JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Koni plaka Viskozimetre kullanılarak trombosit yüzey reseptörlerine Tekdüzen kesme uygulamak için bir çözüm içi yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, diğer hücre türlerine ve hücre parçalara kesme uygulamak için daha geniş ölçüde kullanılabilir ve belirli bir ligand-reseptör çifti hedeflemek gerekmez.

Özet

Pek çok biyolojik hücre/doku, mekanik özellikleri, basınç veya mekanik pertürasyonlar gibi kuvvetlere yanıt verebilecek proteinler yoluyla yerel ortamlarının mekanik özelliklerini ifade ederler. Makinoreceptors onların uyaranlara algılar ve mekanizmaları büyük bir çeşitlilik yoluyla sinyalleri iletir. Makinoreceptors için en yaygın rollerden bazıları, dokunma ve ağrı gibi nöronal tepkiler, ya da denge ve işitme fonksiyonu saç hücreleri vardır. Mechanosensation aynı zamanda normal sirkülasyonda kesme deneyimi hangi hat kan damarları, ya da kan hücreleri gibi endotel hücreleri olarak kesme stresine düzenli olarak maruz hücre türleri için önemlidir. Viskozimetre, sıvıların viskozitesini algılayan cihazlardır. Rotasyonel viskozimetreler, sıvılara bilinen bir kesme kuvveti uygulamak için de kullanılabilir. Bu enstrümanlar sıvılara üniforma kesme tanıtmak için yeteneği kan ve plazma dahil olmak üzere birçok biyolojik sıvılar çalışmak için sömürülüyor. Viskozimetre Ayrıca bir çözelti hücrelerine kesme uygulamak ve belirli ligand-reseptör çiftleri üzerinde kesme etkilerini sınamak için kullanılabilir. Burada, trombosit mechanoduyusal reseptör kompleksi GPIb-IX karşı antikorlar ile tedavi trombositler üzerinde kesme stres endojen düzeylerinin etkilerini sınamak için koni-plaka viskozimetresi kullanıyoruz.

Giriş

Mekanik uyarıcı, basınç veya mekanik Persleme/deformasyon gibi teknik uyaranlara yanıt veren proteinlerdir. Bazı mekaniği için, bu mekanik perturbations algılama onlar ifade edilir hücre türlerinin işlevine açık. Örneğin, baroreseptör nöronların streç reseptörleri alın; Bu mechanosensitive iyon kanalları vasküler algılayarak kan basıncını düzenleyen "Stretch"1,2. İç kulak, saç hücrelerinde iyon kanalları ses dalgaları3neden mekanik deformasyonlar algılar ve kutanöz düşük eşik mekanoreseptörler (ltmrs) dokunsal bilgi iletimi kolaylaştırır4. Diğer durumlarda, makinoreceptors yapışma veya büyüme kurulması için hücreye önemli bilgiler sağlar. Hücreler kendi yerel ortamının sertlik hissi ve büyüme veya yayılma dikte etmek için aktin siterit ve integrinler aracılığıyla kontril güçler güvenebilirsiniz5,6.

Hücre veya doku tabanlı modellerde reseptör-ligand etkileşimleri okurken, sıcaklık, pH, ligand konsantrasyonu, tonisite, membran potansiyeli ve diğer birçok parametre değiştirme etkilerini hızlı ve doğru bir şekilde raporlayabilen ortak özellikler var Hangi içinde vivo değişebilir. Bununla birlikte, mekanik gücün reseptör aktivasyonuna katkısı tespit etmek için söz konusu olduğunda bu aynı destek kısa düşebilir. Hücrelerin mikro ortamlarını algılayıp, ses dalgaları algılanmasını veya gerdirmek için yanıt verdiğini, yukarıda bahsedilen mekanik iletkenlerin ortak olduğu bir şey, ligand, reseptör veya her iki kişinin de bağlantılı olduğu etkileşimlere katıldıkları Yüzey. Mekanik kuvvetlerin reseptör etkileşimlerinde etkilerini test etmek için geliştirilen testler genellikle bu paradigmasını yansıtır. Microfluidics ve akış odaları hücreleri ve reseptörleri üzerinde kesme akışının etkilerini incelemek için kullanılan7,8. Bu tür deneyler, kurulan akış hızları aracılığıyla kesme oranlarının ince ayarlarına izin verme avantajına sahiptir. Diğer teknikler, ligand zengini yüzeylerdeki hücreler tarafından uygulanan güçleri algılamak için floresan moleküler problar kullanırlar, etkileşiminde yer alan güçlerin büyüklüğü ve oryantasyonlarını doğru bir şekilde okuyabilmektedir9,10.

Bir veya her iki ortağın bir yüzeye sabitlendiği mekanosensation ek olarak, kesme stres çözeltisindeki proteinleri ve hücreleri etkileyebilir. Bu genellikle sürekli sirkülasyonda olan kan hücrelerinde/proteinlerde gözlenen, ve normalde yüzey-bağlantılı olan mekanoreseptörler aktivasyonu ile tezahür edebilir11, veya altında okcluded olacak hedef sıraları maruz kalma yoluyla statik koşullar12. Ancak, nispeten daha az teknikler çözelti parçacıkları üzerinde kesme kuvveti etkilerini tahlil. Bazı çözelti yaklaşımlar değişen hızları ve süreleri ile sıvı süspansiyonu hücrelerde vortekslenir yoluyla kesme tanıtmak, bu yaklaşımlar oluşturulan kesme stres çok kesin bir belirlenmesi izin vermeyebilir rağmen. Rotasyonel viskoziteler, sıvılara belirli bir kesme kuvveti uygulayarak viskozitesi ölçer. Burada, belirli laminar kesme oranlarının hücrelerde veya hücre parçacıklarının çözümdeki etkisini belirlemek için uygulanan bir yöntem açıklanmaktadır.

Trombosit yüzeyinde en çok ifade edilen proteinlerden biri de glikoprotein (GP) IB-IX kompleksidir. GPIB-IX, plazma proteininin Von Willebrand factor (VWF) için birincil reseptörüdür. Birlikte, bu reseptör-ligand çifti uzun kesme stres13trombosit tepkisi temeli olarak tanınmıştır. Vasküler hasar durumunda, VWF alt endotel matriks14içinde maruz kollajen bağlar, böylece VWF-GPIB-IX etkileşimi yoluyla yaralanma siteye trombosit işe. VWF, gpibα altbirim 'teki bağlayıcı sitesine GPIB-IX fizyolojik kesme stres altında ise, bir membran-proksimal mechanosensory alan (MSD) açılırsa, bu da GPIB-IX15' i aktive eder. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, birçok Bağışıklık trombositopeni (ıTP) hastalarında oluşturulan gibi, GPIbα karşı antikorların, aynı zamanda kayma stres altında unfolding MSD üzerinden trombosit sinyalizasyon inducing yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir11. Ancak, VWF aksine, hangi normal dolaşım altında kompleks immobilizing tarafından kesme kaynaklı GPIB-IX aktivasyon kolaylaştırır, iki bivalent antikorlar GPIB-IX üzerinden trombosit Crosslink edebiliyoruz ve dolaşım MSD açın. Bu şekilde, normalde kesme altında yüzey immobilizasyonu ile aktive olan bir mekaniği solüsyonda aktive edilebilir. Bu raporda, biz bir Viskozimetre tabanlı üniforma kesme tahlil çözeltisi reseptör aktivasyonu üzerinde kesme stres belirli düzeylerinin etkilerini algılamak için nasıl yararlanıldı gösterecektir.

Protokol

Burada açıklanan donör türevi insan trombositleri kullanan tüm yöntemler, Emory University/Atlanta çocuk sağlık hizmetleri kurumsal Inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. kan çekme ve trombosit Izolasyonu

  1. % 3,8 Trisodyum sitrat içine deney gününde damara yoluyla sağlıklı yetişkin bağışçılar rızası olan yetişkinlere insan kanı çizin. Bir 4,5 mL tüp kan, trombosit sayısı 250 x 103 Ile μL başına yakın olan bağışçılardan 20-25 için yeterli trombosit zengin plazma (PRP) vermek için yeterlidir.
    Not: dar ölçer iğneleri (21 G 'den küçük) ile kan çizmeyi önleyin.
  2. 22 °C ' de santrifüjleme ile PRP hazırlayın ve uzun fren ile 12 dakika 140 x g . Bu iki farklı katmanla sonuçlanır, altta kırmızı kan hücreleri ve üstte açık renkli PRP ile.
  3. 45 ° açıda kesilmiş bir pipet ucu ile dikkatli pipetleme yoluyla PRP 'nin üst, bulutlu, sarı tabakasını izole edin ve tam bir kan sayımı (CBC) yoluyla trombosit sayısını elde et.
  4. Gerekirse, boru-tamponlu tuz (150 mM NaCl, 20 mM borular) içinde Prostaglandin E1 (PGE1) ve Tyrode tampon (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mm KCL, 1 mM MgCl2,5mm glikoz, 12 mm NaHCO varlığında yıkama trombosit 3, 20 mm HEPES, pH 7,35) 5 mm glikoz, aksi takdirde, adım 1,5 devam edin. Aşağıdaki adımlarda kısa yıkama açıklanmaktadır.
    1. Boru tamponlu tuz ile 10 mL PRP hacmi ayarlayın ve 0,6 μM PGE1 ekleyin.
    2. 1.900 x g'de 8 dakika santrifüjle, sonra süpernatant atın ve trombosit Pelet 5 dk için tyrode ve glikoz çözeltisi 400 μL oturmak izin.
    3. Trombosit Pelet yavaşça pelletini ve 30 dakika boyunca bozulmamış tutmak.
  5. Trombosit sayısını ~ 250 x 103 trombositli, havuz altındaki insan trombosit-zayıf plazma (PPP) ile ayarlayın ve süspansiyonu 22 °c ' de bozulmamış veya nazik rotasyona karşı koruyun.

2. ligand ve uniform kesme tedavisi

Not: pipetleme gerektiren Bölüm 2 ' deki tüm adımlar, herhangi bir kesme sunmak için değil, yavaşça yapılmalıdır.

  1. İstenen antikor veya ligand PRP veya yıkanmış trombositler ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme veya bir pipet ucu ile karıştırma ile karıştırın. 5-10 dk için oda sıcaklığında rahat bırakın. negatif bir denetime PPP veya Tyrode arabelleğinin eşdeğer bir hacmi ekleyin.
  2. Koni-plaka viskozimetresi açın, plaka sıcaklığını 22 °C ' ye ayarlayın ve plakanın bu sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için zamana izin verin.
  3. Tedavi edilen PRP veya yıkanan trombositleri, sıcaklık kontrollü koni-plaka viskoziteler üzerine doğrudan plakanın ortasına pipet. Tüm numunenin, konenin kenarının dışında değil, temas noktasında koni ve plaka arasında yatırılmasını sağlayın.
  4. Uygun bir oran ve süre içinde kesme.
    1. Viskozimetre Kılavuzu tarafından belirtildiği gibi veya daha önce15,16olarak gösterilen kesme hesaplayın.
    2. Newton 'un viskozite Kanunu ile Viskozitenin kesme hızını ve istenilen kesme stresini belirleyin; figure-protocol-3183; plazma viskozitesi 1,5-1.6 centipoise (cP)17' dir. Örneğin, insan dolaşımı için normal bir kesme aralığı 5-30 dyn/cm2 ve kesme tek basamaklı dakika zaman ölçeğinde uygulanmalıdır.
  5. Numunenin hem plaka hem de koni ile temas halinde kalması ve numune hacminin merkezinden 5-10 μL toplamak için bir jel yükleme veya diğer uzun pipet ucu kullanmak için, plakanın yerine (~ 2 mm) kadar koni kaldırın.
  6. Oda sıcaklığında 20 dakika için istenilen işaretçileri ile yamultulmuş numuneler inküye. Fosfatidilserin, β-galaktoz ve P-selectin pozlama belirteçleri için 0,08 μM18' de Lactadherin C2 etki alanı (LactC2), 6,25 μg/ml 'de Erythrina cristagalli Lekin (ECL) ve anti-P-selectin antikor (20 μg/ml) kullanılır.
  7. Seyreltme veya soğuk depodan önce RT 'de 20 dakika boyunca% 2 civarında formaldehite numunelerini düzeltin ve 3,1 adıma geçin veya 12 h 'den fazla olmayan 4 °c ' de örnekleri saklayın.

3. yüzey işaretçileri ve akış cytometri üzerinden çapraz tespiti

  1. Her koşul için en az 20.000 olaylar toplama, akış sitometri yoluyla örnek analiz edin.
  2. Her fluorophore yoğunluğu için yükseklik değeri veya geometrik ortalama floresan yoğunluğu (MFı) kullanarak floresan işaretçilerinin sinyal gücünü quantitate.
  3. Kesme tedavisini takiben trombosit çapraz algılamasını hedefliyorsanız, örnek bir görüntüleme özellikli akış sitometresi analiz ve bölge ve en boy oranı parametreleri ile çapraz bağlantı quantitate.
    1. Alan ve/veya en boy oranı bir histogram çizin.
    2. Sığır serum albümin (BSA) veya araç ile negatif bir kontrol kullanın (Bu kapı genellikle bir en boy oranı çizilir ~ 0,819,20) ve bu kapının içindeki olayların yüzdesini quantitate çoğu tam dairesel olaylar hariç bir kapı çizmek için. Daha düşük bir en boy oranı olan olaylar daha fazla çapraz bağlanması muhtemeldir.

Sonuçlar

Şekil 1 nasıl GPIB-IX aktivasyonunun tetik modelinin, başlangıçta damar duvarına bağlı olarak kesme bağımlı reseptör aktivasyonunu açıklamak için nasıl tanıtıldığı özetlenmiştir, aynı zamanda multivalent ligand tarafından çapraz bağlı trombositlerin aktivasyonunu destekleyebilir. Şekil 2 , GPIB-IX (6b4 ve 11a8) ' in N-terminal alanını hedefleyen iki antikor tarafından tedavi edilen insan trombosit aktivasyonunun okumasını ve yam...

Tartışmalar

Bu yazıda açıklanan protokol, laminar kesmesinin trombosit ve hücre yüzeyi reseptörlerine etkisini hızlı ve çok yönlü olarak değerlendirmenizi sağlar. Burada sunulan spesifik temsili sonuçlar, multimerik veya iki bivalent ligin etkilerini kesme akışından nasıl etkileneceğini alt çizgi olarak sundu. Bu uygulamaya ek olarak, bir üniforma kesme tahlil kesme bağımlı etkileri gözlem geniş uygulamalar vardır. Bilinen bir ligand reseptör çifti yokluğunda, bir Tekdüzen kesme tahlil aynı zamanda h?...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışmada ilgili çalışmalar kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH) Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü hibe HL082808, HL123984 (LID) ve F31HL134241 (M.E.Q.) tarafından desteklenmektedir. Fon da NıH Ulusal Enstitüsü Genel Tıp Bilimleri Grant T32GM008367 (M.E.Q.) tarafından sağlanan; ve Atlanta çocuk sağlık ve Emory Üniversitesi Pediatrik akış sitometri çekirdek pilot hibe fonları. Yazarlar, 6B4 antikor paylaşımı için Dr. Hans Deckmyn teşekkür etmek istiyorum ve teknik destek için Emory çocuk Pediatrik araştırma merkezi akış sitometri çekirdek.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
APC anti-human CD62P (P-Selectin)BioLegend304910
Brookfield Cap 2000+ ViscometerBrookfield-
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)Vector LabsFL-1141
Pooled Normal Human PlasmaPrecision BiologicCCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)BD369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" NeedleBD367287

Referanslar

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. . Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 148makasmechanosensationmechanoreceptorstrombositviskozitelikBiyofizikak sitometrihemostaz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır