원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

요약

우리는 원형 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제 처리 및 북부 블롯을 결합하여 원형 RT-PCR 기반 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 정규화 단계를 포함하며, 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 데 적합하다.

초록

식물 미토콘드리아에서, 몇몇 정상 상태 전사체는 전사 개시 (1 차 적인 전사체)에서 파생된 5' 삼인산염이 있고, 그 외는 5' 단인산염 생성 후 전사 (처리된 전사)를 포함합니다. 성적 증명서의 두 가지 유형을 구별하기 위해, 몇 가지 전략이 개발되었으며, 그들 대부분은 5 '삼인산염의 존재 / 부재에 따라 달라집니다. 그러나, 1 차 5'termini에 있는 삼인산염은 불안정하고, 녹취록의 2개의 모형의 명확한 차별을 방해합니다. 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 차별화하고 매핑하기 위해 cRT-PCR, RNA 5' 폴리포슈파타제 처리, 정량적 을 결합하여 원형 RT-PCR(cRT-PCR) 기반 전략을 개발했습니다. RT-PCR(RT-qPCR) 및 북부 블롯. 개선으로, 이 전략은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 RNA 정규화 단계를 포함한다.

이 프로토콜에서 농축 된 미토콘드리아 RNA는 RNA 5 '폴리포스파타제에 의해 전처리되어 5'삼중산염을 모노포스페이트로 변환합니다. 순환화 및 역전사 후, 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA는 5' 말단을 처리하고 5' 폴리포스파타제에 민감하지 않은 옥수수 26S 성숙한 rRNA에 의해 정규화된다. 정규화 후, 1차 및 처리된 전사체는 처리된 RNA로부터 수득된 cRT-PCR 및 RT-qPCR 제품을 비교하여 차별된다. 전사체 테르미니는 cRT-PCR 제품의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 결정된 다음, 북부 블롯에 의해 검증된다.

이 전략을 사용 하 여, 옥수수 미토 콘 드리 온에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서 결정 되었습니다. 일부 미토콘드리아 유전자의 복잡한 전사체 패턴으로 인해, 몇몇 정상 상태 전사체는 북부 얼룩에서 검출되었지만 분화 및/또는 매핑되지 않았습니다. 우리는 이 전략이 다른 식물 미토콘드리아또는 석고에 있는 정상 상태 전사체를 차별하고 지도로 지도하기에 적당한지 확실하지 않습니다.

서문

식물 미토콘드리아에서, 많은 성숙및 전구체 RNA는 다중 이소형태로 축적되고, 정상 상태 전사체는 그들의 5' 끝에있는 차이에 기초하여 2개의 단으로 분할될 수 있습니다 1,^{2,3, 4}. 1 차적인 전사는 전사 개시에서 파생되는 5' 삼인산염 끝이 있습니다. 대조적으로, 처리된 전사체는 전사 후 처리에 의해 생성된 5' 단인산염을 갖는다. 2가지 유형의 전사체의 차별 및 매핑은 전사 및 전사 말기 성숙의 근본적인 분자 메커니즘을 해명하는 데 중요하다.

식물 미토콘드리아에서 1 차적인 및 가공된 전사체를 구별하기 위하여는, 4개의 중요한 전략이 개발되었습니다. 첫 번째 전략은 5'삼인산염을 모노포스페이트로 변환하고 RNA 리가제에 의해 원형화될 수 있도록 담배 산 열포스파타제(TAP)로 미토콘드리아 RNA를 미리 치료하는 것입니다. TAP 처리 및 비처리 RNA 샘플의 전사체 풍부는 cDNA 말단(RACE) 또는 원형 RT-PCR(cRT-PCR)의 신속한 증폭에 의해 비교된 후 2,^3,4. 두 번째 전략에서, 처리된 전사체는 먼저 터미네이터 5'-인산염 의존성 외핵항 (TEX)을 사용하여 미토콘드리아 RNA로부터 고갈되고, 1차 적인 전사체는 프라이머 확장 분석 5, 6에 의해 매핑됩니다. . 세 번째 전략은 guanylyl 트랜스퍼라제를 사용하여 1차 전사체를 미리 캡을 씌우고, 트리포스피테5'의 위치는 리보누클레아제 또는 S1 뉴클레아제 보호 분석과 함께 프라이머 확장에 의해 결정되는^{7,8 ,9}. 5' 삼인산염의 존재/부재에 따라 다른, 네 번째 전략은 시험관 내 전사, 사이트 지시 돌연변이 발생 및 프라이머 확장 분석을 결합하여 가양성 프로모터를 특성화하고 전사를 결정합니다. 개시 사이트^8,10,11. 이러한 전략을 사용 하 여, 많은 기본 및 처리 된 전사체 식물 미토 콘 드리 아에서 결정 되었습니다.

그러나, 몇몇 연구 결과는 1 차적인 전사체의 5' 삼인산염이 불안정했다는 것을 보고하고, 그(것)들은 알 수 없는 이유 2, 4,^12,13를위해 monophosphate로 쉽게 변환되었다. 이 문제는 5'triphosphate의 존재/부재에 따라 기술을 사용하여 두 가지 유형의 성적 증명서의 명확한 차별을 방해하고, 공장에서 기본 및 처리 된 성적 증명서 를 체계적으로 구별하기위한 이전의 노력 미토콘드리아실패 2,¹².

본 프로토콜에서, 우리는 옥수수에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 구별하기 위해 cRT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제처리, RT-qPCR 및 노던 블롯을 결합한다(그림 1). cRT-PCR은 RNA 분자의 5' 및 3'사지의 동시 매핑을 허용하며, 일반적으로 식물 2,^{12,14,15에서}전사체 termini를 매핑하도록 조정된다. RNA 5' 폴리포스파타제는 트리포스피페테5' 테르미니에서 2개의 인산염을 제거할 수 있으며, 이는 RNA 리가제에 의한 자가 결찰을 위해 1차 전사체를 사용할 수 있게 한다. 이전 연구는 옥수수에서 성숙한 26S rRNA가 5'종기를 처리했다는 것을 보여주었고, RNA 5'polyphosphatase^1,16에민감하지 않았습니다. 1차 5'termini에서 불안정한 삼인산염의 영향을 최소화하기 위해, 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA는 성숙한 26S rRNA에 의해 정규화되고, 1차 및 처리된 전사체는 다음을 비교하여 분화됩니다. 2개의 RNA 샘플로부터 수득된 cRT-PCR 제품. cRT-PCR 매핑 및 판별 결과는 각각 노던 블롯과 RT-qPCR에 의해 검증됩니다. 마지막으로, 대체 프라이머는 cRT-PCR에 의해서가 아니라 북부 블롯에서 검출된 전사체를 증폭시키는 데 사용된다. 이 cRT-PCR 기반 전략을 사용하여, 옥수수 미토콘드리아에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서는 차별화되고 매핑^된1.

프로토콜

1. 프라이머 디자인

1. PCR 프라이머 설계 소프트웨어(표오브 머티리얼)를이용하여 역전사(RT)를 위한 유전자 특이적 프라이머를 프라이머^{설계(17)의}일반적인 규칙에 기초한다.
   참고: RT 프라이머는 표적 전사체에 매우 특이적이며, 이들은 일반적으로 5' 코딩 서열(성숙한 mRNA 및 전구체 RNA) 또는 예상된 5' 말단(18S 및 26S rRNA)의 ~500-600 nt 다운스트림에 고정된다.
2. cRT-PCR에 의해 원형 전사체를 증폭하기 위해 서로 다른 프라이머 쌍을 설계합니다.
   참고: 쌍이 짝이 된 발산 프라이머는 원형 전사체의 5'-3' 접합을 측면에 있으며, 그들의 위치는 분석된 표적 전사체들 사이에서 다양합니다(그림 S1). 일부 성적 증명서에는 긴 UTR이 있습니다. 예를 들어 nad2 -1 5' UTR 및 rps4-1 3' UTR은 각각 1,985 및 1,826/1,834 nt입니다. 두 프라이머가 코딩 영역에 고정되어 있는 경우 대상 전사체를 증폭하기가 어렵습니다. 대조적으로, 일부 UTR은 짧습니다; 예를 들어 nad2-1 및 nad4-1의3' UTR은 각각 34/35 및29-31 nt입니다. 페어링된 프라이머가 코딩 시퀀스에서 멀리 떨어져 있으면 PCR이 실패합니다. 일반적으로, 발산 프라이머의 두 쌍은 각 표적 전사체를 위해 설계되고, 여러 쌍은 성적 증명서 패턴이 복잡하고/또는 UTR이 매우 긴 사람들을 매핑하는 데 필요할 수 있습니다.
3. 수렴 프라이머 쌍을 설계하여 북부 블롯에 대한 RNA 프로브를 준비합니다.
   참고: 쌍프라이머는 표적 유전자의 코딩 영역에 위치하며, PCR 생성물의 크기는 100~ 1,000 bp의 범위여야 한다. 각 순방향 프라이머는 생성된 프로브에서 벡터 서열을 최소화하기 위해 제한 효소 부위를 포함해야 한다.

2. 옥수수 개발 커널에서 조잡한 미토콘드리온의 준비

1. 오토클레이브로 유봉, 박격포, 유리 깔때기, 튜브 및 팁을 살균하고 오븐에서 건조시면 됩니다.
2. 4°C 또는 얼음에서 모든 절차를 수행하고 모든 용액을 미리 식힙니다.
3. 0.3 M 수크로오스, 5 mM 테트라나트륨 파이로포스페이트, 10 mM KH₂PO 4,2 mM EDTA, 1% [w/v] 폴리비닐피롤리돈 40, 1% [w/v] 소 혈청 알부민, 5 mM L-se. KOH로 pH 7.3으로 조정하고 여과에 의해 살균하십시오.
4. 0.3 M 수크로오스, 1 mM EGTA 및 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) 프로판설포닉 산으로 구성된 세척 완충제(WB)의 100 mL를 준비합니다. NaOH로 pH 7.2로 조정하고 여과에 의해 살균하십시오.
   참고: DEPC 처리된 탈이온화된 H2 O를 사용하여EB 및 WB를 준비하는 것이 좋습니다.
5. 수분(DAP) 후 11-20일 후에 20g의 커널을 얼음 위에 놓은 50mL 튜브에 넣고 미리 냉각된 모르타르로 커널을 옮니다.
   참고: EB 100 mL에서 옥수수 커널 20g의 비율을 사용합니다.
6. 각 박격포에 10-20 mL의 얼음 차가운 EB를 추가하고 커널을 완전히 갈아냅니다.
7. EB를 더 추가하고 두 층의 필터 천(재료표)을 통해 접지 조직을 필터링합니다.
8. 10 분 동안 8,000 x g의 여과액을 원심 분리하고 펠릿을 버립니다.
9. 상급을 새 튜브로 옮기고 원심분리기를 20,000 x g에서 10분 동안 합니다.
10. 상급체를 붓고 6 mL WB에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
11. 5 개의 1.5 mL RNase 없는 튜브에 현탁액을 알리쿼트하고 5 분 동안 14,000 x g에서 원심 분리합니다.
12. 상류액을 버리고, 미토콘드리아 펠릿을 액체 질소에 얼린 다음 -80°C에서 보관합니다.

3. 미토콘드리아 RNA 추출

1. 제조의 지시에 따라 상업용 시약(재료표)으로 미토콘드리아 RNA를 추출하십시오.
   주의 사항: 이 시약에는 페놀과 구아니딘 이소티오차네이트가 함유되어 있습니다. 연기 후드에 함께 작업하고 실험실 코트와 장갑을 착용하십시오.
2. DEPC 처리된 탈이온화 H2O에서 단리된미토콘드리아 RNA를 용해시키고, 분광광도계(표오브물질)로 RNA 농도 및 순도를 추정한다.
   참고: 일반적으로~ ~250 μg 미토콘드리아 RNA는 15-DAP 옥수수 커널 20 g으로부터 수득된다.
3. 1x TAE 버퍼(40 mM Tris, 20 mM 아세트산, 1mM EDTA), 1.5% 아가로즈(재료표) 및 1x 핵 염색 염료(재료표)로 구성된 아가로즈 젤 1개를 준비합니다.
4. 10x 로딩 버퍼(0.5% 브로모페놀 블루, 0.5% 자일렌 시안노 FF 및 50% 글리세롤)의 적절한 부피를 추가하고 1.5% 아가로즈 겔에 미토콘드리아 RNA/로딩 버퍼 혼합물을 로드합니다.
5. 겔을 5-6 V/cm에서 20-25분 동안 1x TAE 버퍼로 실행하고, 겔 문서화 시스템(재료 표)으로 겔을 이미징하여 미토콘드리아 RNA 무결성을 평가합니다.
   참고: 2개의 별개의 밴드 (~3,510 및 ~1,970 nt옥수수 미토콘드리아 26S 및 18S rRNAs에 대한)의 존재는 손상되지 않은 미토콘드리아 RNA에 대한 허용 가능한 표준이다. 가능한 분해를 배제하기 위해, RNA 무결성은 순환화된 RNA 제제의 여러 단계 동안 조사되어야 한다(그림 2).

4. RNA 5' 폴리포스파타제 치료

1. RNA 5' 폴리포스파타제(표및재료) 처리(표 1)를 설정하고 37°C에서 30-60분 동안 배양한다.
2. 제조사의 지시에 따라 RNA 정제 키트(재료 표)로 5' 폴리포스파타제 처리 RNA를 회수합니다.
3. 3.3단계에서 3.5단계반복합니다.

5. RNA 순환화

1. 5' 폴리포스파타제 처리 및 비처리 미토콘드리아 RNA(표 2)의 동일한 양을사용하여 두 개의 원형 반응을 준비하고, 12-16시간 동안 16°C에서 두 반응을 배양한다.
2. 4.2단계에서와 동일한 키트를 사용하여 두 세트의 자가 결찰 RNA를 복구합니다.
   참고: 미토콘드리아 RNA의 일부만이 자가 결찰되고, 회수된 RNA는 선형 및 순환화된 전사체의 혼합물일 것이라는 점에 유의해야 한다.
3. 3.3단계에서 3.5단계반복합니다.

6. 역전사

1. 동일한 양의 원형화된 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA(200 ng)에서 2세트의 cdNAs를 합성합니다.
2. 26S-CRT와 최대 7개의 다른 RT 프라이머의 동일한 비율을 추가하여 프라이머 혼합물을 준비합니다.
   참고: 프라이머 혼합물의 최종 농도는 1 μM이어야 한다.
3. 표3에 열거된 시약을 조합하여 2개의 프리믹스를 준비하고, 65°C에서 5분 동안 배양한 다음, 2분 동안 얼음에 식힌다.
4. 두 개의 RT 반응시스템(표 4)을 조립하고 42°C에서 50분 동안 배양합니다.
5. 두 RT 반응을 70°C에서 5분 간 가열한 다음 얼음에서 식힙니다.

7. 정상화

1. 5' 폴리포스파타스 처리 또는 비처리 RNA로부터 유래된 템플릿 cDNA의 동일한 부피를 추가하여 두 개의 PCR 반응을 준비하였고, 5'-3' 원형26S rRNA의 접합부(즉, 26S-CF1및 -CR1) 등을 측면에 있는 발산 프라이머를 나타낸다(표 5).
2. 표6에 설명된 조건하에서 열 사이클러(재료 표)에서 두 반응을 실행합니다.
3. 1x TAE 완충제, 1.0% 아가로즈 및 1x 핵 염색 염료로 구성된 아가로즈 젤 1개를 준비합니다.
4. 2 μL 10x 로딩 버퍼(0.5% 브로모페놀 블루, 0.5% 자일렌 시안액 FF 및 50% 글리세롤)를 두 PCR 제품 각각에 넣고 젤에 로드합니다.
5. 젤을 5-6V/cm에서 30-40분 동안 1x TAE 버퍼로 실행하고 3.5단계와 동일한 젤 문서 시스템을 사용하여 이미지화합니다.
6. 컴퓨터 소프트웨어(재료표,그림 4A)를 사용하여 두 PCR 제품의 풍부도를 비교하고 필요한 경우 템플릿 cdnAs의 양을 변경하여 정규화를 최적화합니다.

8. PCR 증폭

1. 정규화된 cdNAs의 적절한 부피와 표적 전사체의 5'-3' 접합을 측면으로 하는 한 쌍의 발산 프라이머를 추가하여 PCR 반응 쌍을 준비한다(표 7).
   참고: 표적 전사체의 PCR 증폭에 사용되는 템플릿 cDNAs의 양은 26S rRNA 정규화 결과에 의해 결정된다.
2. 표8에 기재된 프로그램에 따라 PCR 반응을 수행한다.
3. 7.3단계에서 7.5단계반복합니다.
4. 중첩된 분산 프라이머로 변경하고 8.1 단계와 8.2 단계를 반복하여 첫 번째 라운드 PCR 결과를 확인합니다.
5. 7.3단계에서 7.5단계반복합니다.
6. 겔 DNA 회수 키트(물자 표)를 이용하여 2회 PCR증폭을 반복할 수 있는 저명밴드를 회수한다.

9. 성적 증명서 테르미니의 결정

1. 표준 기술을 사용하여 젤 정제 된 PCR 제품을무딘 엔드 벡터 (재료 표)로 복제하십시오.
2. 콜로니 PCR을 수행하여 대상 인서트를 포함하는 포지티브 클론을 선택하고 상업적으로 시퀀싱합니다.
   참고: 가변 크기의 인서트를 함유하는 포지티브 클론은 일반적으로 식물 미토콘드리아의 많은 정상 상태 전사체가 이기종 5' 및/또는 3'끝^1,12를갖기 때문에 단일 회수 대역에서 검출된다.
3. 미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)의 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST)를 사용하여 시퀀싱 데이터를 옥수수 미토콘드리아 게놈과 정렬합니다. 유기체 "옥수수 (taxid:4577)"를 선택하고 데이터베이스 "뉴클레오티드 수집 (nr / nt)"을 검색합니다.
4. 원형 전사체의 5'-3' 접합을 찾아, 5' 및 3' 전사체 termini의 위치를 결정한다.
5. 대상 성적표의 크기를 계산합니다.

10. RNA 젤 블롯 혼성화에 의한 cRT-PCR 매핑 결과 검증

참고: RNA 겔 블롯 혼성화는 디곡시게닌(DIG) 및 T7 RNA 폴리머라제, 혼성화 및 면역학적 검출을 이용한 RNA의 전사 라벨링을 위한 시약을 포함하는 상용 키트(TableofMaterials)를 이용하여 수행된다. 자세한 내용은 이 키트에 제공된 프로토콜을 참조하십시오. RNase 무료 장비만 전체 절차에 사용되었는지 확인하십시오.

1. RNA 프로브를 준비하는 데 사용되는 DNA 단편을 증폭시키고, 삽입 부위의 T7 프로모터 17 bp 상류를 포함하는 단계 9.1에서와 동일한 벡터로 복제한다.
2. 적절한 제한 효소를 사용하여 구성을 선형화하고, DNA 정제 키트(TableofMaterials)에 의해 선형화된 플라스미드를 회수하고, DEPC 처리된 탈이온화_H2O에용해시켰다.
3. 제조업체의 지침에 따라 상용 키트(재료 표)에의해 DIG-11-UTP가 있는 라벨 RNA 프로브.
4. DEPC 처리된 탈이온화 H₂O.를 사용하여 10x MOPS 완충액(0.2M MOPS, 50 mM 아세테이트 및 10 mM EDTA)의 500 mL를 준비하고, NaOH에 의해 pH 7.0으로 조정하고, 여과에 의해 살균한다.
5. 단계 3.1-3.3에서 제조된 미토콘드리아 RNA에 2-3부량의 로딩 버퍼(포름아마미드 50%, 포름알데히드 6.2%, MOPS 10%, 글리세롤 10%, 브로모페놀 블루 0.1%)를 추가합니다.
6. RNA 샘플/로딩 버퍼 혼합물을 65°C에서 10분 동안 변성한 다음 얼음에서 1분 동안 식힙니다.
7. 변성 아가로즈 겔(포름알데히드 2%, 아가로즈 1.2%, MOPS 1회)을 준비하고 RNA 샘플/로딩 버퍼 혼합물을 젤(잘 당 1-2 μg 미토콘드리아 RNA)에 로드합니다.
8. ~ 4 시간 동안 3-4 V / cm에서 1 x MOPS에서 젤을 실행합니다.
9. 20x SSC 2 L (3 M NaCl, 0.3 M 구연산나트륨, pH 7.0)을 준비합니다. 하룻밤 동안 0.1 % DEPC로 처리하고 오토 클레이브로 살균하십시오.
10. 젤을 20x SSC(매회 15분)로 2회 헹구고, 젤 RNA를 나일론 멤브레인(재료 표)으로 10-16시간 동안 20x SSC로 모세관 이송하여 옮기세요.
11. 30 분 동안 120 °C에서 베이킹하여 멤브레인에 RNA를 고정시킵니다.
12. 제조사의 지시에 따라 상용 키트(재료표)로 RNA 혼성화 및 면역학적 검출을 수행합니다.

11. 1차 및 처리된 5' 종료의 차별

1. 정규화된 5' 폴리포스파타제 처리 및 비처리 RNA로부터 얻어진 cRT-PCR 제품을 비교하여 1차 및 처리된 5' 말단을 구별한다.
   참고: 1차 전사체에, 5' 폴리포스파타제 처리 RNA로부터의 PCR 생성물의 풍부성은 비처리대응물로부터보다 훨씬 높다(도 1, 'Gene A' 및 도 4A). 그러나, 처리된 전사체에, 유사한 수준의 PCR 생성물은 미토콘드리아 RNA의 두 세트로부터 증폭될 것이다(도1,'유전자 B').
2. cRT-PCR 매핑 결과를 기반으로 RT-qPCR 프라이머를 설계합니다.
3. RT-qPCR에 의한 cRT-PCR 판별 결과를 확인합니다.
   참고: 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA 샘플은 26S 성숙한 rRNA의 RT-qPCR 제품에 의해 정규화된다.

결과

미토콘드리아 RNA 원형화 효율 추정

이전 연구에서, 총 및 미토콘드리아 RNA는 모두 애기장대에서 미토콘드리아 전사체 종단의 cRT-PCR 매핑에 사용되었고(애기장대탈리아나),두 가지 유형의 RNA는 유사한 매핑 결과를^12로주었다. 처음에, 우리는 또한 옥수수에 있는 미토콘드리아 전사체...

토론

이전 연구에서, 애기장대의 세포 현탁물 배양으로부터의 총 및 미토콘드리아 RNA는 cRT-PCR에 의해 미토콘드리아 전사체 종기를 매핑하는데 사용되었고, 유사한 결과를^12로얻었다. 그러나, 농축된 미토콘드리아 RNA만이 많은 다른 연구에서 미토콘드리아 전사체 termini를 맵메이상으로 사용하였으며 1, 2,^3,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Aladdin, China	A112880	To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid	Sigma-aldrich, USA	V900134	For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose	Biowest, Spain	9012-36-6	To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin	Sigma-aldrich, USA	A1933	For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue	Sigma-aldrich, USA	B8026	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit	Roche, USA	12039672910	For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	For preparation of wash buffer
Gel documentation system	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	To image the agarose gel
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x)	Solarbio,. China	G8142	DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane	Amersham Biosciences, USA	RPN119	For Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	For preparation of extraction buffer
KOH	Aladdin, China	P112284	For preparation of extraction buffer
L-cysteine	Sigma-aldrich, USA	V900399	For preparation of extraction buffer
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	To filter the ground kernel tissues
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	For RNA concentration and purity assay
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector	TransGen Biotech, China	CB111	Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase	Vazyme, China	P505	DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase	Takara, Japan	2690	To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase	Epicentre, USA	RP8092H	To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor	New England Biolabs, UK	M0314	A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate	Sigma-aldrich, USA	V900212	For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride	Sigma-aldrich, USA	V900058	To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate	Sigma-aldrich, USA	221368	For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit	Tiangen Biotech, China	DP209	To purify DNA fragments from agarose gel
Tris	Aladdin, China	T110601	To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent	Invitrogen, USA	15596026	To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit	Tiangen Biotech, China	DP214	To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis