원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석

요약

우리는 원뿔 판 점도를 사용 하 여 혈소판 표면 수용 체에 균일 한 전단을 적용 하는 인 솔루션 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 다른 세포 유형 및 세포 단편에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍을 표적으로 할 필요가 없는 더 광범위 하 게 사용 될 수 있다.

초록

많은 생물학 세포/조직은 기계 수용 체를 통해 그들의 현지 환경의 기계적인 속성을, 압력 또는 기계적인 섭 동 같은 힘에 반응할 수 있는 단백질을 감지 합니다. 기계 수용 체는 자극을 감지 하 고 다양 한 메커니즘을 통해 신호를 전송 합니다. 기계 수용 체에 대 한 가장 일반적인 역할 중 일부는 신경 반응에, 터치와 통증 같은, 또는 균형 및 청각에서 기능 하는 머리 세포. 기계 감각은 또한 정기적으로 혈관 내 피 세포와 같은 전단 응력에 노출 되는 세포 종류에 대 한 중요 한, 어떤 라인 혈액 혈관, 또는 정상적인 순환에 전단을 경험 하는 혈액 세포. 점도 계는 유체의 점도를 감지 하는 장치입니다. 회전 점도 계는 또한 유체에 공지 된 전단 력을 적용 하기 위해 사용 될 수 있다. 유체에 균일 한 전단을 소개 하는이 계기의 능력은 혈액과 플라스마를 포함 하 여 많은 생물학 액체를 연구 하기 위하여 착취 되었습니다. 점도는 또한 용액 내의 세포에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍에 전단의 영향을 시험 하기 위해 사용 될 수 있다. 여기에서, 우리는 콘 플레이트 점도 혈소판 기계 감각 수용 체 복잡 한 GPIb에 대하여 항 체로 처리 한 혈소판에 전단 응력의 내 인 성 수준의 효력을 시험 하기 위하여 이용 합니다.

서문

기계 수용 체는 압력 또는 기계적인 섭 동/변형과 같은 기계적인 자극에 반응 하는 단백질입니다. 일부 기계 수용 체의 경우, 이러한 기계적 섭 동을 감지 하는 것은 그들이 발현 되는 세포 유형의 기능에 명시 적 이다. 복용, 예를 들어, baroreceptor 뉴런의 스트레칭 수용 체; 이러한 기계 과민 이온 채널은 혈관 "스트레칭"^1,2를 감지 하 여 혈압을 조절 합니다. 내이에서 머리카락 세포의 이온 채널은 음파³으로 인 한 기계적 변형을 감지 하 고 피부 낮은 임계 기계 수용 체 (ltmrs)는 촉각 정보⁴의 전달을 용이 하 게 합니다. 다른 경우에, 기계 수용 체는 접착 또는 성장의 설치를 위해 세포에 중요 한 정보를 제공 합니다. 세포는 그들의 국부 환경의 강성을 감지할 수 있고, 성장 또는⁵확산을 지시 하는 액 틴 세포 골격 및 인 테 그린을 통해 수축 힘에 의존할 수 있다.

세포 또는 조직 기반 모델에서 수용 체-리간드 상호 작용을 연구 할 때, 온도, pH, 리간드 농도, 음조, 막 전위 및 기타 여러 매개 변수를 변경 하는 효과를 신속 하 고 정확 하 게 보고할 수 있는 일반적인 분석 법이 존재 합니다. 생체 내에서 다를 수 있습니다. 그러나,이 같은 분석은 수용 체 활성화에 기계적인 힘의 기여를 검출 하는 관해서 짧은 떨어질 수 있습니다. 세포가 그들의 미세 환경을 감지 하 고, 음파를 감지 하거나, 스트레칭에 반응 하 든, 앞서 언급 한 기계 수 용기가 공통적으로가지고 있는 것은 리간드, 수용 체 또는 둘 모두가 상호 작용에 참여 한다는 것입니다. 표면. 수용 체 상호 작용에 기계적인 힘의 효력을 시험 하기 위하여 개발 된 분석은 수시로이 패러다임을 반영 합니다. 미세 유체 및 유량 챔버는 세포 및 수용 체^7,8에 대 한 전단 흐름의 효과를 연구 하는 데 사용 됩니다. 이러한 유형의 실험은 확립 된 흐름 속도를 통해 전단 속도를 미세 조정할 수 있는 이점이 있습니다. 다른 기술은 형광 분자 프로브를 사용 하 여 리간드가 풍부한 표면에 세포가가 해지는 힘을 감지 하 고 상호 작용^9,10에 관련 된 힘의 크기와 방향을 정확 하 게 판독 합니다.

