليب بطرف ماصه. اتركه دون عائق في درجه حرارة الغرفة لمده 5-10 دقيقه. أضافه وحده تخزين مكافئه من PPP أو المخزن المؤقت تيرودي إلى عنصر تحكم سالب.
  2. قم بتشغيل لوحه العدادات المخروطية ، اضبط درجه حرارة اللوحة إلى 22 درجه مئوية واترك الوقت للسماح للوحه بالوصول إلى درجه الحرارة هذه.
  3. الماصة المعالجة بالبلازما أو الصفائح الدموية المغسولة علي لوحه العدادات المخروطية التي يتم التحكم في درجه حرارتها مباشره في مركز الصفيحة. تاكد من ان يتم إيداع جميع العينات بين المخروط ولوحه في نقطه الاتصال ، وليس علي الخارج من حافه المخروط.
  4. قص بسعر مناسب ومده مناسبه.
    1. حساب القص كما هو مبين من قبل دليل لزوجه ، أو كما هو مبين سابقا15،16.
    2. تحديد معدل القص من اللزوجة والإجهاد القص المطلوب عن طريق قانون نيوتن من اللزوجة. figure-protocol-3087; البلازما اللزوجة هو 1.5-1.6 مئوية الاتزان (cP)17. علي سبيل المثال ، نطاق القص العادي للتداول البشري هو 5-30 داين/سم2 وينبغي تطبيق القص علي مقياس الوقت دقيقه واحده الرقم.
  5. رفع مخروط الخروج من لوحه سلايلتي (~ 2 مم) بحيث تبقي العينة في اتصال مع كل لوحه ومخروط ، واستخدام هلام التحميل أو غيرها من طرف ماصه طويلة لجمع 5-10 μl من مركز حجم العينة.
  6. احتضان عينات منفصم مع علامات المطلوب لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. لعلامات فوسفاتيديلسيسيرين ، β-galactose ، و P-سيلكتين التعرض استخدام لاكتاديرين C2 المجال (LactC2) في 0.08 μM18، اريثرينا cristagalli يكتين (ecl) في 6.25 ميكروغرام/مل ، ومكافحه-P-سيلكتين الأجسام المضادة (20 ميكروغرام/مل) ، علي التوالي.
  7. إصلاح العينات في 2 ٪ بارافورمالدهيد لمده 20 دقيقه في RT قبل التخفيف أو التخزين البارد ، والمضي قدما إلى الخطوة 3.1 أو تخزين عينات في 4 درجه مئوية لمده لا تزيد عن 12 ساعة.

3. الكشف عن علامات السطح والربط عبر التدفق الخلوي

  1. تحليل العينة عن طريق التدفق الخلوي ، وجمع ما لا يقل عن 20,000 الاحداث لكل شرط.
  2. قوه اشاره الكمية من علامات الفلورسنت باستخدام قيمه الارتفاع لكثافة كل فلوكوفيري ، أو متوسطه الكثافة الهندسية الفلورية (مؤسسه مونتانيار).
  3. إذا تهدف إلى الكشف عن الصفائح الدموية المتقاطعة التالية العلاج القص ، وتحليل العينة علي التصوير-قادره علي تدفق المضخم والربط بالكميات المتداخلة حسب المنطقة ونسبه الجانب المعلمات.
    1. ارسم رسما بيانيا للمنطقة و/أو نسبه العرض إلى الارتفاع.
    2. استخدام السيطرة السلبية مع الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسني) أو السيارة لرسم بوابه باستثناء معظم الاحداث الدائرية بشكل كامل (وعاده ما يتم رسم هذه البوابة في نسبه العرض إلى الارتفاع ~ 0.819،20) وقيمه النسبة المئوية للاحداث داخل هذه البوابة. ومن المرجح ان تكون الاحداث ذات النسبة المنخفضة من الارتفاع أكثر ارتباطا.

النتائج

يوضح الشكل 1 كيف يمكن للنموذج المشغل لتنشيط GPIb-IX ، الذي تم إدخاله في البداية لشرح تنشيط المستقبلات التي تعتمد علي القص عند الارتكاز علي جدار الوعاء ، ان يدعم أيضا تنشيط الصفائح الدموية التي يتم ربطها بواسطة الاربطه متعددة التكافؤ. ويبين الشكل 2 عمليات القرا?...

Discussion

يسمح البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة باجراء تقييم سريع ومتعدد الاستعمالات لتاثير القص الصفي علي مستقبلات الصفائح الدموية وسطح الخلية. وتبرز النتائج التمثيلية المحددة المقدمة هنا كيف يمكن ان تتاثر اثار اللزوجة الثنائية أو الثنائية التكافؤ بتدفق القص. بالاضافه إلى هذا التطبيق ، والفح?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم العمل المتعلق بهذه الدراسة جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة والقلب والرئة ومعهد الدم منح HL082808 ، HL123984 (ار ال) ، و F31HL134241 (M.E.Q.). التمويل المقدم أيضا من المعهد الوطني للصحة القومية للعلوم الطبية العامة منحه T32GM008367 (M.E.Q.) ؛ وصناديق المنح التجريبية من الرعاية الصحية للأطفال من أتلانتا وأموري جامعه تدفق الأطفال الخلوية الاساسيه. ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور هانز ديميون لمشاركتهم الأجسام المضادة 6B4 ، ومركز بحوث الأطفال الخاص بالطفل الذي يقوم بالتدفق الخلوي الأساسي للدعم التقني.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
APC anti-human CD62P (P-Selectin)BioLegend304910
Brookfield Cap 2000+ ViscometerBrookfield-
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)Vector LabsFL-1141
Pooled Normal Human PlasmaPrecision BiologicCCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)BD369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" NeedleBD367287

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. . Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved