使用基于循环 RT-PCR 的策略对玉米 Mitochondrion 中初级和已处理转录的区分和映射

摘要

通过结合循环RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'聚磷酸酶处理和北方斑点,提出了基于RT-PCR的循环RT-PCR策略。该协议包括一个标准化步骤,以尽量减少不稳定5'三磷酸酯的影响,它适用于对玉米线粒体中稳定积累的初级和加工转录转录进行鉴别和映射。

摘要

在植物线粒体中,一些稳态转录本具有从转录启动(主转录)衍生的5'三磷酸盐,而其他含有5'单磷酸盐产生的转录后(处理转录)。为了区分这两种类型的成绩单,已经制定了几种策略,其中大多数取决于存在/缺少5'三磷酸盐。然而,小学5年级的三磷酸盐是不稳定的,它阻碍了对两种类型的抄本的明显区分。为了系统地区分和绘制玉米线粒体中稳定积累的初级和加工转录本,我们开发了基于CRT-PCR(cRT-PCR)的循环RT-PCR(cRT-PCR)策略,将cRT-PCR、RNA 5'多磷酸酶处理、定量RT-PCR (RT-qPCR) 和北方污点。作为改进,该策略包括RNA正常化步骤,以尽量减少不稳定的5'三磷酸盐的影响。

在此协议中,富集线粒体RNA由RNA 5'聚磷酸酶预处理,将5'三磷酸酯转化为单磷酸盐。经过循环和逆转录后,从5'聚磷酸酶处理和未处理RNA衍生的两种cDNA由玉米26S成熟rRNA归一化,其加工为5'结束,对5'聚磷酸酶不敏感。规范化后,通过比较从处理过的和未经处理的RNA获得的cRT-PCR和RT-qPCR产物,对初级和加工的转录本进行区分。转录端验通过cRT-PCR产物的克隆和测序确定,然后由北方印块验证。

通过采用这一策略,确定了玉米线粒体中大多数稳态记录。由于一些线粒体基因的转录模式复杂,一些稳态转录图没有被区分和/或映射,尽管它们是在北方的污点中检测到的。我们不确定此策略是否适合在其他植物线粒体或石膏中区分和映射稳态记录。

引言

在植物线粒体中,许多成熟和前体RNA作为多种等形体积累,稳定状态转录法可以根据其5'末端1、2、3的差异被分成两^{组。 4}.主转录有5'三磷酸盐末端,从转录启动派生。相比之下,经过处理的转录本具有5'单磷酸盐,通过转录后处理产生。两种类型的转录本的鉴别和映射对于解开转录和转录结束成熟的分子机制非常重要。

为了区分植物线粒体的主要转录和加工记录,已经开发了四个主要策略。第一种策略是用烟草酸焦磷酸酶(TAP)预处理线粒体RNA,将5'三磷酸盐转化为单磷酸盐,并使初级转录本通过RNA连带循环。然后通过快速扩增cDNA端(RACE)或圆形RT-PCR(cRT-PCR)2、3、4,比较TAP处理和未处理RNA样本的转录量。在第二种策略中,处理的转录本首先从线粒体RNA中耗尽,使用终结器5'-磷酸盐依赖外糖酶(TEX),然后通过引世扩展分析5,6映射所剩的主要转录本.第三种策略是使用甘蓝转移酶预盖初级转录,然后三磷酸盐5'termini的位置由引基延伸与核糖酸酶或S1核酸酶保护分析7,8确定 ^,9.与基于5'三磷酸的存在/不存在的不同,第四种策略结合了体外转录、位点定向诱变和引物延伸分析,以表征启动子并确定转录启动站点8,^10,11。通过使用这些策略,许多主要和经过处理的转录本在植物线粒体中已经确定。

然而,一些研究报告说,原发转录的5'三磷酸盐是不稳定的,他们很容易转换为单磷酸盐不明的原因2,4,12,13。这个问题阻碍了对两种类型的成绩单的明确区分,因为使用技术取决于存在/缺少 5' 三磷酸,以及以前在工厂中系统地区分初级记录和加工抄本的努力线粒体失败2,12。

在此协议中,我们将cRT-PCR、RNA 5'聚磷酸酶处理、RT-qPCR和北方斑点相结合,系统地区分玉米(ZeaMays)线粒体中稳态积累的初级和加工转录(图1)。cRT-PCR允许同时映射RNA分子的5'和3'的四肢,它通常适应在植物2,12,14,15的图谱抄本术语。RNA 5' 聚磷酸酶可以从三磷酸盐5'特尼中去除两种磷酸盐,这使得主转录本可用于RNA连结酶的自我结扎。先前的研究表明,玉米中成熟的26S rRNA已经加工了5'终点,对RNA5'聚磷酸酶1,16)不敏感。为了将不稳定的三磷酸盐对原发5'特尼的影响降至最低,5'聚磷酸酶处理和未处理RNA通过成熟的26S rRNA进行归一化,然后通过比较来区分原发和加工的转录本。从两个RNA样本中获得的cRT-PCR产物。cRT-PCR映射和鉴别结果分别由北方印子和RT-qPCR验证。最后,使用替代引液来放大在北方污点中检测到的转录本,而不是通过cRT-PCR检测到的。通过这种基于cRT-PCR的策略,对玉米线粒体中大多数稳态转录被区分和映射^为1。