하나 또는 두 파트너가 표면에 고정 되는 경우 발생 하는 기계 감각 외에도 전단 응력은 용액의 단백질과 세포에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 수시로 순환에서 지속적으로 혈액 세포/단백질에서 관찰 되 고, 일반적으로 표면 앵커 링 되는 기계 수용 체의 활성화를 통해 나타날 수 있다¹¹, 또는 아래 폐색 되는 대상 시퀀스의 노출을 통해 정적 조건¹². 그러나 상대적으로 적은 기법은 용액 내 입자에 대 한 전단 력의 영향을 분석 합니다. 일부 인-솔루션 접근법은 다양 한 속도와 기간으로 유체 현 탁 액의 볼 텍 싱 세포를 통해 전단을 도입 하지만, 이러한 접근법은 생성 된 전단 응력의 매우 정밀한 결정을 허용 하지 않을 수 있다. 회전 점도 계 유체에 특정 전단 력을 적용 하 여 점도를 측정 합니다. 본 명세서에서는 용액 중의 세포 또는 세포 단편에 대 한 특정 층 류 전단 율의 효과를 결정 하기 위한 적용 방법을 설명 한다.

혈소판 표면에 가장 높게 발현 된 단백질 중 하나는 당단백질 (GP) Ib-IX 복합체 이다. GPIb-IX는 본 플라즈마 단백질에 대 한 1 차 수용 체 폰 빌 레 브란트 팩터 (VWF) 이다. 함께,이 수용 체-리간드 쌍은 전단 응력 (¹³)에 대 한 혈소판 반응의 기초로 서 오랫동안 인식 되 고 있다. 혈관 손상이 발생 하는 경우, VWF는 부 내 피 매트릭스¹⁴의 노출 된 콜라겐에 결합 하 여 Vwf-GPIB-IX 상호작용을 통해 부상 부위를 혈소판으로 모집 합니다. VWF는 GPIbα 서브 유닛에서의 결합 부 위에 참여 하 여 생리 적 전단 응력 하에서 GPIb-IX는 멤브레인 근 위부 (MSD) 도메인의 전개를 유도 하 고이는 GPIb-IX¹⁵를 차례로 활성화 시킨다. 최근의 연구에서, 우리는 많은 면역 혈소판 감소 증 (ITP) 환자에서 생성 된 것과 같은 GPIbα에 대 한 항 체가 또한 전단 응력¹¹하에서 MSD를 통해 서 발생 하는 혈소판 신호를 유도할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 그러나 일반적인 순환 하에서 복합체를 고 정화 함으로써 전단 유도 된 GPIb-IX 활성화를 용이 하 게 하는 VWF와는 달리,이가 항 체는 GPIb-IX를 통해 혈소판을 가교 결합 하 고, 순환 하 여 MSD를 펼칠 수 있습니다. 이러한 방식으로, 일반적으로 전단 하에서 표면 고 정화에 의해 활성화 되는 기계 수용 체는 용액에서 활성화 될 수 있다. 본 보고서에서는 용액에서의 수용 체 활성화에 대 한 특정 수준의 전단 응력의 영향을 검출 하기 위해 점도 계 기반 균일 전단 분석을 활용 하는 방법을 설명 합니다.

프로토콜

본 원에 기재 된 기증자 유래 인간 혈소판을 사용 하는 모든 방법은에 모리 대학교/아 틀 란 타의 어린이 건강 관리 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 혈액 채취 및 혈소판 분리

1. 실험 당일에에 동의 건강 한 성인 기증자를 통해 인간의 혈액을 그립니다 3.8% 트리 구 연산 나트륨. 혈액의 1 개의 4.5 mL 관은 혈소판이 1 μ l 당 250 x 10에 가까운 기증자에 있는 20-25 조건에 대 한 충분 한 혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 산출 하기 위하여 충분 합니다.
   참고: 좁은 게이지 바늘 (21G 보다 작음)을 통해 혈액을 채취 하지 마십시오.
2. 22 ° c에서의 원심 분리를 통해 PRP를 준비 하 고, 긴 브레이크로 12 분 동안 140 x g . 이것은 두 개의 별개의 층으로 이어질 것입니다, 아래에 적혈구와 상단에 밝은 색깔의 PRP.
3. 45 ° 각도로 절단 된 피 펫 팁을 통해 신중한 파이 펫 팅을 통해 PRP의 위, 흐린, 노란 층을 분리 하 고 완전 한 혈 수 (CBC)를 통해 혈소판 수를 얻습니다.
4. 필요한 경우에는 파이프에서 혈소판을 세척 하 고, 2.9 0.34 134 Tyrode의 프로 스타 글란 딘 E1 (PGE1)과 소생의 존재 하에 완충 식 염 분 (150 mM의 염화 나트륨, 20mm 파이프)에,1mmmgcl 2, 5mm 포도 당,12mm ₃, 20 MM 헵 스, pH 7.35) 5 mm 글루코스를 사용 하는 경우, 1.5 단계로 진행 합니다. 다음 단계는 간단한 세척을 설명 합니다.
   1. PRP 볼륨을 10 mL의 파이프 완충 식 염 수로 조정 하 고 0.6 μ m PGE1를 추가 합니다.
   2. 1900 x g에서 8 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버리고 5 분 동안 Tyrode 및 글루코스 용액의 400 μ l에 혈소판 펠 렛을 둡니다.
   3. 혈소판 펠 렛을 부드럽게 소생 시켜 30 분 동안 그대로 유지 합니다.
5. 혈소판 계수를 풀링 된 인간 혈소판-불 쌍 한 혈장 (PPP)과 함께 μ l 당 10 ~ 250 x 103으로 조절 하 고 방해 받지 않는 또는 완만 한 회전 하에서 22 ° c에서 현 탁 액을 유지 한다.

2. 리간드 및 균일 한 전단 처리

참고: 파이 펫 팅을 필요로 하는 섹션 2의 모든 단계는 어떤 전단도 도입 하지 않도록 천천히 이루어져야 합니다.

1. PRP 또는 세척 된 혈소판에 원하는 항 체 또는 리간드를 추가 하 고 피 펫 팁으로 위아래로 피 펫 팅 하 여 부드럽게 섞 습니다. 5-10 분 동안 실 온에서 그대로 두십시오. 동등한 양의 PPP 또는 Tyrode의 버퍼를 음수 컨트롤에 추가 합니다.
2. 콘 플레이트 점도 계의 전원을 켜고, 플레이트 온도를 22 ° c로 설정 하 고, 플레이트가이 온도에 도달 하 게 할 시간을 허용 합니다.
3. 처리 된 PRP 또는 세척 된 혈소판을 플레이트의 중앙에 직접 온도 조절 된 원추 판 점도 계에 피 펫 한다. 모든 샘플이 콘과 플레이트 사이에 접촉 지점에 침착 되 고 원뿔의 림의 바깥쪽이 아니라는 것을 확인 합니다.
4. 적절 한 속도와 지속 시간에 전단.
   1. 점도 계 설명서에 표시 된 대로 또는 앞에서^15,16으로 표시 된 대로 전단을 계산 합니다.
   2. 뉴턴의 점도 법칙을 통해 점도 및 원하는 전단 응력에서 전단 속도를 결정 합니다. ; 플라즈마 점도는 1.5 ~ 1.6 센 포 이즈 (cP)¹⁷입니다. 예를 들어, 인간의 순환에 대 한 일반적인 전단 범위는 5-30 dyn/cm² 이 고 전단은 단일 자릿수 분 시간 척도에 적용 되어야 합니다.
5. 샘플이 플레이트와 콘 모두와 접촉 하 게 유지 되도록 플레이트 약간 (~ 2mm)의 콘을 들어올려, 샘플 부피의 중심에서 5-10 μ l를 수집 하기 위해 겔 로딩 또는 다른 긴 피 펫 팁을 사용 한다.
6. 실 온에서 20 분 동안 원하는 마커로 전단 된 시료를 배양 합니다. 포스 파티 딜 세 린, β-갈 락 토즈 및 P-셀 렉 틴 (LactC2)을 0.08 μ m에서 C2 도메인에사용 하 고, 6.25 μ g/m l에서, 그리고 안티 피-셀 리 틴 항 체 (20 µ를 각각)에 노출 시켰다.
7. 희석 또는 냉장 보관 전에 RT에서 20 분 동안 2% 파라 포 름 알 데히드로 샘플을 고정 하 고, 3.1 단계까지 진행 하거나 4°c에서 12 시간 이상 동안 시료를 보관 하십시오.

3. 유 세포 분석을 통한 표면 마커 및 가교의 검출

1. 유 세포 분석기를 통해 샘플을 분석 하 고 각 조건에 대해 최소 2만 이벤트를 수집 합니다.
2. 각 형광 물질의 세기에 대 한 높이 값 또는 기하학적 평균 형광 강도 (MFI)를 사용 하는 형광체 마커의 정량 신호 강도.
3. 전단 처리 후에 혈소판 가교 결합을 검출 하는 것을 목표로 하는 경우, 이미징 가능한 유 세포 계와 수량자로 면적 및 종횡비 매개 변수로 샘플을 분석 합니다.
   1. 면적 및/또는 종횡비의 히스토그램을 플로팅합니다.
   2. 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 차량이 대부분의 완전 원형 이벤트를 제외 하 고 게이트를 그리는 네거티브 컨트롤을 사용 하 여 (이 게이트는 일반적으로 종횡비 ~ 0.8¹⁹에서 그려진,²⁰)이 게이트의 내부 이벤트의 비율을 정량화. 종횡비가 낮은 이벤트는 가교 화 될 가능성이 더 높습니다.

결과

도 1 은 상기 혈관 벽에 앵커 되었을 때 전단 의존적 수용 체 활성화를 설명 하기 위해 처음 도입 된 GPIB-IX 활성화의 트리거 모델을 개략적으로 설명 하 고, 또한 다가 리간드에 의해 가교 된 혈소판의 활성화를 지원할 수 있다. 도 2 는 GPIB-IX (6B4 및 11A8)의 N-말단 도메인을 표적화 하 고 전단 및 정적 조건 하에서 하나의 대조 항 체 (정상 IgG)를 대상으로 하...

토론

이 원고에 설명 된 프로토콜은 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 층 류 전단 효과의 신속 하 고 다양 한 평가를 할 수 있습니다. 여기에 제시 된 특정 대표적인 결과는 다이 성체 또는이가 리간드의 영향이 전단 흐름에 의해 영향을 받을 수 있는 방법을 강조 한다. 이 응용 분야 외에도 균일 한 전단 분석은 전단 의존적 효과를 관찰 하는 광범위 한 응용 분야를가지고 있습니다. 알려진 리간드-수용 체 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin)	BioLegend	304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer	Brookfield	-
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)	Vector Labs	FL-1141
Pooled Normal Human Plasma	Precision Biologic	CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)	BD	369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle	BD	367287