מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח

Summary

אנו מתארים שיטה בפתרון כדי להחיל להטות אחיד כדי קולטני משטח טסיות באמצעות קונוס-צלחת ויסבנסה. ניתן להשתמש בשיטה זו גם באופן כללי יותר כדי להחיל הטיה על סוגי תאים אחרים ושברי תאים, ואין צורך לייעד זוג מסוים של ליגולי-קולטן.

Abstract

תאים ביולוגיים רבים לחוש את התכונות המכאניות של הסביבה המקומית שלהם באמצעות מכנינים, חלבונים שיכולים להגיב לכוחות כמו לחץ או רטבאליות מכני. מכניקנים מזהים את הגירויים שלהם ומעבירים אותות באמצעות מגוון גדול של מנגנונים. חלק מן התפקידים השכיחים ביותר עבור מכניטורים הם בתגובות נוירואליות, כמו מגע וכאב, או תאי שיער הפועלים בשיווי משקל ושמיעה. המכונה גם חשובה עבור סוגי תאים אשר נחשפים באופן קבוע למתח הטיה כגון תאים אנדותל, אשר קו כלי דם, או תאי דם אשר חווים את ההטיה במחזור הרגיל. ויסברוטרס הם מכשירים המזהים את צמיגות הנוזלים. בנוסף, ניתן להשתמש בגומדי הסיבוב להחלת כוח הטיה ידוע על נוזלים. היכולת של מכשירים אלה כדי להחדיר הטיה אחיד לנוזלים נוצל ללמוד נוזלים ביולוגיים רבים, כולל דם פלזמה. בנוסף, ניתן להשתמש ב-ויסבנסה להחלת הטיה על התאים בפתרון, ולבדיקת השפעות ההטיה בזוגות מסוימים של ליגטיים ולקולטן. כאן, אנו מנצלים חרוט-צלחת ומנסה לבחון את ההשפעות של רמות אנדודוגני של לחץ הטיה על טסיות שטופלו עם נוגדנים נגד טסיות הדם מכונאי קולטן המכונה GPIb-IX.

Introduction

מכניטורים הם חלבונים המגיבים לגירויים מכניים, כגון לחץ או עיוות מכני/דפורמציה. עבור חלק מהמכבשים, חישת הרטבאליות המכני הללו מפורשת לתפקוד סוגי התאים בהם הם מבוטאים. לקחת, למשל, קולטני למתוח ב baroreceptor נוירונים; אלה תעלות יון מכניתיים רגישות להסדיר לחץ דם על ידי חישת כלי דם "מתיחה"^1,2. באוזן הפנימית, ערוצי יון על תאי השיער לזהות דפורמציות מכניות הנגרמת על ידי גלי קול³, ו מכני הסף נמוך המכונה מכונות (ltmrs) להקל על העברת מידע מישוש⁴. במקרים אחרים מספקים מכניקנים מידע חשוב לתא להקמת הדבקה או התפתחות. תאים יכולים לחוש קשיחות של הסביבה המקומית שלהם, והוא יכול להסתמך על כוחות הקונאקטאליה דרך שלד ציטוטין ואינטגרציה להכתיב צמיחה או התפשטות^5,6.

כאשר לומדים קולטן-ליגונים ואינטראקציות בתא או רקמות מבוססי מודלים, שכיחות משותף קיים אשר יכול במהירות ובדייקנות לדווח את ההשפעות של שינוי טמפרטורה, pH, ליג, ריכוז, טונגניות, פוטנציאל הממברנה, ופרמטרים רבים אחרים שיכול להשתנות בvivo. עם זאת, אלה מספר שאומר עלול ליפול קצר כשמדובר לזהות את התרומה של כוח מכני כדי הפעלת הקולטן. אם התאים מחישה את הסביבה המיקרוקומבית שלהם, מזהה גלי קול או מגיבים למתיחה, דבר אחד שמשותף למכונה הזאת הוא שהם משתתפים באינטראקציות שבהן הליקטור, הקולטן או שניהם, מעוגנים ל שטח. Assays שפותחה כדי לבדוק את ההשפעות של כוחות מכניים על אינטראקציות הקולטן לעתים קרובות משקפים פרדיגמה זו. מיקרופלואידיקה ותאי הזרימה משמשים לחקר ההשפעות של הטיית זרימה על תאים וקולטנים^7,8. סוגים אלה של ניסויים יש את היתרון של המאפשר כוונון עדין של שיעורי הטיה באמצעות מהירויות זרימה הוקמה. טכניקות אחרות להעסיק בדיקה מולקולרית פלורסנט כדי לזהות כוחות החלים על ידי תאים על משטחים ligand-עשיר, מניב בדיקה מדויקת של סדר הגודל והכיוונים של כוחות המעורבים באינטראקציה^9,10.

בנוסף לתחושה המכונה היכן אחד או שניהם מעוגנים על פני השטח, הטיה לחץ עשוי להשפיע על חלבונים ותאים בתמיסה. זה נצפה לעתים קרובות בתאי הדם/חלבונים אשר כל הזמן במחזור, ועשוי להתבטא באמצעות הפעלה של מכונות מכונות כי הם בדרך כלל מעוגן משטח¹¹, או באמצעות חשיפה של רצפי היעד אשר יהיה לחסימה תחת תנאים סטטיים¹². עם זאת, טכניקות מעטות יחסית מאפשרות את ההשפעות של כוח ההטיה על חלקיקים בתמיסה. כמה גישות ב-פתרון להציג את ההטיה באמצעות תאים vortexing בהשעיה נוזל עם מהירויות שונות ומשכים, למרות גישות אלה לא יאפשר קביעה מדויקת מאוד של לחץ ההטיה שנוצר. מדידת צמיגות ברוטציה מדידה על ידי החלת כוח מסוים בהטיה לנוזלים. כאן אנו מתארים שיטה מיושמת לקביעת ההשפעה של שיעורי הטיה ספציפיים בתאים או שברי תאים בתמיסה.

אחד החלבונים המבוזרים ביותר על משטח הטסיות הוא מתחם גליקופרוטאין (GP) ליברות-IX. GPIb-IX הוא הקולטן העיקרי עבור חלבון הפלזמה פון Willebrand פקטור (VWF). יחד, זה קולטן-ליגניים וזוג כבר מוכר כבסיס של תגובת טסיות כדי להטות את הלחץ¹³. במקרה של נזק כלי דם, VWF נקשר קולגן חשוף במטריקס sub-אנדותל¹⁴, ובכך לגייס טסיות לאתר של פציעה באמצעות אינטראקציה Vwf-GPIb-IX. VWF מחויבות לאתר הכריכה שלה ביחידת המשנה GPIbα אם GPIb-IX תחת הלחץ הפיזיולוגי הטיה גורם התגלגלות של התחום המכונה המאובחושי הממברנה (MSD) אשר בתורו מפעיל GPIb-IX¹⁵. במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי נוגדנים נגד GPIbα, כמו אלה שנוצרו תרומבוציטופניה חיסונית רבים (ITP) חולים, הם גם מסוגלים לגרימת איתות טסיות באמצעות MSD התגלגלות תחת לחץ הטיה¹¹. עם זאת, בניגוד VWF, אשר מקלה על גזירה המושרה GPIb-IX הפעלה על ידי ששתק את הקומפלקס תחת מחזור רגיל, הנוגדנים הדו בעלי היכולת להצליב טסיות באמצעות GPIb-IX ולהתפתח MSD במחזור הדם. בדרך זו, מתקן המופעל בדרך כלל על ידי הטיית פני השטח תחת הטיה ניתן להפעיל בתמיסה. בדוח הנוכחי, ניתן להדגים כיצד מבוסס על מדים מבוססי ומוח להטות את שיטת העבודה היה ממונפת כדי לזהות את ההשפעות של רמות ספציפיות של מתח הטיה על הפעלת הקולטן בפתרון.

Protocol

כל השיטות באמצעות טסיות האדם הנגזר התורם המתואר בזאת אושרו על ידי הלוח סקירה מוסדית של אוניברסיטת אמורי/הבריאות של הילדים של אטלנטה.

1. בידוד דם וטסיות

1. לצייר דם אנושי מתוך ההסכמה תורמים מבוגרים בריאים באמצעות הניקוב ביום הניסוי לתוך 3.8% trisodium ציטראט. אחד 4.5 mL של דם הוא מספיק כדי להניב מספיק פלזמה עשיר טסיות (PRP) עבור 20-25 תנאים בתורמים אשר ספירות טסיות קרובים ל250 x 10³ לכל μl.
   הערה: הימנע מציור דם באמצעות מחטי מד צר (קטן מ -21 G).
2. הכן PRP באמצעות צנטריפוגה ב 22 ° צ' ו 140 x g עבור 12 דקות עם בלם ארוך. זה יגרום שתי שכבות נפרדות, עם כדוריות הדם האדומות בתחתית האור PRP בצבע בראש.
3. לבודד את העליון, מעונן, צהוב שכבה של PRP באמצעות ליטוף בזהירות דרך הפיפטה טיפ לחתוך בזווית 45 ° ולקבל את ספירת טסיות באמצעות ספירת דם מלאה (ספירת הדם).
4. במידת הצורך, לשטוף את טסיות בתוך מלוחים צינורות (150 מ"מ, 20 מ"מ צינורות) בנוכחות של פרוסטגלנדין E1 (PGE1) ו להשעות מחדש במאגר של tyrode (134 mm הנאקל, 0.34 mm Na₂hpo₄, 2.9 mm kcl, 1 מ"מ mgcl₂, 5 מ"מ גלוקוז, 12 mm נחקו ₃, 20 מ"מ Hepes, pH 7.35) עם גלוקוז 5 מ"מ, אחרת, המשך לשלב 1.5. הצעדים הבאים מתארים את הכביסה בקצרה.
   1. כוונן את נפח PRP ל 10 mL עם מלוחים צינורות באגירה ולהוסיף 0.6 μM PGE1.
   2. צנטריפוגה עבור 8 דקות ב 1,900 x g, ואז למחוק supernatant ולתת את הגלולה הטסיות לשבת 400 Μl של tyrode של התמיסה ואת הגלוקוז עבור 5 דקות.
   3. ושמור אותו ללא הפרעה. במשך 30 דקות
5. להתאים את ספירת טסיות כדי ~ 250 x 10³ טסיות לכל μl עם ממאגר האדם המסכן טסיות-פלזמה (PPP) ולשמור על ההשעיה ב 22 ° c מופרעת או בסיבוב עדין.

2. ליגניים ומדים להטות את הטיפול

הערה: כל השלבים בסעיף 2 הדורשים ליטוף צריך להתבצע באיטיות, כדי לא להציג כל הטיה.

1. הוסף את הנוגדן הרצוי או ליגנד כדי prp או שטף טסיות ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה או זע עם טיפ פיפטה. השאירו אותו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר עבור 5-10 דקות. הוסף אמצעי אחסון שווה ערך של המאגר של PPP או של Tyrode לפקד שלילי.
2. הפעל את לוחית האצטרובל, הגדר את טמפרטורת הצלחת ל -22 ° c ואפשר לזמן לתת לצלחת להגיע לטמפרטורה זו.
3. פיפטה התייחס PRP או שטף טסיות על מבוקרת טמפרטורה חרוט הלוחית הזיקוק ישירות במרכז הצלחת. ודא כי כל המדגם מופקד בין החרוט והצלחת בנקודת המגע, ולא על החלק החיצוני של שפת החרוט.
4. הטיה בקצב ובמשך המתאים.
   1. חשב את ההטיה כפי שמצוין במדריך ההדרכה, או כפי שהוצג בעבר^15,16.
   2. קביעת קצב ההטיה מצמיגות ומהמתח הרצוי של ההטיה באמצעות חוק הצמיגות של ניוטון; ; צמיגות של פלזמה הוא 1.5-1.6 מצלסיוס (cP)¹⁷. לדוגמה, טווח הטיה רגיל עבור זרימת האדם הוא 5-30 דינמיקה/cm² והטיה צריך להיות מוחל על הזמן ספרה אחת דקה.
5. להרים את החרוט של הצלחת slighlty (~ 2 מ"מ) כך את המדגם נשאר במגע עם הצלחת וגם חרוט, ולהשתמש ג'ל טעינת או מיתר הצינורות הארוך כדי לאסוף 5-10 μL מהמרכז של נפח המדגם.
6. מודחלת את דגימות המאכלת עם הסמנים הרצויים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. עבור סמנים של זרחן, β-גלקטוז, ו P-selectin להשתמש בחשיפה לקטחסיד בתחום C2 (LactC2) ב 0.08 μM¹⁸, אריקה קריסטאלי לקטין (ecl) ב 6.25 μg/ml, ו-Anti-P-בלטין נוגדן (20 μg/ml), בהתאמה.
7. לתקן דגימות 2% פאראפורמלדהיד עבור 20 דקות בשעה RT לפני דילול או אחסון קר, ולהמשיך לשלב 3.1 או לאחסן דגימות ב 4 ° c עבור לא יותר מ 12 h.

3. זיהוי סמנים פני השטח והקישור דרך הזרימה cy, לנסות

1. לנתח את המדגם באמצעות הזרמת cy, איסוף לפחות 20,000 אירועים עבור כל תנאי.
2. עוצמת האות של קוונטייט של סמני הפלורסנט באמצעות ערך הגובה של העוצמה של כל fluorophore או את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית הגיאומטרית (MFI).
3. אם במטרה לזהות מרובי טסיות הקישור בעקבות הטיה הטיפול, לנתח את המדגם על הדמיה-מסוגל זרימה cytometer ו כימות הקשר על ידי אזור הפרמטרים יחס הגובה.
   1. מתווה היסטוגרמה של אזור ו/או יחס גובה-רוחב.
   2. השתמש בפקד שלילי עם אלבומין סרום בקר (bsa) או הרכב כדי לצייר שער ללא האירועים מעגלי באופן מלא (שער זה מצויר בדרך כלל ביחס גובה-רוחב ~ 0.8^19,20) ו ככמת את אחוז האירועים בתוך השער הזה. אירועים בעלי יחס רוחב-גובה נמוך יותר נוטים יותר להיות מקושרים.

תוצאות

איור 1 מתאר כיצד מודל ההדק של הפעלת GPIb-IX, בתחילה הציג כדי להסביר הפעלת הקולטן התלוי הטיה כאשר מעוגן לקיר כלי, יכול גם לתמוך הפעלה של טסיות המקושרות על ידי ליגנטי רב. איור 2 מציג את הקריאות של הפעלת טסיות הדם האנושית שטופלו על ידי שני נוגדנים מיקוד התחום N-מסוף ש...

Discussion

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר הערכה מהירה ומגוונת של ההשפעה של הטיית למינאר על טסיות דם וקולטני משטח התא. תוצאות הנציג הספציפיות המוצגות כאן מדגישים כיצד ההשפעות של מולטימאריק או ביונטי ליגנדס יכולות להיות מושפעות מזרימת הטיה. בנוסף ליישום זה, שיטת גזירה אחידה כוללת יישומים רחבים בהת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin)	BioLegend	304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer	Brookfield	-
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)	Vector Labs	FL-1141
Pooled Normal Human Plasma	Precision Biologic	CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)	BD	369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle	BD	367287