研究方案

1. 底漆设计

1. 根据引物设计的一般^规则,使用PCR引物设计软件(材料表)设计逆转录(RT)基因专用引物。
   注:RT 引录对目标转录本非常具体,它们通常固定在编码序列的 5' 部分(成熟的 mRNA 和前体 RNA),或预计的 5' 端 (18S 和 26S rRNA)的下游 ±500–600 nt。
2. 设计发散引基对,通过cRT-PCR放大循环转录。
   注:成对发散引引在循环转录本的5'-3'结侧侧,它们的位置因分析的目标转录本而异(图S1)。有些成绩单有很长的 UtR;例如,nad2-1 5' UTR 和rps4-1 3' UTR 分别为 1,985 和 1,826/1,834 nt,分别为¹。如果两个引录都固定在编码区域上,则很难放大目标脚本。相比之下,一些 RR 是短的;例如,nad2 -1 和 nad4-1 的 3' TR 分别为 34/35 和 29–31 nt,分别为¹。如果配对引注位于远离编码序列的位置,PCR 将失败。通常,为每个目标转录本设计了两对发散底漆,而可能需要多对来映射成绩单模式复杂和/或 RR 很长的脚本。
3. 设计收敛底漆对,为北方斑点制备RNA探针。
   注:成对引基位于目标基因的编码区域,PCR 产品的大小应在 100 到 1,000 bp 之间。每个正向引力应包含一个限制性酶位点,以尽量减少结果探针中的载体序列。

2.从玉米开发内核制备粗米松

1. 用高压灭菌器消毒虫子、砂浆、玻璃漏斗、管子和吸头,并在烤箱中干燥。
2. 在 4°C 或冰上执行所有程序,并预冷却所有溶液。
3. 准备100 mL的萃取缓冲液(EB),由0.3M蔗糖、5mM四磷酸钠、10mM KH₂PO 4、2mM EDTA、1%[w/v] 聚苯丙酮40、1%[w/v]牛血清白蛋白、5 mM L-半胱氨酸和20mM抗坏血酸组成。使用 KOH 调节至 pH 7.3,并通过过滤进行消毒。
4. 准备 100 mL 的洗涤缓冲液 (WB),包括 0.3 M 蔗糖、1 mM EGTA 和 10 mM MOPS(3-(N-变形)丙烷硫酸。使用 NaOH 调节至 pH 7.2,并通过过滤进行灭菌。
   注:建议使用DEPC处理的去离子化H2 O制备EB和WB。
5. 在授粉后11~20天收集20g开发内核(DAP)至放置在冰上的50mL管,然后将内核转移到预冷却砂浆中。
   注:使用 EB 的 100 mL 与 20 g 玉米内核的比率。
6. 在每个砂浆中加入10~20mL的冰冷的EB,并完全研磨内核。
7. 添加更多EB,并通过两层过滤布过滤地面组织(材料表)。
8. 将滤液在 8,000 x g下离心 10 分钟,然后丢弃颗粒。
9. 将上清液转移到新管中,并在 20,000 x g下离心 10 分钟。
10. 倒入上清液,并在 6 mL WB 中重新悬浮颗粒。
11. 将悬浮液与5个1.5 mL无RNase管分离,并在14,000 x g下离心5分钟。
12. 丢弃上清液,将线粒颗粒冻结在液氮中,并储存在-80°C。

3. 线粒体RNA的提取

1. 根据制造商的说明,用商业试剂(材料表)提取线粒体RNA。
   警告:此试剂含有苯酚和瓜尼丁等子黄素。在烟罩中使用,并戴上实验室外套和手套。
2. 在DEPC处理的脱离子H2 O中溶解分离的线粒体RNA,用分光光度计(材料表)估计RNA的浓度和纯度。
   注:一般来说,从20克15-DAP玉米核获得±250 μg线粒体RNA。
3. 制备一种由1xTAE缓冲液(40mMTris,20mM醋酸,1mM EDTA)、1.5%角胶(材料表)和1x核染色染料(材料表)组成的角胶凝胶。
4. 加入适当的体积10倍加载缓冲液(0.5%溴酚蓝,0.5%二甲二醇FF和50%甘油),并在1.5%琼脂凝胶上加载线粒体RNA/加载缓冲液混合物。
5. 在 5⁄6 V/cm 下运行凝胶,在 5⁄6 V/cm 下运行 20⁄25 分钟,并通过使用凝胶文档系统(材料表)对凝胶进行成像来评估线粒体 RNA 完整性。
   注:玉米线粒体26S和18S rRNA分别存在两个不同的带(分别为±3,510和1,970 nt)是完整线粒体RNA的可接受标准。为了排除可能的降解,在循环RNA制备的多个步骤中应研究RNA完整性(图2)。

4. RNA 5'聚磷酸酶处理

1. 设置RNA 5' 聚磷酸酶 (表和材料) 处理 (表 1), 并在 37°C 孵育 30-60 分钟.
2. 根据制造商的说明,使用RNA纯化试剂盒(材料表)回收5'聚磷酸酶处理的RNA。
3. 重复步骤 3.3 到 3.5。

5. RNA循环

1. 使用相同量的5'聚磷酸酶处理和未经处理的线粒体RNA(表2),在16°C孵育两种反应12-16小时。
2. 使用步骤 4.2 中相同的套件恢复两组自连结 RNA。
   注:应该注意的是,只有一小部分线粒体RNA会自结,而回收的RNA将是线性和循环转录的混合物。
3. 重复步骤 3.3 到 3.5。

6. 反向转录

1. 从相同数量的5'聚磷酸酶处理和未经处理的RNA(200 ng)中合成两组cDNA。
2. 通过添加 26S-CRT 的相等比率和最多 7 个其他 RT 引物来制备引物混合物。
   注:引体混合物的最终浓度应为1μM。
3. 通过结合表3中列出的试剂制备两种预混合物,在65°C孵育5分钟,然后在冰上冷却2分钟。
4. 组装两个RT反应系统(表4),并在42°C孵育50分钟。
5. 在70°C加热两种RT反应5分钟,然后在冰上冷却。

7. 规范化

1. 通过添加从5'聚磷酸酶处理或未经处理的RNA衍生的相同体积的模板cDNA,在5'-3'的圆形26S rRNA(即26S-CF1和-CR1)的5'-3'结侧,以发散的引物(表5)等,准备两种PCR反应。
2. 在表6中描述的条件下,在热循环器(材料表)中运行两种反应。
3. 制备一种由1x TAE缓冲液、1.0%角胶和1x核染色染料组成的角胶凝胶。
4. 在两种PCR产品中各加入2μL 10x加载缓冲液(0.5%溴酚蓝、0.5%二甲二醇FF和50%甘油),并将其加载到凝胶上。
5. 以 5⁄6 V/cm 的 1x TAE 缓冲液运行凝胶 30-40 分钟,并使用步骤 3.5 相同的凝胶文档系统进行成像。
6. 使用计算机软件(材料表,图4A)比较两种PCR产品的丰度,并在必要时通过更改模板cDNA的数量来优化规范化。

8. PCR 放大

1. 通过添加适当体积的标准化 cDNA 和一对在目标转录本的 5'-3' 结侧翼发发引物,准备 PCR 反应对(表 7)。
   注:用于PCR扩增目标转录本的模板cDNA量由26S rRNA规范化结果确定。
2. 根据表8中描述的程序执行PCR反应。
3. 重复步骤 7.3 到 7.5。
4. 更改为嵌套发散引注,并通过重复步骤 8.1 和 8.2 验证第一轮 PCR 结果。
5. 重复步骤 7.3 到 7.5。
6. 使用凝胶DNA恢复试剂盒(材料表)恢复可在两轮PCR扩增中重复的突出带。

9. 确定笔录特尼

1. 使用标准技术将凝胶纯化的PCR产品克隆成钝端载体(材料表)。
2. 执行菌落 PCR 以选择包含目标插入的阳性克隆,并将其进行商业顺序排列。
   注:包含可变大小的插入物的正克隆通常从单个恢复的波段检测,因为植物线粒体中的许多稳态转录本具有异构性 5' 和/或 3' 结束^1,12。
3. 使用国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部对齐搜索工具(BLAST),将测序数据与玉米线粒体基因组对齐。选择有机体"玉米(分类:4577)",并搜索数据库"核苷酸收集(nr/nt)"。
4. 找到循环抄录的5'-3'结点,并确定5'和3'成绩单的终点位置。
5. 计算目标成绩单的大小。

10. 通过RNA凝胶布洛杂交验证cRT-PCR映射结果

注:RNA凝胶体杂交是通过使用商业试剂盒(材料表)进行的,该试剂包含用于用二角性金(DIG)和T7RNA聚合酶转录RNA的试剂,杂交和免疫学检测。有关详细信息,请参阅本工具包中提供的协议。确保整个过程只使用无RNase设备。

1. 放大用于制备RNA探针的DNA片段,并将其克隆到与步骤9.1相同的载体,该载体包含插入位点上游的T7启动子17bp。
2. 使用适当的限制性酶对构造进行线性化,通过DNA纯化试剂盒(材料表)恢复线性质粒,并将其溶解在DEPC处理的去离子化H2O中。
3. 根据制造商的说明,通过商业套件(材料表)使用 DIG-11-UTP 标记 RNA 探针。
4. 使用 DEPC 处理的去离子 H₂O 调节至 pH 7.0,通过过滤进行灭菌,制备 500 mL 的 10x MOPS 缓冲液(0.2M MOPS、50 mM 醋酸钠和 10 mM EDTA)。
5. 在步骤3.1~3.3中制备的线粒体RNA中加入2~3卷的加载缓冲液(50%形式酰胺、6.2%甲醛、1x MOPS、10%甘油和0.1%溴酚蓝)。
6. 在65°C下变性RNA样品/加载缓冲混合物10分钟,然后在冰上冷却1分钟。
7. 制备变性琼脂糖凝胶(2%甲醛、1.2%琼脂糖和1x MOPS),并将RNA样品/加载缓冲混合物加载到凝胶中(每口1⁄2微克线粒体RNA)。
8. 以 3⁄4 V/cm 的 3⁄4 V/cm 运行凝胶,工作约 4 小时。
9. 准备 2 L 的 20x SSC(3 M 纳Cl,0.3 M 柠酸钠,pH 7.0)。用0.1%的DEPC过夜,并通过高压灭菌器消毒。
10. 在 20x SSC 中冲洗凝胶两次(每次 15 分钟),并通过毛细管转移到尼龙膜(材料表),使用 20x SSC 进行 10-16 小时处理。
11. 在120°C烘烤30分钟,将RNA固定在膜上。
12. 根据制造商的说明,使用商业试剂盒(材料表)进行RNA杂交和免疫学检测。

11. 对初级和加工5'目的的歧视

1. 通过比较从标准化的5'聚磷酸酶处理和未经处理的RNA中获得的cRT-PCR产物,区分原发和加工的5'端。
   注:在初级记录本中,5'聚磷酸酶处理RNA的PCR产物的丰度远远高于未经处理的对口产品(图1,"基因A"和图4A)。然而,对于加工的转录本,PCR产品的可比水平将从两组线粒体RNA中放大(图1,"GeneB")。
2. 根据cRT-PCR映射结果设计RT-qPCR引基。
3. 通过 RT-qPCR 验证 cRT-PCR 鉴别结果。
   注:从5'聚磷酸酶处理和未处理RNA中提取的两个cDNA样本由26S成熟rRNA的RT-qPCR产物归一化。

结果

线粒体RNA循环效率估计

在以前的研究中,总和线粒体RNA都用于cRT-PCR映射线粒体转录在阿拉伯拉多普西斯(阿拉伯拉多普西斯)的线粒体转录终点,两种类型的RNA给出了类似的映射结果12。最初,我们还使用总RNA在玉米中线粒体转录终点的cRT-PCR映射。经过多次试验,我们发现目标记录很难被?...

讨论

在先前的研究中,利用阿拉伯多普西细胞悬浮培养的组蛋白和线粒体RNA,用cRT-PCR绘制线粒体转录终点,结果相似,获得12.然而,在许多其他研究中,只有富集线粒体RNA被用于绘制线粒体转录终点尼的图^谱。研究发现,线粒体RNA的富集是玉米中线粒体转录终点的cRT-PCR映射的重要一步。在?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Aladdin, China	A112880	To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid	Sigma-aldrich, USA	V900134	For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose	Biowest, Spain	9012-36-6	To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin	Sigma-aldrich, USA	A1933	For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue	Sigma-aldrich, USA	B8026	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit	Roche, USA	12039672910	For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	For preparation of wash buffer
Gel documentation system	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	To image the agarose gel
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x)	Solarbio,. China	G8142	DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane	Amersham Biosciences, USA	RPN119	For Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	For preparation of extraction buffer
KOH	Aladdin, China	P112284	For preparation of extraction buffer
L-cysteine	Sigma-aldrich, USA	V900399	For preparation of extraction buffer
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	To filter the ground kernel tissues
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	For RNA concentration and purity assay
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector	TransGen Biotech, China	CB111	Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase	Vazyme, China	P505	DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase	Takara, Japan	2690	To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase	Epicentre, USA	RP8092H	To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor	New England Biolabs, UK	M0314	A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate	Sigma-aldrich, USA	V900212	For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride	Sigma-aldrich, USA	V900058	To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate	Sigma-aldrich, USA	221368	For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit	Tiangen Biotech, China	DP209	To purify DNA fragments from agarose gel
Tris	Aladdin, China	T110601	To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent	Invitrogen, USA	15596026	To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit	Tiangen Biotech, China	DP214	To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis