דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי

Summary

אנו מציגים אסטרטגיה מבוססת RT-PCR על-ידי שילוב מעגלי RT-PCR, כמותי RT-PCR, RNA 5 ' פוליפהוספטאז-טיפול, ואת הכתם הצפוני. פרוטוקול זה כולל שלב נורמליזציה כדי למזער את השפעתה של 5 ' טריפוספט לא יציב, והוא מתאים להפלות ולמיפוי התעתיקים הראשוניים והמעובדים שהצטברו באופן בלתי נשכח במיטוכונמיטוייז.

Abstract

ב המיטו, כמה תעתיקים של מדינה יציבה יש 5 ' טריפוספט נגזר תעתיק שעתוק (התעתיקים העיקריים), בעוד האחרים מכילים 5 ' monophosphate שנוצרו לאחר ההמרה (תעתיקים מעובד). כדי להפלות בין שני סוגי התעתיקים, פותחו מספר אסטרטגיות, ורובן תלויות בנוכחות/העדר של 5 טריפוספט. עם זאת, טריפוספט ב 5 ' termini העיקרי הוא לא יציב, והיא מעכבת אפליה ברורה של שני סוגים של תעתיקים. כדי להבדיל באופן שיטתי ולמפות את התעתיקים העיקרי ומעובד שהצטברו באופן מספק תירס המיטו, פיתחנו מעגלי RT-PCR (cRT-PCR) מבוססי אסטרטגיה על ידי שילוב cRT-PCR, RNA 5 ' פוליפהופטואז טיפול, כמותי הכתם הצפוני (RT-qPCR). כשיפור, אסטרטגיה זו כוללת צעד נורמליזציה של RNA כדי למזער את ההשפעה של 5 ' טריפוספט לא יציב.

בפרוטוקול זה, רנ א מיטוכונדריאלי מועשר מטופל מראש על ידי RNA 5 ' פוליפהוספטאז, אשר ממיר 5 ' triphsophate נאה monophosphate. לאחר שעתוק מעגלי ותמלול הפוכה, שני הcdnas הנגזרים מ-5 ' פוליפהוספטאז ' והוא לא מטופל, הם מנורמתים על-ידי ממגורות של תירס 26S בוגרת rRNA, שהיא בעלת מעבד 5 מעובד ואינה רגישה לתוך 5 ' פוליפהוספטאז. לאחר הנורמליזציה, התעתיקים הראשוניים והמעובדים מפלים בהשוואת מוצרי cRT-PCR ו-RT-qPCR המתקבלים מתוך RNAs המטופל ושאינו מטופל. התמליל נקבע על ידי שיבוט ורצף של מוצרי cRT-PCR, ולאחר מכן מאומת על ידי הכתם הצפוני.

על ידי שימוש באסטרטגיה זו, רוב התעתיקים של המצב היציב ביותר של תירס מיטוכונטרלון נקבעו. בשל דפוס התעתיק המסובך של כמה גנים מיטוכונדריאלי, לא הובחנו ו/או מופו מספר תעתיקים של מצבים יציבים, למרות שזוהו בכתם הצפוני. אנחנו לא בטוחים אם אסטרטגיה זו מתאימה להפלות ולמפות את התעתיקים של המצב היציב במיטוהצמחים או בפלסטלינה.

Introduction

במפעל המיטומטר, rnas רבים מבוגרים ומקודחים נצברים כמו מספר isoforms, ואת התעתיקים של מצב יציב ניתן לחלק לשתי קבוצות מבוסס על ההבדל ב 5 ' הקצוות שלהם^{1,2,3, ד}. התעתיקים העיקריים יש 5 ' טריפוספט קצוות, אשר נגזר שעתוק חניכה. לעומת זאת, לתעתיקים המעובדים יש 5 ' monophosphate שנוצרו על-ידי עיבוד פוסט-טרנססקריפט. אפליה ומיפוי של שני הסוגים של התעתיקים חשובים כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תעתיק וההבשלה של תעתיק.

כדי להבחין בין התעתיקים העיקריים והמעובדים במפעל המיטומטר, פותחו ארבע אסטרטגיות עיקריות. האסטרטגיה הראשונה היא לטפל מראש עם rnas מיטוכונדריאלי עם חומצת טבק פירופוספאטאז (ברז), אשר ממיר 5 ' טריפוספט כדי monophosphate ומאפשר התעתיקים העיקריים להיות מעגלי על ידי RNA ligase. התעתיק מריקודי ה-RNA שטופלו בסטפס ושאינם מטופלים מושווים באמצעות הגברה מהירה של קצוות cdna (מרוץ) או מעגלי RT-pcr (cRT-pcr)^2,3,4. באסטרטגיה השנייה, התעתיקים המעובדים הם ראשית לרוקן rnas מיטוכונדריאלי באמצעות שליחות קטלנית 5 '-פוספט תלוי-החכירה (TEX), ואת התעתיקים העיקריים שמאל ממופים מכן על ידי פריימר הארכה ניתוח^5,6 . האסטרטגיה השלישית היא טרום המכסה את התעתיקים העיקריים באמצעות guanylyl transferase, ולאחר מכן את המיקום של triphosphated 5 ' termini נקבע על ידי פריימר הארכה יחד עם ריבונוקלאז או S1 הגנה ההגנה מפני שכירות^{7,8 ,9}. שונה מאלה בהתאם לנוכחות/היעדרות של 5 ' טריפוספט, האסטרטגיה הרביעית משלבת בתמלול מחוץ למבחנה, מוטזיס מונחה אתרים וניתוח הארכה כדי לאפיין את היזמים ולקבוע את התמלול . מקומות החניכה^8,10,11 על-ידי שימוש באסטרטגיות אלה, תעתיקים ראשוניים ומעובדים רבים נקבעו ב המיטו, הצמח.

עם זאת, מספר מחקרים דיווחו כי 5 ' הטריפוספט של התעתיקים העיקריים היו יציבים, והם הומרו בקלות monophosphate מסיבה לא ידוע^2,4,12,13. בעיה זו מעכבת אפליה ברורה של שני סוגי התעתיקים באמצעות טכניקות בהתאם לנוכחות/היעדרות של 5 ' טריפוספט, ומאמצים קודמים להפלות באופן שיטתי בין התעתיקים הראשוניים והמעובדים במפעל מיטוכונמיטוa נכשל^2,12.

בפרוטוקול זה, אנו משלבים cRT-PCR, RNA 5 ' פוליפהוספטאז הטיפול, RT-qPCR, והצפוני כתם כדי להבדיל באופן שיטתי את התעתיקים העיקרי ומעובד שהצטברו באופן מאוד תירס (Zea מייז) המיטורציה (איור 1). cRT-PCR מאפשר מיפוי סימולטני של 5 ' ו-3 ' הגפיים של מולקולת RNA, והוא מותאם בדרך כלל למפות את המפה לתוך מפעלים^2,12,^14,15. רנ א 5 ' פוליפהוספטאז יכול להסיר שני פוספטים מן triphosphated 5 ' termini, מה שהופך את התעתיקים העיקריים זמין לצורך הפצה עצמית על ידי RNA ligase. מחקרים קודמים הראו כי 26 בוגרים rrna ב תירס עיבד 5 ' הטרמינוס, וזה היה חסר רגישות RNA 5 ' פוליפהוספטאז^1,16. כדי למזער את ההשפעה של טריפוספט יציב בראשית 5 ' termini, the 5 ' פוליפהוספטאז-טיפל ושאינם מטופלים rnas הם מנורמל על ידי rrna בוגרת, ואת התעתיקים העיקרי ומעובד הם הבדיל מכן על ידי השוואת ה מוצרי cRT-PCR המתקבלים משתי דגימות ה-RNA. המיפוי של ה-cRT-PCR ותוצאות האפליה מאומתים על-ידי הכתם הצפוני ו-RT-qPCR, בהתאמה. בסופו של דבר, משתמשים בצבעי יסוד חלופיים כדי להגביר את התעתיקים שאותרו באבן החשופה בצפון, אך לא באמצעות cRT-PCR. על-ידי שימוש באסטרטגיה זו מבוססת cRT-PCR, התעתיקים הקבועים ביותר במיטוכונטריום בתירס הובלו ומופו¹.

Protocol

1. פריימר עיצוב

1. עיצוב בצבעי יסוד ספציפיים לשימוש בתעתיק הפוך (RT) באמצעות תוכנת עיצוב PCR (טבלת חומרים) המבוססת על הכללים הכלליים של העיצוב הכללי¹⁷.
   הערה: RT התחל הם ספציפיים מאוד את התעתיקים היעד, והם מעוגנים בדרך כלל על 5 ' החלק של רצפי קידוד (mRNAs מבוגרים ו RNAs מקודמן), או ~ 500 – 600 nt במורד של הצפוי 5 ' סוף (18S ו-26S rRNAs).
2. להגביר את התעתיקים המפוצלים. של הדגם cRT-PCR
   הערה: התחל המיועד לזווג את הצומת 5 ' -3 של התעתיקים המעגליות, ומיקומם משתנה בין התעתיקים של המטרה שנותחו (איור S1). לחלק מתעתיקים יש UTRs ארוכים; לדוגמה, nad2-1 5 ' utr ו- rps4-1 3 ' utr הם 1,985 ו-1826/1834, בהתאמה¹. יהיה קשה להגביר את. התעתיקים של המטרה לעומת זאת, כמה UTRs הם קצרים; לדוגמה, 3 ' UTRs של nad2-1 ו- nad4-1 הם 34/35 ו -29 – 31 nt, בהתאמה¹. אם התחל הזווג ממוקם הרחק מרצפי הקידוד, ה-PCR ייכשל. באופן כללי, שני זוגות של תחל מפוצלים מיועדים עבור כל תעתיקים של יעד, בעוד זוגות מרובים עשויים להיות נחוצים כדי למפות את אלה שדפוסי התעתיק שלהם הם מסובכים ו/או UTRs הם ארוכים מאוד.
3. עיצוב זוגות של התחל מתכנסת כדי להכין בדים של RNA עבור הכתם הצפוני.
   הערה: התחל לזווג ממוקמים על אזור קידוד של הגן היעד, ואת גודל המוצר PCR צריך להיות בטווח של 100 כדי 1,000 bp. כל פריימר קדימה צריך להכיל אתר אנזים הגבלה כדי למזער רצפים וקטוריים בבדיקות שהתקבל.

2. הכנת מיטוכונמיטו, מ תירס פיתוח גרעינים

1. לחטא את הקוצים, מרגמות, זכוכית funnels, צינורות, וטיפים על ידי החיטוי, ולייבש אותם בתנור.
2. בצע את כל ההליכים ב-4 ° צ' או על הקרח, ולפני הגניבה כל הפתרונות.
3. להכין 100 mL של מאגר החילוץ (EB), מורכב 0.3 M סוכרוז, 5 מ"מ הטטרפוספט מילימטר, 10 מ"מ KH₂PO₄, 2 מ"מ edta, 1% [w/v] polyvinylפירוסיים 40, 1% [w/v] הסרום הבקר, 5 מ"מ L-cysteine, ו 20 מ"מ חומצה אסקורבית. להתאים ל-pH 7.3 עם KOH ולעקר על ידי סינון.
4. להכין 100 mL של מאגר לשטוף (WB) המורכב 0.3 M סוכרוז, 1 מ"מ EGTA, ו 10 מ"מ מנקה (3-(N-שורגואולנו) חומצה propanesulfonic). להתאים ל-pH 7.2 עם NaOH ולעקר על ידי סינון.
   הערה: היא הציעה להכין EB ו-WB באמצעות DEPC מטופלים התייחס H₂O.
5. לאסוף 20 g לפתח גרעינים ב 11 – 20 ימים לאחר האבקה (DAP) כדי שפופרת 50-mL ממוקם על הקרח, ולאחר מכן להעביר את הגרעינים כדי מקורר מקורלים.
   הערה: השתמש ביחס של 100 mL של EB כדי 20 גרם של גרעינים תירס.
6. הוסיפו 10 – 20 מ ל לחומר מליטה, וטוחנים את הגרעינים לחלוטין.
7. להוסיף EB, ולסנן את רקמות הקרקע דרך שתי שכבות של בד סינון (טבלת חומרים).
8. צנטריפוגה את פילטרט ב 8,000 x g עבור 10 דקות, ולמחוק את הגלולה.
9. העבר את הסופרנטאנט לצינור חדש, וצנטריפוגה אותו ב 20,000 x g עבור 10 דקות.
10. שפוך את הסופרנטאנט, והשהה מחדש את הגלולה ב-6 מ ל WB.
11. מחלקים את ההשעיה לחמש 1.5 mL RNase-שפופרות חינם, ו צנטריפוגה אותם ב 14,000 x g עבור 5 דקות.
12. השמט את הסופרנטאנט, הקפא את הגלולה היטוכונדריטית בחנקן נוזלי, ואחסן ב-80 ° c.

3. הוצאת רנ א מיטוכונדריאלי

1. לחלץ RNA מיטוכונדריאלי עם מגיב מסחרי (טבלת חומרים) על פי הוראות הייצור.
   זהירות: מגיב זה מכיל פנול ו guanidine isothiocyanate. , תעבוד עם זה בתוך מכסה המנוע. ותלבש חלוק וכפפות מעבדה
2. לפזר את ה-RNA מיטוכונדריאלי מבודד ב-DEPC, שטופלו ב-H₂O, ולאמוד ריכוז RNA וטוהר עם ספקטרוסקופיה (שולחן חומרים).
   הערה: באופן כללי, ~ 250 μg RNA מיטוכונדריאלי מתקבל מ-20 גר' גרעינים של 15-DAP תירס.
3. הכינו ג'ל אחד מורכב של 1 x טה מאגר (40 mM טריס, 20 מ"מ חומצה אצטית, 1X EDTA), 1.5% agarose (טבלת חומרים), ו-1x צבע גרעיני מכתים (טבלת חומרים).
4. הוסף נפח מתאים של מאגר טעינת 10x (0.5% ברומאופנול כחול, 0.5% קסילן FF, ו 50% גליצרול), ו טען מיטוכונדרימי RNA/טעינת מאגר העמסה ב 1.5% agarose ג'ל.
5. הפעל את ג'ל ב 1 x טה מאגר ב 5 – 6 V/cm עבור 20 – 25 דקות, ולהעריך את שלמות RNA מיטוכונדריאלי על ידי דימות ג'ל עם מערכת התיעוד ג'ל (טבלת חומרים).
   הערה: הנוכחות של שתי להקות נפרדות (~ 3,510 ו-~ 1,970 nt עבור תירס מיטוכונדריאלי 26S ו 18S rRNAs, בהתאמה) הוא תקן מקובל עבור RNA מיטוכונדריאלי שלם. כדי לא לכלול השפלה אפשרית, שלמות RNA יש לחקור במהלך השלבים המרובים של הכנה מעגלי RNA (איור 2).

4. רנ א 5 ' פוליפהוספטאז טיפול

1. הגדר את ה-RNA 5 ' פוליפהוספטאז (טבלה וחומרים) טיפול (שולחן 1), ו דגירה ב 37 ° c עבור 30 – 60 דקות.
2. לשחזר את 5 ' פוליפהוספטאז התייחסו RNA עם ערכת טיהור RNA (טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
3. חזור על שלבים 3.3 עד 3.5.

5. רנ א הסיקולריזציה

1. הכינו שתי תגובות מעגליות תוך שימוש באותם כמויות של 5 ' פוליפהוספטאז-שטופלו ומיטוכונדריאלי שאינם מטופלים (שולחן 2), ו דגירה שתי התגובות ב 16 ° c עבור 12-16 h.
2. שחזר את שתי הערכות של RNAs באופן עצמאי באמצעות אותה ערכה כמו בשלב 4.2.
   הערה: יצוין כי רק חלקיק של RNA מיטוכונדריאלי יהיה עצמית ליגולי, ו-RNA התאושש יהיה תערובת של תעתיקים ליניארי ומעגליות.
3. חזור על שלבים 3.3 עד 3.5.

6. תמלול הפוכה

1. סנתז שני סטים של cDNAs מאותם כמויות של 5 ' פוליפהוספטאז שטופלו ולא מטופלים RNAs (200 ng).
2. הכינו את התערובת על ידי הוספת יחס שווה של 26S-CRT ועד 7 התחל של שונים.
   הערה: הריכוז הסופי של התערובת התחל. צריך להיות 1 μM
3. הכינו שני תערובות מראש על ידי שילוב הריאגנטים המפורטים בטבלה 3, הדגירה ב 65 ° c עבור 5 דקות, ולאחר מכן להירגע על קרח עבור 2 דקות.
4. להרכיב שתי מערכות התגובה RT (שולחן 4), ו הדגירה אותם ב 42 ° צ' עבור 50 דקות.
5. החום הן תגובות RT ב 70 ° צ' עבור 5 דקות, ולאחר מכן לצנן אותם על קרח.

7. נורמליזציה

1. הכינו שתי תגובות PCR על ידי הוספת אותו נפח של התבנית cDNAs שנגזר 5 ' פוליפהוספטאז-מטופלים או RNAs שאינם מטופלים, מפוצלים בתוך מבנה של 5 '-3 ' הצומת של מעגלי 26S rRNA (כלומר 26S-CF1 ו-CR1), וכו ' (טבלה 5).
2. הפעל את שתי התגובות בציקלנר תרמי (טבלת חומרים) בתנאים המתוארים בטבלה 6.
3. הכינו ג'ל אחד שמורכב מ-1 x מאגר טה, 1.0% agarose, ו-1x צבע גרעיני מכתים.
4. הוסף 2 μl 10x טעינת המאגר (0.5% ברומאופנול כחול, 0.5% קסילן FF, ו 50% גליצרול) לכל אחד משני מוצרי ה-PCR, ולטעון אותם על ג'ל.
5. הפעל את ג'ל ב-1 x טה מאגר ב 5 – 6 V/cm עבור 30-40 דקות, והתמונה היא באמצעות מערכת התיעוד ג'ל אותו כמו שלב 3.5.
6. השווה את השפע של שני מוצרי ה-PCR באמצעות תוכנת מחשב (טבלת חומרים, איור 4a) ומיטוב הנורמליזציה על-ידי שינוי כמויות ה-cdnas של תבניות במידת הצורך.

8. הגברה של הPCR

1. הכינו זוגות של תגובות ה-PCR על-ידי הוספת נפח מתאים של cDNAs מנורמל וזוג משני האגפים המפוצלים של 5 ' -3 ' של התעתיקים של היעד (שולחן 7).
   הערה: כמות התבניות של cDNAs המשמשת להגברה של ה-PCR של תעתיקים של היעד נקבעת על-ידי תוצאות הנורמליזציה של 26 rRNA.
2. בצע את תגובות ה-PCR לפי התוכנית המתוארת בטבלה 8.
3. חזור על שלבים 7.3 עד 7.5.
4. שנה לצבעי ההתחלה המפוצלים ואמת את התוצאות העגולות של ה-PCR על-ידי שלבים חוזרים 8.1 ו-8.2.
5. חזור על שלבים 7.3 עד 7.5.
6. לשחזר את הלהקות הבולטות שניתן לחזור בשני סיבובים של הגברה PCR באמצעות ערכת ה-DNA ג'ל התאוששות (לוח חומרים).

9. קביעת תעתיק טרמיני

1. שיבוט מוצרי ה-PCR מטוהרים לתוך וקטור בוטה-סוף (טבלת חומרים) באמצעות טכניקות סטנדרטיות.
2. לבצע את ה-PCR המושבה כדי לבחור שכפולים חיוביים המכילים את מוסיף היעד, ולסדר אותם באופן מסחרי.
   הערה: שיבוטים חיוביים המכילים מוסיף עם גודל משתנה מזוהים בדרך כלל מלהקה אחת התאושש בגלל הרבה המדינה יציבה התעתיקים של מיטוכונדריאלי צמח הטרוגנית 5 ' ו/או 3 ' מסתיים^1,12.
3. יישר את הנתונים ברצף עם גנום מיטוכונדריאלי באמצעות היישור המקומי הבסיסי כלי חיפוש (הפיצוץ) של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (NCBI). בחר אורגניזם "תירס (מטקת: 4577)", וחפש במאגר המידע "אוסף נוקלאוטיד (nr/nt)".
4. מצא את הצומת 5 ' 3 ' של תעתיק מעגלי, וקבע את מיקומם של 5 ' ו-3 ' תעתיק termini.
5. לחשב את הגודל של התעתיקים היעד.

10. אימות התוצאות של מיפוי ה-cRT-PCR על-ידי כתמי היברידיזציה

הערה: רנ א ג'ל אבן היברידיזציה מבוצעת באמצעות ערכה מסחרית (טבלה של חומרים), אשר מכיל את הריאגנטים עבור תמלול-תיוג של RNA עם digoxigenin (לחפור) ו T7 RNA פולימראז, היברידיזציה, וזיהוי חיסולוגי. נא עיין בפרוטוקולים המסופקים בערכה זו לקבלת פרטים נוספים. ודא שרק RNase ציוד חופשי משמש עבור ההליך כולו.

1. הגבר את קטע ה-DNA המשמש להכנת בדיקה RNA, ושיבוט אותו לאותו וקטור כמו בשלב 9.1, אשר מכיל את היזם T7 17 bp במעלה הזרם של אתר הכניסה.
2. Linearize המבנה באמצעות אנזים הגבלה נאותה, לשחזר את פלדמיד לינארי על ידי ערכת טיהור DNA (טבלה של חומרים), ולפזר אותו ב-depc התייחס H₂O.
3. תווית RNA בדים עם לחפור -11-UTP על ידי ערכת מסחרית (טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
4. להכין 500 mL של מאגר מגבים 10x (0.2 M מגבים, 50 mM אצטט נתרן, ו 10 מ"מ EDTA) באמצעות DEPC מטופל H₂O. התאם ל-pH 7.0 על ידי naoh, ולעקר על ידי סינון.
5. הוסף 2 – 3 כרכים של העמסה מאגר (50% הטופס1, 6.2% פורמלדהיד, 1x מאגרים, 10% גליצרול, ו 0.1% ברומאופנול כחול) אל RNA מיטוכונדריאלי מוכן בשלבים 3.1 – 3.3.
6. הספרות הראשונה לדגם RNA/טעינת מאגר ההעמסה ב-65 ° c עבור 10 דקות, ולאחר מכן להירגע על הקרח במשך 1 דקות.
7. הכינו ג'ל שאינו מבוקר (2% פורמלדהיד, 1.2% agarose, ו-1x מגבים), וטען את התערובת RNA לדוגמה/טעינת מאגר לג (1 – 2 μg RNA מיטוכונדריאלי לכל טוב).
8. הפעל את ג'ל ב-1x מגבים ב 3 – 4 V/cm עבור ~ 4 h.
9. הכינו 2 ליטר של היחידה למען המאה ה -20 (3 מ7.0 0.3). לטפל בזה עם 0.1% DEPC לילה, ולעקר על ידי החיטוי.
10. לשטוף את הג פעמיים ב-20x למטה (15 דקות בכל פעם), ולהעביר ג'ל RNA לקרום ניילון (טבלה של חומרים) על ידי העברת קפילר עם 20x למעלה במשך 10 – 16 h.
11. תקן את ה-RNA לממברנה על ידי אפייה ב 120 ° c עבור 30 דקות.
12. בצע היברידיזציה של RNA וזיהוי אימונוולוגי עם ערכת מסחרית (טבלת חומרים) לפי הוראת היצרן.

11. אפליה של מסתיים ראשי ומעובד 5

1. להפלות את הקצוות הראשוניים והמעובדים של 5 באמצעות השוואת מוצרי cRT-PCR המתקבלים מתוך המערכת המנורמלת והבלתי-מטופלת מסוג 5 המנורמל.
   הערה: לתעתיקים העיקריים, השפע של מוצרי ה-PCR מתוך 5 ' פוליפהוספטאז-RNA מטופל הרבה יותר גבוה מאשר מעמיתו שאינו מטופל (איור 1, ' גן א, ' ואיור 4a). עם זאת, כדי לעבד את התעתיקים, רמה דומה של מוצרי PCR תהיה מוגברת משתי קבוצות של RNAs מיטוכונדריאלי (איור 1, ' ג'ין B ').
2. . מבוסס על תוצאות מיפוי ה-cRT-PCR
3. בדוק את תוצאות האפליה של ה-cRT-PCR על-ידי RT-qPCR.
   הערה: שני דגימות ה-Dna הנגזרות 5 ' פוליפהוספטאז, RNAs מטופלים שאינם מטופלים הם מנורמל על ידי מוצרים RT-qPCR של 26S בוגרת rRNA.

תוצאות

הערכה של יעילות מיטוכונדריזה של RNA

במחקר קודם, שניהם RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי שימשו עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי termini ב arabidopsis (arabidopsis thaliana), ושני סוגים של rnas נתן תוצאות מיפוי דומה¹². בתחילה, השתמשנו ג...

Discussion

במחקר קודם, RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי מתרבות ההשעיה של התאים של Arabidopsis שימשו כדי למפות תעתיק מיטוכונדריאלי termini על ידי CRT-PCR, ותוצאות דומות הושגו¹². עם זאת, רק RNA מיטוכונדריאלי מועשר שימש למיפוי תעתיק מיטוכונדריאלי טרמיני במחקרים רבים אחרים^1,2

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Aladdin, China	A112880	To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid	Sigma-aldrich, USA	V900134	For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose	Biowest, Spain	9012-36-6	To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin	Sigma-aldrich, USA	A1933	For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue	Sigma-aldrich, USA	B8026	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit	Roche, USA	12039672910	For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	For preparation of wash buffer
Gel documentation system	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	To image the agarose gel
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x)	Solarbio,. China	G8142	DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane	Amersham Biosciences, USA	RPN119	For Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	For preparation of extraction buffer
KOH	Aladdin, China	P112284	For preparation of extraction buffer
L-cysteine	Sigma-aldrich, USA	V900399	For preparation of extraction buffer
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	To filter the ground kernel tissues
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	For RNA concentration and purity assay
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector	TransGen Biotech, China	CB111	Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase	Vazyme, China	P505	DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase	Takara, Japan	2690	To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase	Epicentre, USA	RP8092H	To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor	New England Biolabs, UK	M0314	A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate	Sigma-aldrich, USA	V900212	For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride	Sigma-aldrich, USA	V900058	To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate	Sigma-aldrich, USA	221368	For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit	Tiangen Biotech, China	DP209	To purify DNA fragments from agarose gel
Tris	Aladdin, China	T110601	To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent	Invitrogen, USA	15596026	To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit	Tiangen Biotech, China	DP214	To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis