Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR

Riepilogo

Vi presentiamo una strategia circolare basata su RT-PCR combinando RT-PCR circolare, RT-PCR quantitativo, trattamento polifosculo DI RNA 5 e macchia settentrionale. Questo protocollo include una fase di normalizzazione per ridurre al minimo l'influenza del tripofatore instabile 5', ed è adatto per discriminare e mappare le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais.

Abstract

Nei mitocondri delle piante, alcune trascrizioni in stato costante hanno 5' triposfato derivato dall'initiazione della trascrizione (trascrizioni primaria), mentre le altre contengono 5' monofofafato generato post-transcriptionally (trascrizioni elaborate). Per discriminare tra i due tipi di trascrizioni, sono state sviluppate diverse strategie e la maggior parte di esse dipende dalla presenza/assenza di 7' triposfato. Tuttavia, il triplofato al termine primario 5' è instabile, e ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni. Per differenziare e mappare sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais, abbiamo sviluppato una strategia circolare basata su RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, trattamento quantitativo dei polifoshpatasi di RNA 5', RT-PCR (RT-qPCR) e Northern blot. Come miglioramento, questa strategia include un passo di normalizzazione dell'RNA per ridurre al minimo l'influenza del tripfosfato unstable 5'.

In questo protocollo, l'RNA mitocondriale arricchito è pre-trattato da RNA 5' polifosforasi, che converte il triphsofato da 5' in monofagofato. Dopo la circolarizzazione e la trascrizione inversa, i due cDNA derivati da 5' RNA trattati con polifofofosi e non trattati sono normalizzati dal mais 26S rRNA maturo, che ha una fine elaborata 5' ed è insensibile a 5' polifosfolasi. Dopo la normalizzazione, le trascrizioni primarie e trasformate vengono discriminate confrontando i prodotti cRT-PCR e RT-qPCR ottenuti dagli RNA trattati e non trattati. La prova di trascrizione è determinata dalla clonazione e dal sequenziamento dei prodotti cRT-PCR e quindi verificata da Northern blot.

Utilizzando questa strategia, sono state determinate la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais. A causa del complicato schema di trascrizione di alcuni geni mitocondriali, alcune trascrizioni a stato costante non sono state differenziate e/o mappate, anche se sono state rilevate in una macchia settentrionale. Non siamo sicuri se questa strategia sia adatta a discriminare e mappare le trascrizioni dello stato costante in altri mitocondri vegetali o in plastidi.

Introduzione

Nei mitocondri vegetali, molti RNA maturi e precursori vengono accumulati come isoformi multipli, e le trascrizioni allo stato costante possono essere divise in due gruppi in base alla differenza alle loro 5 ' estremità^{1,2,3 4}. Le trascrizioni primarie hanno 5' estremità triposphate, che derivano dall'avvio della trascrizione. Al contrario, le trascrizioni elaborate hanno 5' monofafato generato dall'elaborazione post-trascrizione. La discriminazione e la mappatura dei due tipi di trascrizioni sono importanti per svelare i meccanismi molecolari alla base della trascrizione e della maturazione finale della trascrizione.

Per distinguere tra le trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio vegetale, sono state sviluppate quattro strategie principali. La prima strategia consiste nel pretrattare gli RNA mitocondriali con il pirofosofasi acido del tabacco (TAP), che converte il tripfosfato 5' in monofagofato e consente alle trascrizioni primarie di essere circolati dalla ligase dell'RNA. L'abbondanza di trascrizioni di campioni di RNA trattati con TAP e non trattati viene quindi confrontata con una rapida amplificazione delle estremità cDNA (RACE) o RT-PCR circolari (cRT-PCR)^2,3,4. Nella seconda strategia, le trascrizioni elaborate vengono prima esaurite dagli RNA mitocondriali utilizzando l'eonuclease dipendente dal terminator5-fosfatio (TEX), e le trascrizioni primarie rimaste vengono quindi mappate dall'analisi dell'estensione del primer^5,6 . La terza strategia è quella di pre-cap le trascrizioni primarie utilizzando guanylyl transferase, e quindi la posizione di triposphated 5' è determinata dall'estensione primer insieme con ribonuclease o S1 nuclease protection analysis^{7,8 ,9}. A differenza di quelli che dipendono dalla presenza/assenza di 7' triposfato, la quarta strategia combina la trascrizione in vitro, la mutagenesi diretta dal sito e l'analisi dell'estensione del primer per caratterizzare i promotori putativi e determinare la trascrizione siti di avvio^8,10,11. Utilizzando queste strategie, molte trascrizioni primarie ed elaborate sono state determinate nei mitocondri delle piante.

Tuttavia, diversi studi hanno riferito che il trifosfato 5' delle trascrizioni primarie erano instabili, e sono stati facilmente convertiti in monofosfato per motivo sconosciuto^2,4,12,13. Questo problema ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni utilizzando tecniche a seconda della presenza/assenza di trifosfato 5' e precedenti sforzi per distinguere sistematicamente tra le trascrizioni primarie ed elaborate nell'impianto mitocondri fallito^2,12.

In questo protocollo, combiniamo cRT-PCR, trattamento polifosforo RNA 5', RT-qPCR e macchia settentrionale per distinguere sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mais (zea mays) mitocondrion (Figura 1). cRT-PCR consente la mappatura simultanea delle estremità 5' e 3' di una molecola di RNA, ed è di solito adattata alla trascrizione dei termini nelle piante^2,12,14,15. Il polifosforasi di RNA 5' potrebbe rimuovere due fosfati dal termine di 1'trhafated 5', il che rende disponibili le trascrizioni primarie per l'auto-legatura da parte della ligase dell'RNA. Studi precedenti hanno dimostrato che il rRNA 26S maturo nel mais aveva elaborato il capolinea 5', ed era insensibile al polifosculo DI RNA 5 '^1,16. Per ridurre al minimo l'influenza del triposfato instabile ai termini primari 5', i 5' RNA trattati con polifofofofosi e non trattati vengono normalizzati da rRNA 26S maturi, e le trascrizioni primarie ed elaborate vengono quindi differenziate confrontando cRT-PCR ottenuti dai due campioni di RNA. I risultati della mappatura cRT-PCR e della discriminazione sono verificati rispettivamente da Northern blot e RT-qPCR. Infine, i primer alternativi vengono utilizzati per amplificare le trascrizioni rilevate nella macchia settentrionale, ma non da cRT-PCR. Utilizzando questa strategia basata su cRT-PCR, la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais sono state differenziate e mappate¹.

Protocollo

1. Progettazione di Primer

1. Progettare primer gene-specific per la trascrizione inversa (RT) utilizzando il software di progettazione del primer PCR (Table of Materials) in base alle regole generali di primer design¹⁷.
   NOT: I primer RT sono altamente specifici per le trascrizioni di destinazione, e sono generalmente ancorati sulla parte 5' delle sequenze di codifica (mRNA maturi e RNA precursori), o 500-600 nt a valle della fine prevista 5' (18S e 26S rRNA).
2. Progettare coppie di primer divergenti per amplificare le trascrizioni circolari da cRT-PCR.
   NOTA: i primer divergenti accoppiati fiancheggiano la giunzione 5'3' delle trascrizioni circolari e le loro posizioni variano tra le trascrizioni di destinazione analizzate (Figura S1). Alcune trascrizioni hanno UDR lunghe; ad esempio, nad2-1 5' UTR e rps4-1 3' UTR sono 1.985 e 1.826/1.834 nt, rispettivamente¹. Se entrambi i primer sono ancorati all'area di codifica, sarà difficile amplificare le trascrizioni di destinazione. Al contrario, alcuni UTR sono brevi; ad esempio, i 3' UTR di nad2-1 e nad4-1 sono rispettivamente 34/35 e 29–31 nt, rispettivamente¹. Se i primer accoppiati si trovano lontano dalle sequenze di codifica, la PCR avrà esito negativo. Generalmente, due coppie di primer divergenti sono progettati per ogni trascrizione di destinazione, mentre più coppie possono essere necessarie per mappare quelli i cui modelli di trascrizione sono complicati e/o gli UTR sono molto lunghi.
3. Progettare coppie di primer convergenti per preparare sonde di RNA per la macchia settentrionale.
   NOT: I primer accoppiati si trovano sulla regione di codifica del gene bersaglio e la dimensione del prodotto PCR dovrebbe essere compresa tra 100 e 1.000 bp. Ogni primer in avanti deve contenere un sito enzimatico di restrizione per ridurre al minimo le sequenze vettoriali nelle sonde risultanti.

2. Preparazione del mitocondrio grezzo dai kernel in via di sviluppo del mais

1. Sterilizza pestelli, mortai, imbuti di vetro, tubi e punte per autoclave e asciugali in forno.
2. Eseguire tutte le procedure a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio e pre-raffreddare tutte le soluzioni.
3. Preparare 100 mL di buffer di estrazione (EB), composto da 0,3 M di saccarosio, 5 mM di tetrasodium pirofosfato, 10 mM KH₂PO₄, 2 mM EDTA, 1% [w/v] polyvinylpyrrolidone 40, 1% [w/v] bovine serum albumin, 5 mM L-cysteine e 20 mcorm asbica acida. Regolare a pH 7.3 con KOH e sterilizzare per filtrazione.
4. Preparare 100 mL di buffer di lavaggio (WB) composto da 0,3 M di saccarosio, 1 mM EGTA e 10 mM MOPS (3-(N-morpholino)acido proposulfonico). Regolare a pH 7.2 con NaOH e sterilizzare per filtrazione.
   NOT: Si consiglia di preparare EB e WB utilizzando DePC-trattato deionizzato H₂O.
5. Raccogliere 20 g sviluppando kernel a 11-20 giorni dopo l'impollinazione (DAP) a un tubo da 50 mL posto sul ghiaccio, quindi trasferire i chicchi a mortai pre-raffreddati.
   NOT: Utilizzare un rapporto di 100 mL di EB a 20 g di kernel di mais.
6. Aggiungere 10-20 mL di EB ghiacciato ad ogni mortaio e macinare completamente i chicchi.
7. Aggiungere più EB, e filtrare i tessuti del terreno attraverso due strati di panno di filtro (Tabella dei materiali).
8. Centrifugare il filtrato a 8.000 x g per 10 min e scartare il pellet.
9. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo e centrifugarlo a 20.000 x g per 10 min.
10. Versare il supernatante, e risospendere il pellet in 6 mL WB.
11. La sospensione è di cinque tubi da 1,5 mL senza RNase e centrifugarli a 14.000 x g per 5 min.
12. Scartare il supernatante, congelare il pellet mitocondriale in azoto liquido e conservarlo a -80 gradi centigradi.

3. Estrazione di RNA mitocondriale

1. Estrarre l'RNA mitocondriale con un reagente commerciale (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
   ATTENZIONE: Questo reagente contiene fenolo e guanidina isothiocyanate. Lavora con esso in un cappuccio a fume e indossa camice da laboratorio e guanti.
2. Sciogliere l'RNA mitocondriale isolato in DePC-trattato deionizzato H₂O, e stimare la concentrazione di RNA e la purezza con uno spettrofotometro (Tabella dei materiali).
   NOT: In genere, l'RNA mitocondriale di 250 g è ottenuto da 20 g di 15-DAP kernel di mais.
3. Preparare un gel di agarose composto da 1x tampone TAE (40 mM Tris, acido acetico da 20 mM, 1mM EDTA), 1,5% agarose (Tabella deimateriali) e 1x colorante di colorazione nucleare (Tabella dei materiali).
4. Aggiungere un volume appropriato di buffer di carico 10x (0,5% blu bromofenolo, 0,5% xilene cyanol FF e 50% glicerolo), e caricare la miscela di buffer RNA mitocondriale/buffer di carico sul gel di agarose 1,5%.
5. Eseguire il gel in 1x tampone TAE a 5–6 V/cm per 20-25 min e valutare l'integrità dell'RNA mitocondriale immaginando il gel con un sistema di documentazione del gel (Tabella dei materiali).
   NOT: La presenza di due bande distinte (rispettivamente 3.510 e 1.970 NT di mais per 26S e 18S rRNA di mais) è uno standard accettabile per l'RNA mitocondriale intatto. Per escludere una possibile degradazione, l'integrità dell'RNA deve essere studiata durante le molteplici fasi della preparazione dell'RNA circolare (Figura2).

4. RNA 5' Trattamento polifosculo

1. Impostare il trattamento RNA 5' polyphosphatase (Tabella e materiali) ( Tabella1) e incubare a 37 gradi centigradi per 30-60 min.
2. Recuperare l'RNA trattato con polifosfosi da 5' con un kit di purificazione dell'RNA (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
3. Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.5.

5. Circolarizzazione dell'RNA

1. Preparare due reazioni circolarizzazioni utilizzando le stesse quantità di RNA mitocondriali trattati con polifofofofosi e non trattati da 5' e non trattati (Tabella2), e incubare entrambe le reazioni a 16 gradi centigradi per 12–16 h.
2. Recuperare i due set di RNA auto-ligate utilizzando lo stesso kit del passaggio 4.2.
   NOT: Va notato che solo una frazione di RNA mitocondriale sarà auto-migate, e l'RNA recuperato sarà una miscela di trascrizioni lineari e circolari.
3. Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.5.

6. Trascrizione inversa

1. Sintetizzare due serie di cDNA dalle stesse quantità di RNA trattati con polifosfasi da 5' e non trattati (200 ng).
2. Preparare una miscela di primer aggiungendo un rapporto uguale di 26S-CRT e fino a 7 altri primer RT.
   NOT: La concentrazione finale della miscela di primer dovrebbe essere di 1 M.
3. Preparare due pre-miscele combinando i reagenti elencati nella tabella 3, incubare a 65 gradi centigradi per 5 min, quindi raffreddare sul ghiaccio per 2 min.
4. Assemblare due sistemidi reazione RT (tabella 4) e incubarli a 42 gradi centigradi per 50 min.
5. Riscaldare entrambe le reazioni di RT a 70 gradi centigradi per 5 minuti, quindi raffreddarle sul ghiaccio.

7. Normalizzazione

1. Preparare due reazioni PCR aggiungendo lo stesso volume di modello cDNA derivati da 5' RNA trattati con polifofofozosi o non trattati, primer divergenti che fiancheggiano la giunzione 5'-3' di rRNA circolare 26S (cioè 26S-CF1 e -CR1), ecc. (Tabella5).
2. Eseguire le due reazioni in un ciclore termico (Tabella dei materiali) a condizioni descritte nella tabella 6.
3. Preparare un gel di agarose composto da 1x tampone TAE, 1,0% agarose e 1x colorante di colorazione nucleare.
4. Aggiungere 2 buffer di carico l-l 10x (0,5% di bromofenolo blu, 0,5% xilene cyanol FF e 50% glicerolo) a ciascuno dei due prodotti PCR e caricarli sul gel.
5. Eseguire il gel in 1x tampone TAE a 5–6 V/cm per 30-40 min, e immagine utilizzando lo stesso sistema di documentazione gel come passo 3.5.
6. Confrontare l'abbondanza dei due prodotti PCR utilizzando software (Tabella dei materiali, Figura 4A) e ottimizzare la normalizzazione modificando, se necessario, la quantità di cDNA del modello.

8. Amplificazione PCR

1. Preparare coppie di reazioni PCR aggiungendo il volume appropriato dei cDNA normalizzati e una coppia di primer divergenti che fiancheggiano la giunzione 5'-3' delle trascrizioni bersaglio (Tabella 7).
   NOT: La quantità di cDNA modello utilizzata per l'amplificazione PCR delle trascrizioni bersaglio è determinata dai risultati della normalizzazione di rRNA 26S.
2. Eseguire le reazioni PCR secondo il programma descritto nella tabella 8.
3. Ripetere i passaggi da 7.3 a 7.5.
4. Passare a primer divergenti nidificati e verificare i risultati PCR del primo round ripetendo i passaggi 8.1 e 8.2.
5. Ripetere i passaggi da 7.3 a 7.5.
6. Recuperare le bande prominenti che potrebbero essere ripetute in due cicli di amplificazione PCR utilizzando un kit di recupero del DNA gel (Tabella dei materiali).

9. Determinazione del Trascrizione Termini

1. Clonare i prodotti PCR gordati in gel in un vettore smussato (Table of Materials) utilizzando tecniche standard.
2. Eseguite la colonia PCR per selezionare cloni positivi contenenti gli inserti bersaglio e sequenziarli commercialmente.
   NOT: I cloni positivi contenenti inserti di dimensioni variabili sono solitamente rilevati da una singola banda recuperata perché molte trascrizioni a stato costante in ambiente mitocondriale vegetale hanno dimensioni eterogenee 5' e/o 3' estremità^1,12.
3. Allineare i dati di sequenziamento con il genoma mitocondriale del mais utilizzando lo strumento di ricerca di allineamento locale di base (BLAST) del centro nazionale per l'informazione biotecnologica (NCBI). Scegliere organismo "mais (taxid:4577)" e database di ricerca "Raccolta Nucleotide (nr/nt)".
4. Trova la giunzione 5'3' della trascrizione circolare e determina le posizioni dei termini di trascrizione 5' e 3'.
5. Calcolare la dimensione delle trascrizioni di destinazione.

10. Verifica dei risultati della mappatura cRT-PCR mediante l'ibridazione di RNA Gel Blot

NOT: L'ibridazione della macchia di gel di RNA viene eseguita utilizzando un kit commerciale (Tabella dei materiali), che contiene i reagenti per la trascrizione dell'etichettatura dell'RNA con digossigenina (DIG) e Polimerasi rna T7, ibridazione e rilevamento immunologico. Si prega di fare riferimento ai protocolli forniti in questo kit per maggiori dettagli. Assicurarsi che solo RNase attrezzature gratuite viene utilizzato per l'intera procedura.

1. Amplificare il frammento di DNA utilizzato per preparare la sonda dell'RNA e clonarlo sullo stesso vettore del punto 9.1, che contiene un promotore T7 di 17 bp a monte del sito di inserimento.
2. Linearizzare il costrutto utilizzando un enzima di restrizione adeguato, recuperare il plasmide linearizzato con un kit di purificazione del DNA (Tabella dei materiali) e dissolverlo in DePC-trattato deionizzato H₂O.
3. Etichettare le sonde RNA con DIG-11-UTP da un kit commerciale (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
4. Preparare 500 mL di buffer MOPS 10x (0,2 M MOPS, acetato di sodio 50 mM e 10 mM EDTA) utilizzando H₂O. Regolare il pH 7.0 da NaOH e sterilizzare per filtrazione.
5. Aggiungere 2-3 volumi di buffer di carico (50% formamide, 6,2% formaldeide, 1x MOPS, 10% glicerolo e 0,1% di blu bromofenolo) all'RNA mitocondriale preparato nei passaggi 3.1–3.3.
6. Denaturare il campione di RNA/miscela di tampone di carico a 65 gradi centigradi per 10 min, quindi raffreddare sul ghiaccio per 1 min.
7. Preparare un gel di agarose denaturato (2% formaldeide, 1,2% agarose e 1x MOPS) e caricare il campione di RNA/caricamento della miscela di buffer nel gel (1-2 g di RNA mitocondriale per pozzo).
8. Eseguire il gel in 1x MOPS a 3-4 V/cm per 4 h.
9. Preparare 2 L di 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M di citrato di sodio, pH 7.0). Trattarlo con 0,1% DEPC durante la notte e sterilizzare con autoclave.
10. Sciacquare il gel due volte in 20x SSC (15 min ogni volta), e trasferire l'RNA gel a una membrana di nylon (Tabella dei materiali) con bonifico capillare con 20x SSC per 10–16 h.
11. Fissare l'RNA a membrana cuocendo a 120 gradi centigradi per 30 min.
12. Eseguire l'ibridazione dell'RNA e il rilevamento immunologico con un kit commerciale (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.

11. Discriminazione delle estremità primarie ed elaborate 5'

1. Discriminare le estremità primarie ed elaborate 5' confrontando i prodotti cRT-PCR ottenuti dagli RNA normalizzati 5' trattati con polifofofosi e non trattati.
   NOT: Per le trascrizioni primarie, l'abbondanza di prodotti PCR provenienti da 5' RNA trattato con polifosforasi è molto superiore a quella della controparte non trattata (Figura1, "Gene A" e Figura 4A). Tuttavia, per le trascrizioni trattate, un livello comparabile di prodotti PCR sarebbe amplificatodalle due serie di RNA mitocondriali (Figura 1, "Gene B").
2. Progettare i primer RT-qPCR in base ai risultati del mapping cRT-PCR.
3. Verificare i risultati della discriminazione cRT-PCR da parte di RT-qPCR.
   NOT: I due campioni di cDNA derivati da 5' RNA trattati con polifosfozola e non trattati sono normalizzati dai prodotti RT-qPCR di rRNA maturo 26S.

Risultati

Stima dell'efficienza di circolarizzazione dell'RNA mitocondriale

In uno studio precedente, sia gli RNA totali che quelli mitocondriali sono stati utilizzati per la mappatura cRT-PCR della trascrizione mitocondriale termini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) e i due tipi di RNA hanno dato risultati di mappatura simili¹². Inizialmente, abbiamo anche usato RNA totali pe...

Discussione

In uno studio precedente, gli RNA totali e mitocondriali della coltura delle sospensioni cellulari dell'Arabidopsis sono stati utilizzati per mappare i termini trascrizione mitocondriale da cRT-PCR, e risultati simili sono stati ottenuti¹². Tuttavia, solo l'RNA mitocondriale arricchito è stato utilizzato per mappare la trascrizione mitocondriale termini in molti altri studi^1,2,3,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Aladdin, China	A112880	To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid	Sigma-aldrich, USA	V900134	For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose	Biowest, Spain	9012-36-6	To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin	Sigma-aldrich, USA	A1933	For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue	Sigma-aldrich, USA	B8026	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit	Roche, USA	12039672910	For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	For preparation of wash buffer
Gel documentation system	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	To image the agarose gel
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5000x)	Solarbio,. China	G8142	DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane	Amersham Biosciences, USA	RPN119	For Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	For preparation of extraction buffer
KOH	Aladdin, China	P112284	For preparation of extraction buffer
L-cysteine	Sigma-aldrich, USA	V900399	For preparation of extraction buffer
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	To filter the ground kernel tissues
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	For RNA concentration and purity assay
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector	TransGen Biotech, China	CB111	Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase	Vazyme, China	P505	DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase	Takara, Japan	2690	To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase	Epicentre, USA	RP8092H	To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor	New England Biolabs, UK	M0314	A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate	Sigma-aldrich, USA	V900212	For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride	Sigma-aldrich, USA	V900058	To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate	Sigma-aldrich, USA	221368	For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit	Tiangen Biotech, China	DP209	To purify DNA fragments from agarose gel
Tris	Aladdin, China	T110601	To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent	Invitrogen, USA	15596026	To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit	Tiangen Biotech, China	DP214	To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis