Discriminação e mapeamento das transcrições primárias e processadas em Mitocídrias de milho usando uma estratégia circular RT-PCR-based

Resumo

Nós apresentamos uma estratégia RT-PCR-baseada circular combinando o RT-PCR circular, o RT-PCR quantitativo, o RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment, e o borrão do Norte. Este protocolo inclui um passo de normalização para minimizar a influência do trifosfato 5 ' instável, e é adequado para discriminar e mapear as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocódrias de milho.

Resumo

Em mitocôndria de plantas, alguns transcritos de estado estacionário têm 5 ' trifosfato derivado do início da transcrição (transcritos primários), enquanto os outros contêm 5 ' monofosfato gerado pós-transcripcionalmente (transcrições processadas). Para discriminar entre os dois tipos de transcrições, várias estratégias foram desenvolvidas, e a maioria deles depende da presença/ausência de 5 ' trifosfato. No entanto, o trifosfato na primária 5 ' Termini é instável, e dificulta uma clara discriminação dos dois tipos de transcrições. Para diferenciar e mapear sistematicamente as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocídrias de milho, desenvolvemos uma estratégia circular RT-PCR (cRT-PCR), combinando cRT-PCR, tratamento com polifoshpatase de RNA 5, quantitativo RT-PCR (RT-qPCR), e Northern blot. Como uma melhoria, esta estratégia inclui uma etapa da normalização do RNA para minimizar a influência do triphosphate 5 ' instável.

Neste protocolo, o RNA mitochondrial enriquecido é pre-treated pelo RNA 5 ' polyphosphatase, que converte 5 ' triphsophate ao monofosfato. Após a circularização e a transcrição reversa, os dois cDNAs derivados de 5 ' RNAs polifosfatase-tratados e não-tratados são normalizados pelo milho 26S maduro rRNA, que tem um 5 ' final processado e é insensível a 5 ' polifosfatase. Após a normalização, as transcrições primárias e processadas são discriminadas comparando-se os produtos cRT-PCR e RT-qPCR obtidos a partir das RNAs tratadas e não tratadas. A transcrição Termini são determinados pela clonagem e sequenciamento dos produtos cRT-PCR e, em seguida, verificados pelo Northern blot.

Ao usar essa estratégia, a maioria dos transcritos de estado estacionário em mitocrídrias de milho foram determinados. Devido ao teste padrão complicado do Transcript de alguns genes mitochondrial, alguns transcritos do estacionário-estado não foram diferenciados e/ou mapeados, embora fossem detectados em um borrão do Norte. Não temos certeza se esta estratégia é adequada para discriminar e mapear as transcrições de estado estacionário em outras mitocôndrias de plantas ou em plastids.

Introdução

Nas mitocôndrias de plantas, muitos RNAs maduros e precursores são acumulados como múltiplas isoformas, e as transcrições de estado estacionário podem ser divididas em dois grupos com base na diferença em seus 5 ' fins^1,2,3, a ⁴. Os transcritos preliminares têm 5 ' extremidades do trifosfato, que são derivadas da iniciação da transcrição. Por outro lado, as transcrições processadas têm 5 ' monofosfato gerados pelo processamento pós-transcripcional. A discriminação e o mapeamento dos dois tipos de transcrições são importantes para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à transcrição e à maturação final do transcrito.

Para distinguir entre as transcrições primárias e processadas em mitocrídrias vegetais, foram desenvolvidas quatro estratégias principais. A primeira estratégia é pré-tratar as RNAs mitocondriais com a pirofosfatase ácida do tabaco (TAP), que converte 5 ' trifosfato para monofosfato e permite que as transcrições primárias sejam circularizadas por RNA ligase. As abundâncias de transcrição de amostras de RNA tratadas com TAP e não tratadas são comparadas por amplificação rápida de extremidades de cDNA (raça) ou RT-PCR circular (cRT-PCR)^2,3,4. Na segunda estratégia, as transcrições processadas são primeiramente esgotadas de RNAs mitocondriais usando o exterminador de terminação 5 '-fosfato-dependente (Tex), e as transcrições primárias deixadas são então mapeadas pela análise de extensão de primer^5,6 . A terceira estratégia é a pré-tampão das transcrições primárias utilizando guanil transferase e, em seguida, a posição de trifosodiado 5 ' Termini é determinada pela extensão da cartilha, juntamente com ribonuclease ouS1 análise de proteção nuclease 7,8 ^,9. Diferente daqueles dependendo da presença/ausência de 5 ' trifosfato, a quarta estratégia combina in vitro a transcrição, mutagenesis local-dirigido, e a análise da extensão da primeira demão para caracterizar os promotores putativo e para determinar a transcrição sites de iniciação^8,10,11. Usando estas estratégias, muitos transcritos preliminares e processados foram determinados na mitocôndria da planta.

No entanto, vários estudos relataram que o 5 ' trifosfato de transcritos primários foram instáveis, e eles foram facilmente convertidos em monofosfato por motivo desconhecido^2,4,12,13. Este problema dificulta uma discriminação clara dos dois tipos de transcrições, utilizando técnicas dependendo da presença/ausência de 5 ' trifosfato, e os esforços anteriores para discriminar sistematicamente entre as transcrições primárias e processadas em plantas a mitocôndria falhou^2,12.

Neste protocolo, nós combinamos cRT-PCR, RNA 5 ' tratamento da polifosfatase, RT-qPCR, e o borrão do Norte para distinguir sistematicamente os transcritos preliminares e processados estàvel acumulados no milho (Zea Mays) mitodrion (Figura 1). cRT-PCR permite o mapeamento simultâneo de 5 ' e 3 ' extremidades de uma molécula de RNA, e geralmente é adaptado para mapear a transcrição Termini nas plantas^2,12,14,15. O RNA 5 ' polyphosphatase poderia remover dois fosfatos do 5 ' Termini trifosodiado, que faz as transcrições preliminares disponíveis para o Self-Ligation pela ligase do RNA. Estudos prévios mostraram que o rRNA maduro de 26S no milho tinha processado 5 ' Terminus, e era insensível ao RNA 5 ' polyphosphatase^1,16. Para minimizar a influência do trifosfato instável em 5 ' Termini preliminar, os 5 ' RNAs polyphosphatase-tratados e não-tratados são normalizados pelo rRNA 26S maduro, e os transcritos preliminares e processados são diferenciados então comparando o produtos de cRT-PCR obtidos a partir das duas amostras de RNA. Os resultados de mapeamento e discriminação de cRT-PCR são verificados por Northern blot e RT-qPCR, respectivamente. Finalmente, os primers alternativos são usados para amplificar aquelas transcrições detectadas no borrão do Norte mas não pelo cRT-PCR. Usando essa estratégia baseada em cRT-PCR, a maioria dos transcritos de estado estacionário em mitocrídrias de milho foram diferenciadas e mapeadas¹.

Protocolo

1. projeto da primeira demão

1. Projete primers gene-específicos para a transcrição reversa (RT) usando o software do projeto da primeira demão do PCR (tabela dos materiais) baseado nas réguas gerais do projeto¹⁷da primeira demão.
   Nota: Os primers RT são altamente específicos para as transcrições de destino, e eles são geralmente ancorados na parte 5 ' de seqüências de codificação (mRNAs maduros e RNAs precursor), ou ~ 500 – 600 NT a jusante do antecipado 5 ' final (18S e 26S rRNAs).
2. Projete pares de primers divergentes para amplificar as transcrições circularizadas por cRT-PCR.
   Nota: os primers divergentes pareados ladeiam a junção 5 '-3 ' das transcrições circularizadas, e suas posições variam entre os transcritos alvo analisados (Figura S1). Algumas transcrições têm UTRs longos; por exemplo, nad2-1 5 ' UTR e rps4-1 3 ' UTR são 1.985 e 1826/1834 NT, respectivamente¹. Se ambos os primers estiverem ancorados na região de codificação, será difícil amplificar as transcrições de destino. Por outro lado, alguns UTRs são curtos; por exemplo, os 3 ' UTRs de nad2-1 e nad4-1 são 34/35 e 29 – 31 NT, respectivamente¹. Se os primers emparelhados estiverem localizados longe das sequências de codificação, a PCR falhará. Geralmente, dois pares de primers divergentes são projetados para cada transcritos alvo, enquanto vários pares podem ser necessários para mapear aqueles cujos padrões de transcrição são complicados e/ou UTRs são muito longos.
3. Projete pares de primers convergentes para preparar pontas de prova do RNA para o borrão do Norte.
   Nota: Os primers emparelhados estão localizados na região codificadora do gene alvo, e o tamanho do produto PCR deve estar na faixa de 100 a 1.000 BP. Cada iniciador dianteiro deve conter um local de enzima de restrição para minimizar sequências vetoriais nas sondas resultantes.

2. preparação de Mitocrídrias brutas de grãos em desenvolvimento de milho

1. Esterilize pilões, argamassas, funis de vidro, tubos, e pontas pela autoclave, e seque-os no forno.
2. Realize todos os procedimentos a 4 ° c ou no gelo, e pré-resfrie todas as soluções.
3. Prepare 100 ml de tampão de extração (EB), composto de 0,3 M de sacarose, 5 mm de pirofosfato de tetrasódio, 10 mm KH₂po₄, 2 mm EDTA, 1% [w/v] polivinilpirrolidona 40, 1% [w/v] albumina sérica bovina, 5 mm L-cisteína e 20 mm de ácido as Ajustar a pH 7,3 com KOH e esterilizar por filtração.
4. Prepare 100 mL de tampão de lavagem (WB) consistindo de 0,3 M de sacarose, 1 mM EGTA, e 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic ácido). Ajuste ao pH 7,2 com NaOH e esterilize pela filtração.
   Nota: Sugere-se para preparar EB e WB usando DEPC-tratados deionizada H₂O.
5. Colete 20 g desenvolvendo grãos em 11 – 20 dias após a polinização (DAP) para um tubo de 50 mL colocado no gelo e, em seguida, transfira os grãos para argamassas pré-resfriadas.
   Nota: Use uma proporção de 100 mL de EB para 20 g de grãos de milho.
6. Adicione 10 – 20 mL de EB gelada a cada argamassa e moer os grãos completamente.
7. Adicione mais EB, e filtre os tecidos terrestres através de duas camadas de pano de filtro (tabela de materiais).
8. Centrifugue o filtrado em 8.000 x g por 10 min, e descarte o pellet.
9. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e Centrifugue-o a 20.000 x g durante 10 min.
10. Despeje o sobrenadante, e ressuscita o pellet em 6 mL WB.
11. Aliquot a suspensão a cinco 1,5 mL de tubos RNase-livres, e centrifugue-os em 14.000 x g por 5 minutos.
12. Descarte o sobrenadante, congele a pelota mitocondrial em nitrogênio líquido e armazene a-80 ° c.

3. extração de RNA mitocondrial

1. Extraia o RNA mitocondrial com um reagente comercial (tabela de materiais) de acordo com as instruções da manufatura.
   Atenção: Este reagente contém fenol e isotiocianato de guanidina. Trabalhe com ele em uma capa de fumaça, e usar jaleco e luvas.
2. Dissolva o RNA mitocondrial isolado em H₂O desionizado tratados com DEPC e estime a concentração e a pureza do RNA com um espectrofotômetro (tabela de materiais).
   Nota: Geralmente, ~ 250 μg de RNA mitocondrial é obtido a partir de 20 g de 15-DAP grãos de milho.
3. Prepare um gel de agarose composto de 1x TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM de ácido acético, 1mM EDTA), 1,5% agarose (tabela de materiais), e 1x mancha nuclear corante (tabela de materiais).
4. Adicionar um volume apropriado de 10x buffer de carga (0,5% bromofenol azul, 0,5% xilol cianol FF, e 50% glicerol), e carga de RNA mitocondrial/carga tampão de mistura sobre o 1,5% gel de agarose.
5. Executar o gel em 1x TAE buffer em 5 – 6 V/cm por 20 – 25 min, e avaliar a integridade do RNA mitocondrial por imagem o gel com um sistema de documentação de gel (tabela de materiais).
   Nota: A presença de duas bandas distintas (~ 3.510 e ~ 1.970 NT para o milho mitocondrial 26S e 18S rRNAs, respectivamente) é um padrão aceitável para RNA mitocondrial intacto. Para excluir a possível degradação, a integridade do RNA deve ser investigada durante as múltiplas etapas da preparação do RNA circularizado (Figura 2).

4. RNA 5 ' Polifosfatase tratamento

1. Configurar o tratamento de RNA 5 ' polifosfatase (tabela e materiais) (tabela 1) e incubar a 37 ° c durante 30 – 60 min.
2. Recupere o RNA 5 ' polyphosphatase-tratado com um jogo da purificação do RNA (tabela dos materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
3. Repita os passos 3,3 a 3,5.

5. circularização do RNA

1. Prepare duas reações de circularização utilizando as mesmas quantidades de 5 ' RNAs mitocondriais tratadas com polifosfatase e não tratadas (tabela 2), e incubar ambas as reações a 16 ° c por 12 – 16 h.
2. Recupere os dois conjuntos de RNAs autoligadas usando o mesmo kit que na etapa 4,2.
   Nota: Deve-se notar que apenas uma fração do RNA mitocondrial será autoligada, e o RNA recuperado será uma mistura de transcritos lineares e circularizados.
3. Repita os passos 3,3 a 3,5.

6. transcrição reversa

1. Sintetizar dois conjuntos de cDNAs a partir das mesmas quantidades de RNAs de 5 ' polifosfatase tratadas e não tratadas (200 ng) circularizadas.
2. Prepare uma mistura de primer adicionando uma proporção igual de 26S-CRT e até 7 outros primers RT.
   Nota: A concentração final da mistura de primer deve ser de 1 μM.
3. Prepare duas pré-misturas combinando os reagentes listados na tabela 3, incubar a 65 ° c por 5 min, e depois Chill no gelo por 2 min.
4. Montar dois sistemas de reacção RT (tabela 4) e incubar-los a 42 ° c por 50 min.
5. Aqueça as duas reacções RT a 70 ° c durante 5 min e, em seguida, Chill-los no gelo.

7. normalização

1. Prepare duas reações de PCR adicionando o mesmo volume de cDNAs do modelo derivado de 5 ' RNAs polifosfatase-tratadas ou não-tratadas, os primers divergentes que flanqueam a junção 5 '-3 ' do rRNA de 26S molde (isto é 26S-CF1 e-o-de-2), etc. (tabela 5).
2. Execute as duas reações em um termociclador (tabela de materiais) em condições descritas na tabela 6.
3. Prepare um gel do agarose compor do amortecedor de 1x TAE, do agarose de 1,0%, e do corante de coloração nuclear 1x.
4. Adicione 2 μL de tampão de carga 10x (0,5% de bromofenol azul, 0,5% de xileno cianol FF e 50% de glicerol) a cada um dos dois produtos de PCR e carregue-os no gel.
5. Execute o gel em 1x TAE buffer em 5 – 6 V/cm por 30 – 40 min, e imagem-lo usando o mesmo gel sistema de documentação como etapa 3,5.
6. Compare a abundância dos dois produtos do PCR usando o software de computador (tabela dos materiais, figura 4a), e aperfeiçoe a normalização mudando as quantidades de cDNAs do molde se necessário.

8. amplificação do PCR

1. Prepare pares de reações do PCR adicionando o volume apropriado dos cDNAs normalizados e um par de primers divergentes que flanqueam a junção 5 '-3 ' das transcrições do alvo (tabela 7).
   Nota: A quantidade de cDNAs do molde usada para a amplificação do PCR das transcrições do alvo é determinada pelos resultados da normalização do rRNA 26S.
2. Realize as reações de PCR de acordo com o programa descrito na tabela 8.
3. Repita os passos 7,3 a 7,5.
4. Mude aos primers divergentes aninhados, e verifique os primeiros resultados redondos do PCR repetindo etapas 8,1 e 8,2.
5. Repita os passos 7,3 a 7,5.
6. Recupere as bandas proeminentes que poderiam ser repetidas em duas rodadas de amplificação de PCR usando um kit de recuperação de DNA de gel (tabela de materiais).

9. determinação da transcrição Termini

1. Clone os produtos gel-purified do PCR em um vetor da Blunt-extremidade (tabela dos materiais) usando técnicas padrão.
2. Realize a PCR de colônia para selecionar clones positivos que contenham as inserções de destino e sequencia-as comercialmente.
   Nota: Clones positivos contendo pastilhas com tamanho variável são geralmente detectados a partir de uma única banda recuperada, pois muitas transcrições de estado estacionário na planta mitocondrial têm heterogéneos 5 ' e/ou 3 ' extremidades^1,12.
3. Alinhe os dados de sequenciamento com o genoma mitocondrial do milho usando a ferramenta básica de busca de alinhamento local (BLAST) do centro nacional de informação sobre biotecnologia (NCBI). Escolha o organismo "milho (taxid: 4577)", e banco de dados de pesquisa "nucleotide Collection (NR/NT)".
4. Encontrar o 5 '-3 ' junção da transcrição molde, e determinar as posições de 5 ' e 3 ' transcrição Termini.
5. Calcule o tamanho das transcrições de destino.

10. verificação dos resultados do mapeamento do cRT-PCR pela hibridação do borrão do gel do RNA

Nota: A hibridação do borrão do gel do RNA é executada usando um jogo comercial (tabela dos materiais), que contenha os reagentes para a transcrição-rotulagem do RNA com Digoxigenina (Dig) e o POLYMERASE do RNA T7, a hibridação, e a deteção imunológica. Refira por favor os protocolos fornecidos neste jogo para mais detalhes. Certifique-se de que somente o equipamento livre de RNase está usado para o procedimento inteiro.

1. Amplificar o fragmento de DNA usado para preparar a sonda de RNA, e cloná-lo para o mesmo vetor como na etapa 9,1, que contém um promotor T7 17 BP a montante do local de inserção.
2. Linearize a construção usando a enzima apropriada da limitação, recupera o plasmídeo linearizada por um jogo da purificação do ADN (tabela dos materiais), e dissolve-o no H₂O deionizada DEPC-Tratado.
3. Pontas de prova do RNA da etiqueta com DIG-11-UTP por um jogo comercial (tabela dos materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
4. Prepare 500 mL de tampão MOPS 10x (0,2 M MOPS, acetato de sódio de 50 mM e EDTA de 10 mM) usando H₂O desionizado tratado com DEPC. ajuste ao pH 7,0 por NaOH, e esterilize pela filtração.
5. Adicione 2 – 3 volumes de tampão de carga (50% de formamida, 6,2% de formaldeído, 1x MOPS, 10% de glicerol e 0,1% de bromofenol azul) ao RNA mitocondrial preparado nas etapas 3.1 – 3.3.
6. Denature a mistura do tampão da amostra/carregamento do RNA em 65 ° c por 10 minutos, e esfrie então no gelo por 1 minuto.
7. Prepare um gel de agarose desnaturado (2% formaldeído, 1,2% agarose, e 1x MOPS), e carregar a amostra de RNA/carga tampão de mistura para o gel (1 – 2 μg de RNA mitocondrial por poço).
8. Executar o gel em 1x MOPS em 3 – 4 V/cm para ~ 4 h.
9. Prepare 2 L de 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio, pH 7,0). Tratá-lo com 0,1% DEPC durante a noite, e esterilizar por autoclave.
10. Enxague o gel duas vezes em 20x SSC (15 min cada vez), e transfira o RNA do gel a uma membrana de nylon (tabela dos materiais) pela transferência capilar com 20x SSC para 10 – 16 h.
11. Fixar o RNA à membrana por cozimento a 120 ° c por 30 min.
12. Realize a hibridação do RNA e a deteção imunológica com um jogo comercial (tabela dos materiais) de acordo com a instrução do fabricante.

11. discriminação das extremidades primárias e processadas 5 '

1. Discriminar as extremidades primárias e processadas 5 ' comparando os produtos cRT-PCR obtidos a partir dos 5 ' normalizados polifosfatase-tratados e não tratados RNAs.
   Nota: Para as transcrições primárias, a abundância de produtos de PCR de 5 ' RNA tratado com polifosfatase é muito maior do que a de contrapartes não tratadas (Figura 1, ' gene A ' e figura 4a). No entanto, para transcrições processadas, um nível comparável de produtos de PCR seria amplificado a partir dos dois conjuntos de RNAs mitocondrial (Figura 1, ' gene B ').
2. Projete os primers RT-qPCR baseados nos resultados do mapeamento cRT-PCR.
3. Verifique os resultados da discriminação do cRT-PCR pelo RT-qPCR.
   Nota: As duas amostras de cDNA derivadas de 5 ' RNAs polifosfatase-tratadas e não-tratadas são normalizadas pelos produtos de RT-qPCR de 26S amadurecem rRNA.

Resultados

Estimativa da eficiência da circularização do RNA mitocondrial

Em um estudo precedente, ambos os RNAs totais e mitochondrial foram usados para o mapeamento do cRT-PCR de Termini do transcrito mitochondrial em Arabidopsis (Arabidopsis thaliana de Arabidopsis), e os dois tipos de RNAs deram resultados similares do traço¹². Inicialmente, utilizou-se também RNAs totais ...

Discussão

Em estudo prévio, foram utilizados RNAs totais e mitocondriais da cultura de suspensão celular de Arabidopsis para mapear a transcrição mitocondrial Termini por CRT-PCR, e resultados semelhantes foram obtidos¹². No entanto, apenas o RNA mitocondrial enriquecido foi utilizado para mapear a transcrição mitocondrial Termini em muitos outros estudos^1,2,3,9. N?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Aladdin, China	A112880	To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid	Sigma-aldrich, USA	V900134	For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose	Biowest, Spain	9012-36-6	To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin	Sigma-aldrich, USA	A1933	For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue	Sigma-aldrich, USA	B8026	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit	Roche, USA	12039672910	For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	For preparation of wash buffer
Gel documentation system	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	To image the agarose gel
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x)	Solarbio,. China	G8142	DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane	Amersham Biosciences, USA	RPN119	For Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	For preparation of extraction buffer
KOH	Aladdin, China	P112284	For preparation of extraction buffer
L-cysteine	Sigma-aldrich, USA	V900399	For preparation of extraction buffer
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	To filter the ground kernel tissues
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	For RNA concentration and purity assay
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector	TransGen Biotech, China	CB111	Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase	Vazyme, China	P505	DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase	Takara, Japan	2690	To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase	Epicentre, USA	RP8092H	To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor	New England Biolabs, UK	M0314	A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate	Sigma-aldrich, USA	V900212	For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride	Sigma-aldrich, USA	V900058	To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate	Sigma-aldrich, USA	221368	For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit	Tiangen Biotech, China	DP209	To purify DNA fragments from agarose gel
Tris	Aladdin, China	T110601	To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent	Invitrogen, USA	15596026	To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit	Tiangen Biotech, China	DP214	To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis