Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR من خلال الجمع بين التعميم RT-PCR، الكمية RT-PCR، RNA 5 'العلاج متعدد الفوسفات، ووصمة عار الشمالية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة تطبيع للتقليل إلى أدنى حد من تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر 5'، وهو مناسب للتمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوتشوندريون الذرة.

Abstract

في الميتوكوندريا النباتية، تحتوي بعض النصوص ذات الحالة الثابتة على 5'ثلاثي الفوسفات مشتق من بدء النسخ (النصوص الأولية)، في حين تحتوي النصوص الأخرى على 5'أحاديالفوسفات ولدت بعد النسخ (النصوص المجهزة). للتمييز بين هذين النوعين من النصوص، تم وضع العديد من الاستراتيجيات، ويعتمد معظمها على وجود/غياب ثلاثي الفوسفات 5.... ومع ذلك، فإن ثلاثي الفوسفات في المرحلة الابتدائية 5 'تيرميني غير مستقر، وأنه يعوق تمييز واضح من هذين النوعين من النصوص. للتمييز بشكل منهجي وخريطة النصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوشوندريون الذرة، قمنا بتطوير استراتيجية دائرية RT-PCR (cRT-PCR) القائمة على الجمع بين cRT-PCR، الحمض النووي الريبي 5 'علاج متعدد البوخباتازي، الكمية RT-PCR (RT-qPCR)، ووصمة عار الشمالية. كتحسين، وتشمل هذه الاستراتيجية خطوة تطبيع الحمض النووي الريبي للحد من تأثير غير مستقر 5 'ثلاثي الفوسفات.

في هذا البروتوكول، يتم معالجة الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب مسبقا من قبل RNA 5 'polyphosphatase، الذي يحول 5 'triphsophate إلى أحادي الفوسفات. بعد التعميم والنسخ العكسي، يتم تطبيع اثنين من cDNAs المستمدة من 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل الذرة 26S rRNA ناضجة، والتي لديها نهاية معالجة 5 'وغير حساسة ل5'polyphosphatase. وبعد التطبيع، يتم التمييز بين النصوص الأولية والمجهزة عن طريق مقارنة منتجات cRT-PCR وRT-qPCR التي تم الحصول عليها من التقييمات RNAs المعالجة وغير المعالجة. يتم تحديد termini النص عن طريق الاستنساخ وتسلسل منتجات cRT-PCR، ومن ثم التحقق من قبل وصمة عار الشمالية.

باستخدام هذه الاستراتيجية، تم تحديد معظم النصوص ثابتة الدولة في ميتوشوندريون الذرة. بسبب نمط النسخ المعقد لبعض الجينات الميتوكوندريا، لم يتم تمييز بعض النصوص الثابتة و/أو تعيينها، على الرغم من أنها تم اكتشافها في لطخة شمالية. نحن لسنا متأكدين ما إذا كانت هذه الاستراتيجية مناسبة للتمييز وخريطة النصوص ثابتة الحالة في الميتوكوندريا النباتية الأخرى أو في plastids.

Introduction

في الميتوكوندريا النباتية، يتم تجميع العديد من RNAs ناضجة والسلائف كما isoforms متعددة، ويمكن تقسيم النصوص ثابت الدولة إلى مجموعتين على أساس الفرق في نهايات ها 5'1،2،3، 4. النصوص الأولية لها 5 'نهايات ثلاثي الفوسفات، والتي تستمد من بدء النسخ. وعلى النقيض من ذلك، فإن النصوص المجهزة تحتوي على 5'أحاديالفوسفات يتم إنشاؤها بواسطة المعالجة اللاحقة للنسخ. التمييز ورسم الخرائط من نوعين من النصوص مهمة لكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء النسخ والانتهاء من النضج النص.

وللتمييز بين النصوص الأولية والنصوص المجهزة في المتن النباتي، وضعت أربع استراتيجيات رئيسية. وتتمثل الاستراتيجية الأولى في المعالجة المسبقة لمضادات الأوجاع الميتوكوندريا بحمض التبغ البيروففاتيز (TAP)، الذي يحول الفوسفات الثلاثي الفوسفات إلى الفوسفات الأحادي الفوسفات ويمكّن النصوص الأولية من التعميم بواسطة الليغاسي الحمض النووي الريبي. ثم تتم مقارنة وفرة النسخ من عينات الحمض النووي الريبي المعالجة وغير المعالجة عن طريق التضخيم السريع لنهايات cDNA (RACE) أو التعميم RT-PCR (cRT-PCR)2،3،4. في الاستراتيجية الثانية، يتم استنفاد النصوص المجهزة أولا من RNAs الميتوكوندريا باستخدام المنهي 5'-الفوسفات تعتمد exonuclease (تكس)، ثم يتم تعيين النصوص الأولية اليسار عن طريق تحليل التمديد التمهيدي5،6 . الاستراتيجية الثالثة هي قبل سقف النصوص الأولية باستخدام guanylyl transferase، ومن ثم يتم تحديد موقف ثلاثي الفوسفات 5 'تيرميني عن طريق التمديدالتمهيدي جنبا إلى جنب مع ribonuclease أو S1 تحليل حماية nuclease 7،8 ،9. تختلف عن تلك التي تعتمد على وجود / عدم وجود 5 'ثلاثي الفوسفات، والاستراتيجية الرابعة يجمع في النسخ في المختبر، وmutagenesis الموجهة حسب الموقع، وتحليل التمديد التمهيدي لتوصيف المروجين المفترضة وتحديد النسخ بدءمواقع 8،10،11. باستخدام هذه الاستراتيجيات، تم تحديد العديد من النصوص الأولية والمجهزة في الميتوكوندريا النباتية.

ومع ذلك، فقد ذكرت العديد من الدراسات أن 5 'ثلاثي الفوسفات من النصوص الأوليةكانت غير مستقرة، وأنها تحولت بسهولة إلى أحادي الفوسفات لسبب غير معروف 2،4،12،13. وتعوق هذه المشكلة التمييز الواضح بين هذين النوعين من النصوص باستخدام تقنيات تبعاً لوجود/عدم وجود 5'ثلاثي الفوسفات، والجهود السابقة للتمييز المنهجي بين النصوص الأولية والمجهزة في المصنع فشل الميتوكوندريا2،12.

في هذا البروتوكول، ونحن الجمع بين cRT-PCR، RNA 5 'العلاج متعدد الفوسفات، RT-qPCR، ووصمة عار الشمالية للتمييز بشكل منهجي النصوص الأولية والمصنعة المتراكمة بشكل ملحوظ في الذرة(Zea mays)mitochondrion (الشكل 1). cRT-PCR يسمح رسم الخرائط في وقت واحد من 5 'و 3' الأطراف من جزيء RNA، وعادة ما يتم تكييفها لخريطة termini نسخة في النباتات2،12،14،15. يمكن أن يزيل الحمض النووي الريبي 5 'polyphosphatase اثنين من الفوسفات من تيرميني ثلاثي الفوسفات 5 '، مما يجعل النصوص الأولية المتاحة للربط الذاتي من قبل الحمض النووي الريبي ligase. وأظهرت الدراسات السابقة أن ناضجة 26S rRNA في الذرة قد عالجت 5 '، وكان غير حساس لRNA 5 'polyphosphatase1،16. لتقليل تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر في الترسيني الأولي 5'، يتم تطبيع 5 'متعدد الفوسفاتات المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل rRNA 26S ناضجة، ثم يتم تمييز النصوص الأولية والمجهزة عن طريق مقارنة cRT-PCR المنتجات التي تم الحصول عليها من عينات RNA اثنين. ويتم التحقق من نتائج رسم الخرائط والتمييز بين اللجنة من خلال اللطخة الشمالية وRT-qPCR، على التوالي. وأخيرا، يتم استخدام التمهيديات البديلة لتضخيم تلك النصوص التي تم الكشف عنها في وصمة عار الشمالية ولكن ليس عن طريق cRT-PCR. باستخدام هذه الاستراتيجية المستندة إلى CRT-PCR، تم تمييز معظم النصوص ثابتة الحالة في ميتوشوندريون الذرة ورسم خرائط1.

Protocol

1. التمهيدي التصميم 2.

  1. تصميم التمهيديات الجينات محددة للنسخ العكسي (RT) باستخدام PCR التمهيدي تصميم البرمجيات (جدولالمواد)على أساس القواعد العامة للتصميم التمهيدي17.
    ملاحظة: التمهيديات RT هي محددة للغاية للنصوص المستهدفة، وأنها ترتكز عموما على الجزء 5 'من تسلسل الترميز (mRNAs ناضجة والسلائف RNAs)، أو ~ 500-600 NT المصب من نهاية 5 'المتوقعة (18S و 26S rRNAs).
  2. تصميم أزواج من التمهيديات المتباينة لتضخيم النصوص الدائرية من قبل cRT-PCR.
    ملاحظة: التمهيديات المتباينة المقترنة تحيط تقاطع 5'--3 'من النصوص الدائرية، وتختلف مواقفهم بين النصوص المستهدفة التي تم تحليلها (الشكل S1). بعض النصوص لديها UTRs طويلة; على سبيل المثال، nad2-1 5 'UTR وrps4-1 3' UTR هي 1,985 و 1,826/1,834 nt، على التوالي1. إذا كان كل من التمهيديات راسية على منطقة الترميز، سيكون من الصعب تضخيم النصوص المستهدفة. وعلى النقيض من ذلك، فإن بعض وحدات التّجانب التّجانب قصيرة؛ على سبيل المثال، 3' UTRs من nad2-1 و nad4-1 هي 34/35 و 29-31 nt، على التوالي1. إذا تم تحديد موقع التمهيديات المقترنة بعيداً عن تسلسلات الترميز، ستفشل PCR. بشكل عام، تم تصميم زوجين من التمهيديات المتباينة لكل النصوص المستهدفة، في حين قد يكون من الضروري أزواج متعددة لرسم خريطة تلك التي أنماط النصوص معقدة و / أو UTRs طويلة جدا.
  3. أزواج تصميم التمهيديات المتقاربة لإعداد تحقيقات الحمض النووي الريبي لوصمة عار الشمالية.
    ملاحظة: وتقع المواد التمهيدية المقترنة في منطقة ترميز الجين المستهدف، وينبغي أن يكون حجم منتج PCR في حدود 100 إلى 1000 نقطة أساس. يجب أن يحتوي كل التمهيدي إلى الأمام على موقع إنزيم تقييدي لتقليل تسلسل اتّجاهات في المسبارات الناتجة عن ذلك.

2. إعداد الميتوشوندريون الخام من حبات الذرة النامية

  1. تعقيم الآفات وقذائف الهاون والمسارات الزجاجية والأنابيب، ونصائح عن طريق الأوتوكلاف، وتجفيفها في الفرن.
  2. تنفيذ جميع الإجراءات في 4 درجة مئوية أو على الجليد، وقبل تبريد جميع الحلول.
  3. إعداد 100 مل من العازلة استخراج (EB)، وتتألف من 0.3 M السكروز، 5 M M رباعي الصوديوم بيروفوسفات، 10 مل KH2بو4،2 MM EDTA، 1٪ [ث / الخامس] بولي فينيل بيروليدون 40، 1٪ [ث / الخامس] بوملين المصل البقري، 5 مل L-سيستين، و 20 مل حمض الاسكوربيك. ضبط لpH 7.3 مع KOH وتعقيم عن طريق الترشيح.
  4. إعداد 100 مل من العازلة غسل (البنك الدولي) تتكون من 0.3 M السكروز، 1 MM EGTA، و 10 MM MOPS (3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك). ضبط لpH 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم وتعقيم عن طريق الترشيح.
    ملاحظة: ويقترح إعداد EB والبنك الدولي باستخدام DEPC المعالجة Deionized H2O.
  5. جمع 20 غرام من حبات النامية في 11-20 يوما بعد التلقيح (DAP) إلى أنبوب 50 مل وضعت على الجليد، ومن ثم نقل حبات إلى قذائف الهاون المبردة مسبقا.
    ملاحظة: استخدام نسبة 100 مل من EB إلى 20 غرام من حبات الذرة.
  6. أضف 10-20 مل من الجليد البارد EB إلى كل هاون، وطحن حبات تماما.
  7. إضافة المزيد من EB، وتصفية الأنسجة الأرضيةمن خلال طبقتين من القماش مرشح (جدول المواد).
  8. الطرد المركزي في filtrate في 8000 × ز لمدة 10 دقيقة، وتجاهل بيليه.
  9. نقل supernatant إلى أنبوب جديد، والطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة.
  10. صب قبالة supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 6 مل البنك الدولي.
  11. Aliquot التعليق إلى خمسة أنابيب خالية من RNase 1.5 مل، والطرد المركزي لهم في 14،000 × ز لمدة 5 دقائق.
  12. تجاهل supernatant، وتجميد بيليه الميتوكوندريا في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. استخراج الحمض النووي الريبي الميتوكوندريا

  1. استخراج الحمض النووي الميتوكوندريا معكاشف تجاري (جدول المواد) وفقا لتعليمات التصنيع.
    تحذير: يحتوي هذا الكاشف على الفينول وإيزوثيوسيانات غوانيدين. العمل معها في غطاء محرك السيارة الدخان، وارتداء معطف المختبر والقفازات.
  2. حل الحمض النووي الميتوكوندريا معزولة في DEPC المعالجة deionized H2O، وتقدير تركيز الحمض النووي الريبي والنقاء مع مقياس الطيف (جدولالمواد).
    ملاحظة: عموما، يتم الحصول على ~ 250 ميكروغرام RNA الميتوكوندريا من 20 غرام من حبات الذرة 15-DAP.
  3. إعداد هلام أجاروز واحد يتكون من 1X TAE العازلة (40 MM تريس، 20 MM حمض الخليك،1MM EDTA)، 1.5٪ أغاروز (جدول المواد)، و1X صبغ تلطيخ النووية (جدولالمواد).
  4. إضافة حجم مناسب من 10X تحميل العازلة (0.5٪ بروموفينول الأزرق، 0.5٪ زيلين سيانول FF، و 50٪ الجلسرين)، وتحميل الميتوكوندريا RNA / تحميل خليط العازلة على هلام أغاروز 1.5٪.
  5. تشغيل هلام في 1X TAE العازلة في 5-6 V / سم لمدة 20-25 دقيقة، وتقييم سلامةالحمض النووي الريبي الميتوكوندريا عن طريق تصوير هلام مع نظام وثائق هلام (جدول المواد).
    ملاحظة: وجود اثنين من العصابات متميزة (~ ~ 3,510 و ~ 1,970 nt للذرة الميتوكوندريا 26S و 18S rRNAs, على التوالي) هو معيار مقبول لRNA الميتوكوندريا سليمة. لاستبعاد التدهور المحتمل، يجب التحقيق في سلامة الحمض النووي الريبيخلال الخطوات المتعددة لإعداد الحمض النووي الريبي الدائري (الشكل 2).

4. الحمض النووي الريبي 5 'علاج متعدد الفوسفات

  1. إعداد الحمض النووي الريبي 5'polyphosphatase (الجدول والمواد) العلاج (الجدول1)،وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
  2. استرداد الحمض النووي الريبي 5 'متعدد الفوسفاتيزالمعالجة مع مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.5.

5. تعميم الحمض النووي الريبي

  1. إعداد اثنين من ردود الفعل التعميم باستخدام نفس كميات 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجةوغير المعالجة الميتوكوندريا RNAs (الجدول 2)، واحتضان كلا ردود الفعل في 16 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  2. استرداد مجموعتين من RNAs الذاتي ربط باستخدام نفس المجموعة كما في الخطوة 4.2.
    ملاحظة: وتجدر الإشارة إلى أن جزءا فقط من الحمض النووي الميتوكوندريا سوف تكون ذاتية الربط، والحمض النووي الريبي المسترد سيكون مزيجا من النصوص الخطية والدائرية.
  3. كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.5.

6. النسخ العكسي

  1. توليف مجموعتين من cDNAs من نفس كميات من 5 'تعميم 5' متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs (200 نانوغرام).
  2. إعداد خليط التمهيدي عن طريق إضافة نسبة متساوية من 26S-CRT وتصل إلى 7 التمهيديات RT أخرى.
    ملاحظة: يجب أن يكون التركيز النهائي للخليط التمهيدي 1 μM.
  3. إعداد اثنين من الخلائط قبل عن طريق الجمع بين الكواشف المدرجة في الجدول3، وحضانة في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم البرد على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  4. تجميع اثنين منأنظمة رد فعل RT (الجدول 4)، واحتضانها في 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.
  5. سخني ردّي ردّات فعل RT عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدّة 5 دقائق، ثم ّ ابردهما على الثلج.

7- التطبيع

  1. إعداد اثنين من ردود الفعل PCR عن طريق إضافة نفس الحجم من cDNAs قالب مشتق ة من 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجة أو غير المعالجة RNAs، التمهيديات المتباينة المحيطة تقاطع 5'-3 'من دائري 26S rRNA (أي 26S-CF1 و -CR1)، الخ (الجدول 5).
  2. تشغيل رد الفعل اثنين في دورة الحرارية (جدول المواد) في ظل الظروف الموصوفة في الجدول 6.
  3. إعداد هلام أجاروز واحد يتكون من 1X TAE العازلة، 1.0٪ أغاروز، و1X صبغ تلطيخ النووية.
  4. إضافة 2 μL 10X التخزين المؤقت التحميل (0.5٪ بروموفينول الأزرق، 0.5٪ إكسيلين سيانول FF، و 50٪ الجلسرين) إلى كل من اثنين من منتجات PCR، وتحميلها على هلام.
  5. قم بتشغيل الجل في المخزن المؤقت TAE بمعدل 5-6 فولت/سم لمدة 30-40 دقيقة، وصورة باستخدام نفس نظام توثيق الجل كالخطوة 3.5.
  6. مقارنة وفرة من اثنين من منتجات PCR باستخدام برامج الكمبيوتر (جدولالمواد، الشكل 4A)، وتحسين التطبيع عن طريق تغيير كميات cDNAs قالب إذا لزم الأمر.

8. تضخيم PCR

  1. إعداد أزواج من ردود فعل PCR عن طريق إضافة حجم مناسب من cDNAs تطبيع وزوج من التمهيديات المتباينة المحيطة تقاطع 5 '-3' من النصوص المستهدفة (الجدول7).
    ملاحظة: يتم تحديد مقدار cDNAs القالب المستخدمة لتضخيم PCR من النصوص المستهدفة من قبل نتائج التطبيع rRNA 26S.
  2. إجراء ردود فعل PCR وفقا للبرنامج الموصوف في الجدول 8.
  3. كرر الخطوات من 7.3 إلى 7.5.
  4. تغيير إلى التمهيديات المتباينة المتداخلة، والتحقق من نتائج الجولة الأولى PCR عن طريق تكرار الخطوتين 8.1 و 8.2.
  5. كرر الخطوات من 7.3 إلى 7.5.
  6. استعادة العصابات البارزة التي يمكن تكرارها في جولتين من تضخيمPCR باستخدام مجموعة استرداد الحمض النووي هلام (جدول المواد).

9. تحديد النص تيرميني

  1. استنساخ منتجات PCR الهلام تنقية في ناقلاتنهاية حادة (جدول المواد) باستخدام التقنيات القياسية.
  2. قم بإجراء PCR مستعمرة لتحديد النسخ الموجب الذي يحتوي على إدراجات الهدف، وتسلسلها تجاريًا.
    ملاحظة: عادة ما يتم الكشف عن استنساخ إيجابية تحتوي على إدراج مع حجم متغير من الفرقة واحدة تعافى لأن العديد من النصوص ثابت الدولة في الميتوكوندريا النباتية لديها غير متجانسة 5 ' و / أو 3 ' ينتهي1،12.
  3. مواءمة بيانات التسلسل مع جينوم الميتوكوندريا الذرة باستخدام أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST) للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الأحيائية (NCBI). اختر الكائن الحي "الذرة (taxid:4577)"، وقاعدة بيانات البحث "جمع النيوكليوتيد (nr/nt)".
  4. العثور على تقاطع 5 '-3' من النص الدائري، وتحديد مواقف 5 ' و 3 ' termini النص.
  5. حساب حجم النصوص المستهدفة.

10. التحقق من نتائج رسم الخرائط cRT-PCR بواسطة RNA جل لطخة التهجين

ملاحظة: يتم تنفيذ التهجين هلام RNA باستخدام مجموعةتجارية (جدول المواد)، والذي يحتوي على الكواشف لتدوين تسمية الحمض النووي الريبي مع ديجوكجينين (DIG) وT7 RNA البلمرة، والتهجين، والكشف المناعي. يرجى الرجوع إلى البروتوكولات الواردة في هذه المجموعة للحصول على مزيد من التفاصيل. تأكد من استخدام المعدات المجانية RNase فقط للإجراء بأكمله.

  1. تضخيم جزء الحمض النووي المستخدم لإعداد مسبار الحمض النووي الريبي، واستنساخه إلى نفس المتجه كما هو الحال في الخطوة 9.1، والذي يحتوي على المروج T7 17 نقطة أساس من موقع الإدراج.
  2. خطي ة البناء باستخدام إنزيم تقييد السليم، واستعادة بلازميدخطي بواسطة مجموعة تنقية الحمض النووي (جدول المواد)، وحلها في DEPC المعالجة deionized H2O.
  3. تسمية الحمض النووي الريبي تحقيقات مع DIG-11-UTP من قبل مجموعة تجارية (جدولالمواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. إعداد 500 مل من 10X MOPS العازلة (0.2 M MOPS، 50 MM خلات الصوديوم، و 10 MM EDTA) باستخدام DEPC المعالجة Deionized H2O. ضبط إلى درجة الحموضة 7.0 من قبل هيدروكسيد الصوديوم، وتعقيم عن طريق الترشيح.
  5. إضافة 2-3 مجلدات من المخزن المؤقت التحميل (50٪ الفورماميد، 6.2٪ الفورمالديهايد، 1X MOPS، 10٪ الجلسرين، و 0.1٪ بروموفينول الأزرق) إلى الحمض النووي الميتوكوندريا أعدت في الخطوات 3.1-3.3.
  6. تشويه عينة RNA / تحميل خليط العازلة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ومن ثم البرد على الجليد لمدة دقيقة واحدة.
  7. إعداد هلام أغاروز مشوه (2٪ الفورمالديهايد، 1.2٪ أغاروز، و 1X MOPS)، وتحميل عينة RNA / تحميل خليط العازلة إلى هلام (1-2 ميكروغرام RNA الميتوكوندريا لكل بئر).
  8. تشغيل هلام في 1X MOPS في 3-4 V / سم ل ~ 4 ساعة.
  9. إعداد 2 لتر من 20X SSC (3 M NaCl, 0.3 M سيترات الصوديوم, درجة الحموضة 7.0). علاج مع 0.1٪ DEPC بين عشية وضحاها، وتعقيم بواسطة الأوتوكلاف.
  10. شطف هلام مرتين في 20X SSC (15 دقيقة في كل مرة)، ونقل هلام RNA إلى غشاء النايلون (جدولالمواد)عن طريق نقل الشعرية مع 20X SSC لمدة 10-16 ساعة.
  11. إصلاح الحمض النووي الريبي إلى غشاء عن طريق الخبز في 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  12. إجراء التهجين الحمض النووي الريبيوالكشف المناعي مع مجموعة تجارية (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

11. التمييز في النهايات الابتدائية والمجهزة 5'

  1. التمييز بين الغايات الأولية والمجهزة 5 'عن طريق مقارنة منتجات cRT-PCR التي تم الحصول عليها من 5 'تطبيع polyphosphatase المعالجة وغير المعالجة RNAs.
    ملاحظة: إلى النصوص الأولية، وفرة من منتجات PCR من 5 'الحمض النووي الريبي متعدد الفوسفاتيز المعالجة أعلى بكثير من ذلك من النظير غير المعالجة (الشكل1،'جين A،' والشكل 4A). ومع ذلك، إلى النصوص المجهزة، سيتم تضخيم مستوى مماثل من منتجات PCRمن مجموعتين من RNAs الميتوكوندريا (الشكل 1، 'جين B').
  2. تصميم التمهيديات RT-qPCR استناداً إلى نتائج رسم الخرائط cRT-PCR.
  3. تحقق من نتائج التمييز cRT-PCR بواسطة RT-qPCR.
    ملاحظة: يتم تطبيع عينتين cDNA المستمدة من 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل منتجات RT-qPCR من rRNA ناضجة 26S.

النتائج

تقدير كفاءة تعميم الحمض النووي الميتوكوندريا

في دراسة سابقة، تم استخدام كل من RNAs الكلي والميتوكوندريا لرسم خرائط cRT-PCR من الميتوكوندريا نسخة تيرميني في أرابيدوبسي (أرابيدوبيس ثاليانا)،وقدم نوعين من RNAs نتائج رسم الخرائ...

Discussion

في دراسة سابقة، تم استخدام مجموع وRNS الميتوكوندريا من ثقافة تعليق الخلايا من Arabidopsis لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني من قبل cRT-PCR، وتم الحصول على نتائج مماثلة12. ومع ذلك، تم استخدام الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب فقط لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني في العدي?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31600250، Y.Z.)، ومشاريع العلم والتكنولوجيا في مدينة قوانغتشو (المنحة رقم 201804020015، H.N.)، ونظام البحوث الزراعية الصينية (رقم المنحة. CARS-04-PS09, H.N.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidAladdin, ChinaA112880To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerThermo Fisher Scientific, USA4359659Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acidSigma-aldrich, USAV900134For preparation of extraction buffer
Biowest AgaroseBiowest, Spain9012-36-6To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albuminSigma-aldrich, USAA1933For preparation of extraction buffer
Bromophenol blueSigma-aldrich, USAB8026For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPCSigma-aldrich, USAV900882Deactivation of RNase
DIG Northern starter kitRoche, USA12039672910For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTASigma-aldrich, USAV900106For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTASigma-aldrich, USAE3889For preparation of wash buffer
Gel documentation systemBio-Rad, USAGel Doc XR+To image the agarose gel
GlycerolSigma-aldrich, USAG5516For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5000x)Solarbio,. ChinaG8142DNA staining
Hybond-N+, Nylon membraneAmersham Biosciences, USARPN119For Northern blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4Sigma-aldrich, USAV900041For preparation of extraction buffer
KOHAladdin, ChinaP112284For preparation of extraction buffer
L-cysteineSigma-aldrich, USAV900399For preparation of extraction buffer
MillexMillipore, USASLHP033RBTo sterile extraction and wash buffers by filtration
MiraclothCalbiochem, USA475855-1RTo filter the ground kernel tissues
MOPSSigma-aldrich, USAV900306For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDropThermo Fisher Scientific, USA2000CFor RNA concentration and purity assay
NaOHSigma-aldrich, USAV900797For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vectorTransGen Biotech, ChinaCB111Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymeraseVazyme, ChinaP505DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40Sigma-aldrich, USAV900008For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, USAPrimer Premier 6.24To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptaseTakara, Japan2690To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kitThermo Fisher Scientific, USA12183025For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphataseEpicentre, USARP8092HTo convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitorNew England Biolabs, UKM0314A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetateSigma-aldrich, USAV900212For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chlorideSigma-aldrich, USAV900058To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixesBio-Rad, USA1725202For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs, UKM0437For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphateSigma-aldrich, USA221368For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kitTiangen Biotech, ChinaDP209To purify DNA fragments from agarose gel
TrisAladdin, ChinaT110601To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagentInvitrogen, USA15596026To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kitTiangen Biotech, ChinaDP214To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FFSigma-aldrich, USAX4126For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

References

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149 RT PCR RT PCR 5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved