Diskrimintion und Mapping der primären und verarbeiteten Transkripte in Mais mitochondrion mit einer kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie, indem wir kreisförmige RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung und Northern Blot kombinieren. Dieses Protokoll enthält einen Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren, und es eignet sich zur Unterscheidung und Kartierung der primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt werden.

Zusammenfassung

In pflanzlichen Mitochondrien enthalten einige stationäre Transkripte 5' Triphosphat, das aus der Transkriptioninitiierung abgeleitet wurde (primäre Transkripte), während die anderen 5' Monophosphat enthalten, das posttranskriptional erzeugt wurde (verarbeitete Transkripte). Um zwischen den beiden Arten von Transkripten zu unterscheiden, wurden mehrere Strategien entwickelt, und die meisten von ihnen hängen von der Anwesenheit/Abwesenheit von 5' Triphosphat ab. Das Triphosphat bei primären 5' Termini ist jedoch instabil und behindert eine klare Diskriminierung der beiden Arten von Transkripten. Um die primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt wurden, systematisch zu differenzieren und abzubilden, haben wir eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie entwickelt, indem wir cRT-PCR, RNA 5' Polyphoshpatase-Behandlung, quantitative RT-PCR (RT-qPCR) und Northern Blot. Als Verbesserung beinhaltet diese Strategie einen RNA-Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren.

In diesem Protokoll wird die angereicherte mitochondriale RNA mit RNA 5' Polyphosphatase vorbehandelt, die 5' Triphsophat in Monophosphat umwandelt. Nach Zirkularisierung und umgekehrter Transkription werden die beiden cDNAs, die aus 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs abgeleitet wurden, durch Mais 26S reife rRNA normalisiert, die ein verarbeitetes 5' Ende hat und unempfindlich gegen 5' Polyphosphatase ist. Nach der Normalisierung werden die primären und verarbeiteten Transkripte durch den Vergleich von cRT-PCR- und RT-qPCR-Produkten aus den behandelten und nicht behandelten RNAs diskriminiert. Die Transkript-Termini werden durch Klonen und Sequenzieren der cRT-PCR-Produkte bestimmt und dann durch Northern Blot überprüft.

Mit dieser Strategie wurden die meisten stationären Transkripte in Maismitochondrion bestimmt. Aufgrund des komplizierten Transkriptmusters einiger mitochondrialer Gene wurden einige stationäre Transkripte nicht unterschieden und/oder kartiert, obwohl sie in einem nördlichen Fleck nachgewiesen wurden. Wir sind nicht sicher, ob diese Strategie geeignet ist, die stationären Transkripte in anderen pflanzenmitochondrien oder in Plastiden zu unterscheiden und abzubilden.

Einleitung

In pflanzlichen Mitochondrien werden viele reife und Vorläufer-RNAs als mehrere Isoformen angesammelt, und die stationären Transkripte können in zwei Gruppen unterteilt werden, basierend auf der Differenz an ihren 5' Enden^{1,2,3, 4}. Die primären Transkripte haben 5' Triphosphatendenden, die aus der Transkriptionioninitiation abgeleitet sind. Im Gegensatz dazu haben die verarbeiteten Transkripte 5' Monophosphat, das durch posttranskriptielle Verarbeitung erzeugt wird. Diskriminierung und Kartierung der beiden Arten von Transkripten sind wichtig, um die molekularen Mechanismen zu entwirren, die der Transkription und Transkriptendreifung zugrunde liegen.

Um zwischen den primären und verarbeiteten Transkripten im pflanzlichen Mitochondrion zu unterscheiden, wurden vier Hauptstrategien entwickelt. Die erste Strategie besteht darin, die mitochondrialen RNAs mit Tabaksäurepyrophosphatase (TAP) vorzubehandeln, die 5' Triphosphat in Monophosphat umwandelt und die Zirkularisierung von Primärtranskripten durch RNA-Ligase ermöglicht. Die Transkriptsfülle von TAP-behandelten und nicht behandelten RNA-Proben wird dann durch schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) oder kreisförmiger RT-PCR (cRT-PCR)^2,3,4verglichen. In der zweiten Strategie werden die verarbeiteten Transkripte zunächst von mitochondrialen RNAs mit Terminator 5'-phosphatabhängiger Exonuklease (TEX) aufgebraucht, und die primären Transkripte werden dann durch Primer-Erweiterungsanalyse^5,6 . Die dritte Strategie besteht darin, die primären Transkripte mit Guanylyltransferase vorab zu begrenzen, und dann wird die Position der triphosphierten 5' Termini durch Primerverlängerung zusammen mit der Ribonuklease- oder S1-Nukleaseschutzanalyse^7,8 bestimmt. ^,9. Anders als je nach Vorhandensein/Abwesenheit von 5'-Triphosphat kombiniert die vierte Strategie In-vitro-Transkription, standortgesteuerte Mutagenese und Primer-Erweiterungsanalyse, um die vermeintlichen Promotoren zu charakterisieren und die Transkription zu bestimmen. Initiationsstandorte^8,10,11. Durch die Verwendung dieser Strategien wurden viele primäre und verarbeitete Transkripte in pflanzlichen Mitochondrien bestimmt.

Mehrere Studien haben jedoch berichtet, dass die 5' Triphosphat der primären Transkripte instabil waren, und sie wurden leicht in Monophosphat aus unbekanntem Grund umgewandelt^2,4,12,13. Dieses Problem verhindert eine klare Diskriminierung der beiden Arten von Transkripten, indem Techniken verwendet werden, die vom Vorhandensein/Fehlen von 5'-Triphosphat abhängen, und frühere Bemühungen, systematisch zwischen den primären und den verarbeiteten Transkripten in Pflanzen zu unterscheiden. mitochondrien fehlgeschlagen^2,12.

In diesem Protokoll kombinieren wir cRT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung, RT-qPCR und Northern Blot, um systematisch die primären und verarbeiteten Transkripte zu unterscheiden, die in Mais (Zea mays) Mitochondrion angesammelt wurden (Abbildung 1). cRT-PCR ermöglicht die gleichzeitige Kartierung von 5' und 3' Extremitäten eines RNA-Moleküls, und es ist in der Regel angepasst, um Transkript-Termini in Pflanzen^2,12,14,15. DIE Polyphosphatase von RNA 5 könnte zwei Phosphate aus dem triphosphatierten 5' Termini entfernen, wodurch die primären Transkripte für die Selbstligation durch RNA-Ligase verfügbar sind. Frühere Studien zeigten, dass reife 26S rRNA in Mais 5' Endstation verarbeitet hatte, und es war unempfindlich gegen RNA 5' Polyphosphatase^1,16. Um den Einfluss von instabilem Triphosphat auf primäre 5' Termini zu minimieren, werden die 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs durch ausgereifte 26S rRNA normalisiert, und die primären und verarbeiteten Transkripte werden dann durch cRT-PCR-Produkte, die aus den beiden RNA-Proben gewonnen wurden. Die CRT-PCR-Mapping- und Diskriminierungsergebnisse werden von Northern Blot bzw. RT-qPCR überprüft. Schließlich werden alternative Primer verwendet, um die Transkripte zu verstärken, die im nördlichen Blot, aber nicht durch cRT-PCR erkannt wurden. Durch die Verwendung dieser cRT-PCR-basierten Strategie wurden die meisten stationären Transkripte in Maismitochondrion differenziert und kartiert¹.

Protokoll

1. Primer Design

1. Entwerfen Sie genspezifische Primer für die Reverse Transkription (RT) mit PCR Primer Design Software (Table of Materials) basierend auf den allgemeinen Regeln des Primer Designs¹⁷.
   HINWEIS: RT-Primer sind sehr spezifisch für die Zieltranskripte und sind in der Regel auf dem 5' Teil der Codierungssequenzen (reife mRNAs und Vorläufer-RNAs) oder 500–600 nt stromabwärts des erwarteten 5'-Ends (18S und 26S rRNAs) verankert.
2. Entwerfen Sie Paare von divergenten Primern, um die kreisförmigen Transkripte durch cRT-PCR zu verstärken.
   ANMERKUNG: Die gepaarten divergierenden Primer flankieren die 5'-3'-Kreuzung der kreisförmigen Transkripte, und ihre Positionen variieren zwischen den analysierten Zieltranskripten (Abbildung S1). Einige Transkripte haben lange UTRs; zum Beispiel sind nad2-1 5' UTR und rps4-1 3' UTR 1.985 bzw. 1.826/1.834 nt bzw.¹. Wenn beide Primer im Codierungsbereich verankert sind, ist es schwierig, die Zieltranskripte zu verstärken. Im Gegensatz dazu sind einige UTRs kurz; Beispielsweise sind die 3' UTRs von nad2-1 und nad4-1 34/35 und 29–31 nt bzw.¹. Wenn sich die gekoppelten Primer weit von den Codierungssequenzen entfernt befinden, schlägt die PCR fehl. Im Allgemeinen sind zwei Paare von divergenten Primern für jedes Zieltranskript entworfen, während mehrere Paare erforderlich sein können, um diejenigen zuzuordnen, deren Transkriptmuster kompliziert sind und/oder UTRs sehr lang sind.
3. Entwerfen Sie Paare konvergenter Primer, um RNA-Sonden für northern blot vorzubereiten.
   HINWEIS: Die gepaarten Primer befinden sich im Kodierungsbereich des Zielgens, und die Größe des PCR-Produkts sollte im Bereich von 100 bis 1.000 bp liegen. Jede Vorwärtsprimer sollte eine Restriktionsenzym-Site enthalten, um Vektorsequenzen in den resultierenden Sonden zu minimieren.

2. Herstellung von Rohmitochondrion aus Mais entwicklungserkerne

1. Schädlinge, Mörtel, Glastrichter, Rohre und Spitzen per Autoklav ensterilisieren und im Ofen trocknen.
2. Führen Sie alle Verfahren bei 4 °C oder auf Eis durch und kühlen Sie alle Lösungen vor.
3. Bereiten Sie 100 ml Extraktionspuffer (EB), bestehend aus 0,3 M Saccharose, 5 mM Tetranatriumpyrophosphat, 10 mM KH₂PO₄, 2 mM EDTA, 1% [w/v] Polyvinylpyrrolidon 40, 1% [w/v] Rinderserumalbumin, 5 mM L-Cystein und 20 mM Ascorbinsäure vor. Mit KOH auf pH 7.3 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
4. 100 ml Waschpuffer (WB) bestehend aus 0,3 M Saccharose, 1 mM EGTA und 10 mM MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure) vorbereiten. Mit NaOH auf pH 7.2 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
   HINWEIS: Es wird vorgeschlagen, EB und WB mit DEPC-behandelten deionisierten_H2O vorzubereiten.
5. Sammeln Sie 20 g entwickelnde Kerne in 11–20 Tagen nach der Bestäubung (DAP) zu einem 50-ml-Rohr auf Eis gelegt, und übertragen Sie dann die Kerne auf vorgekühlte Mörtel.
   HINWEIS: Verwenden Sie ein Verhältnis von 100 ml EB zu 20 g Maiskernen.
6. Fügen Sie jedem Mörtel 10–20 ml eiskalteEB hinzu und mahlen Sie die Kerne vollständig.
7. Fügen Sie weitere EB hinzu, und filtern Sie das gemahlene Gewebe durch zwei Schichten Filtertuch (Tabelle der Materialien).
8. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 8.000 x g für 10 min, und entsorgen Sie das Pellet.
9. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr und zentrifugieren Sie ihn bei 20.000 x g für 10 min.
10. Gießen Sie den Überstand ab, und setzen Sie das Pellet in 6 ml WB wieder auf.
11. Aliquot die Suspension zu fünf 1,5 ml RNase-freien Rohren, und zentrifugieren Sie sie bei 14.000 x g für 5 min.
12. Den Überstand entsorgen, das mitochondriale Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.

3. Extraktion von mitochondrialer RNA

1. Extrahieren Sie mitochondriale RNA mit einem kommerziellen Reagenz (Materialtabelle) gemäß den Anweisungen der Herstellung.
   ACHTUNG: Dieses Reagenz enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat. Arbeiten Sie damit in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie Labormantel und Handschuhe.
2. Lösen Sie die isolierte mitochondriale RNAin DEPC-behandelten deionisierten H2 O, und schätzen Sie die RNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Spektralphotometer (Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: Im Allgemeinen wird aus 20 g 15-DAP-Maiskernen eine mitochondriale RNA von 250 g gewonnen.
3. Bereiten Sie ein Agarose-Gel bestehend aus 1x TAE Puffer (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure, 1mM EDTA), 1,5% Agarose (Materialtabelle), und 1x Kernfärbung Farbstoff (Tabelle der Materialien).
4. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von 10x Ladepuffer (0,5% Bromphenolblau, 0,5% Xylolcyanol FF und 50% Glycerin) hinzu und laden Sie mitochondriale RNA/Loading Puffergemisch auf das 1,5% Agarose-Gel.
5. Führen Sie das Gel im 1x TAE-Puffer bei 5–6 V/cm für 20–25 min aus und bewerten Sie die mitochondriale RNA-Integrität, indem Sie das Gel mit einem Gel-Dokumentationssystem (Tableof Materials)abbilden.
   HINWEIS: Das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Bändern (3.510 usd bzw. 1.970 nt für Mais mitochondriale 26S bzw. 18S rRNAs) ist ein akzeptabler Standard für intakte mitochondriale RNA. Um einen möglichen Abbau auszuschließen, sollte die RNA-Integrität in den verschiedenen Schritten der kreisförmigen RNA-Präparation untersucht werden (Abbildung 2).

4. RNA 5' Polyphosphatase Behandlung

1. RNA 5' Polyphosphatase (Tabelle und Materialien) Behandlung einrichten ( Tabelle1), und inkubieren bei 37 °C für 30–60 min.
2. Stellen Sie die 5' Polyphosphatase-behandelte RNA mit einem RNA-Reinigungskit (Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers wieder her.
3. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5.

5. RNA-Zirkularisation

1. Bereiten Sie zwei Zirkulierungsreaktionen mit den gleichen Mengen von 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten mitochondrialen RNAs (Tabelle 2) vor und inkubieren Sie beide Reaktionen bei 16 °C für 12–16 h.
2. Stellen Sie die beiden Sätze von selbstligierten RNAs mit dem gleichen Kit wie in Schritt 4.2 wieder her.
   HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass nur ein Bruchteil der mitochondrialen RNA selbstligiert wird, und die wiedergewonnene RNA wird eine Mischung aus linearen und kreisförmigen Transkripten sein.
3. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5.

6. Umgekehrte Transkription

1. Synthetisieren Sie zwei Sätze von cDNAs aus den gleichen Mengen von kreisförmigen 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs (200 ng).
2. Bereiten Sie eine Primermischung vor, indem Sie ein gleiches Verhältnis von 26S-CRT und bis zu 7 weitere RT-Primer hinzufügen.
   HINWEIS: Die Endkonzentration des Primergemisches sollte 1 m betragen.
3. Bereiten Sie zwei Vormischungen vor, indem Sie die in Tabelle 3aufgeführten Reagenzien kombinieren, bei 65 °C 5 min brüten und dann 2 min auf Eis abkühlen.
4. Montieren Sie zwei RT-Reaktionssysteme (Tabelle 4) und inkubieren Sie sie bei 42 °C für 50 min.
5. Beide RT-Reaktionen bei 70 °C 5 min erhitzen und dann auf Eis abkühlen lassen.

7. Normalisierung

1. Bereiten Sie zwei PCR-Reaktionen vor, indem Sie das gleiche Volumen von Template-CDNAs hinzufügen, die von 5' Polyphosphatase-behandelten oder nicht behandelten RNAs abgeleitet sind, divergierende Primer flankieren die 5'-3'-Kreuzung von kreisförmiger 26S rRNA (d. h. 26S-CF1 und -CR1) usw. (Tabelle 5).
2. Führen Sie die beiden Reaktionen in einem thermischen Cycler (Materialtabelle) unter den in Tabelle 6beschriebenen Bedingungen aus.
3. Bereiten Sie ein Agarose-Gel aus 1x TAE-Puffer, 1,0% Agarose und 1x Kernfärbung vor.
4. Fügen Sie jedem der beiden PCR-Produkte 2 l 10x Ladepuffer (0,5% Bromphenolblau, 0,5 % Xylolcyanol FF und 50 % Glycerin) hinzu und laden Sie sie auf das Gel.
5. Führen Sie das Gel im 1x TAE-Puffer bei 5–6 V/cm für 30–40 min aus, und stellen Sie es mit demselben Geldokumentationssystem als Schritt 3.5 ab.
6. Vergleichen Sie die Häufigkeit der beiden PCR-Produkte mit Computersoftware (Tabelle der Materialien, Abbildung 4A), und optimieren Sie die Normalisierung, indem Sie bei Bedarf die Mengen der Vorlagen-CDNAs ändern.

8. PCR-Verstärkung

1. Vorbereiten Sie Paare von PCR-Reaktionen, indem Sie ein geeignetes Volumen der normalisierten cDNAs und ein Paar divergierender Primer hinzufügen, die 5'-3' Kreuzung der Zieltranskripte flankieren (Tabelle 7).
   HINWEIS: Die Menge der Vorlagen-CDNAs, die für die PCR-Verstärkung der Zieltranskripte verwendet werden, wird durch die 26S rRNA Normalisierungsergebnisse bestimmt.
2. Führen Sie die PCR-Reaktionen gemäß dem in Tabelle 8beschriebenen Programm aus.
3. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 bis 7.5.
4. Wechseln Sie zu verschachtelten divergierenden Primern, und überprüfen Sie die PCR-Ergebnisse der ersten Runde, indem Sie die Schritte 8.1 und 8.2 wiederholen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 bis 7.5.
6. Stellen Sie die prominenten Bänder wieder her, die in zwei Runden PCR-Verstärkung mit einem Gel-DNA-Recovery-Kit (Tableof Materials)wiederholt werden könnten.

9. Bestimmung der Transkript-Termini

1. Klonen Sie die gelgereinigten PCR-Produkte mit Standardtechniken in einen stumpfen Endvektor (Materialtabelle).
2. Führen Sie Kolonie-PCR aus, um positive Klone auszuwählen, die die Zieleinsätze enthalten, und sequenzieren Sie sie kommerziell.
   HINWEIS: Positive Klone, die Inserts mit variabler Größe enthalten, werden in der Regel von einem einzigen wiederhergestellten Band erkannt, da viele stationäre Transkripte in pflanzenmitochondrial heterogenen 5' und/oder 3' Enden^1,12haben.
3. Richten Sie die Sequenzierungsdaten mit dem mitochondrialen Maisgenom mithilfe des grundlegenden lokalen Ausrichtungssuchwerkzeugs (BLAST) des nationalen Zentrums für biotechnologische Informationen (NCBI) aus. Wählen Sie Organismus "mais (taxid:4577)" und Suchdatenbank "Nukleotid-Sammlung (nr/nt)".
4. Finden Sie die 5'-3' Kreuzung des kreisförmigen Transkripts, und bestimmen Sie die Positionen von 5' und 3' Transkript termini.
5. Berechnen Sie die Größe der Zieltranskripte.

10. Verifikation der cRT-PCR Mapping Ergebnisse durch RNA Gel Blot Hybridisierung

HINWEIS: Die RNA-Gel-Blot-Hybridisierung erfolgt mit einem kommerziellen Kit (Table of Materials), das die Reagenzien für die Transkriptionskennzeichnung von RNA mit Digoxigenin (DIG) und T7-RNA-Polymerase, Hybridisierung und immunologischem Nachweis enthält. Weitere Informationen finden Sie in den Protokollen in diesem Kit. Stellen Sie sicher, dass nur RNase freie Geräte für den gesamten Vorgang verwendet werden.

1. Verstärken Sie das DNA-Fragment, das zur Vorbereitung der RNA-Sonde verwendet wird, und klonen Sie es auf den gleichen Vektor wie in Schritt 9.1, der einen T7-Promotor 17 bp vor der Einfügestelle enthält.
2. Linearisieren Sie das Konstrukt mit dem richtigen Restriktionsenzym, bergen Sie das linearisierte Plasmid durch ein DNA-Reinigungskit (Tabelle der Materialien) und lösen Sie es in DEPC-behandelten deionisierten H₂O.
3. Label RNA Sonden mit DIG-11-UTP durch ein kommerzielles Kit (Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers.
4. 500 ml 10x MOPS-Puffer (0,2 M MOPS, 50 mM Natriumacetat und 10 mM EDTA) mit DEPC-behandeltem deionisiertem_H2O vorbereiten. Von NaOH auf pH 7,0 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
5. Fügen Sie der in den Schritten 3.1–3.3 hergestellten mitochondrialen RNA, die in den Schritten 3.1–3.3 hergestellt wird, 2–3 Volumen des Ladepuffers (50% Formamid, 6,2 % Formaldehyd, 1x MOPS, 10% Glycerin und 0,1% Bromphenolblau) hinzu.
6. Die RNA-Probe/Ladepuffermischung 10 min bei 65 °C denaturieren und dann 1 min auf Eis abkühlen lassen.
7. Bereiten Sie ein denaturiertes Agarose-Gel (2% Formaldehyd, 1,2% Agarose und 1x MOPS) vor und laden Sie die RNA-Probe/Loading-Puffermischung in das Gel (1–2 g mitochondriale RNA pro Brunnen).
8. Führen Sie das Gel in 1x MOPS bei 3–4 V/cm für 4 h aus.
9. 2 L 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0) vorbereiten. Behandeln Sie es mit 0,1% DEPC über Nacht, und sterilisieren durch Autoklaven.
10. Spülen Sie das Gel zweimal in 20x SSC (15 min jedes Mal), und übertragen Gel RNA auf eine Nylonmembran (Tisch der Materialien) durch Kapillartransfer mit 20x SSC für 10-16 h.
11. Fixieren Sie die RNA an der Membran, indem Sie 30 min bei 120 °C backen.
12. Führen Sie die RNA-Hybridisierung und den immunologischen Nachweis mit einem kommerziellen Kit (Tabelle der Materialien) gemäß der Anweisung des Herstellers durch.

11. Diskriminierung von Primär- und Verarbeiteten 5' Enden

1. Diskriminieren Sie die primären und verarbeiteten 5' Enden, indem Sie die cRT-PCR-Produkte vergleichen, die aus den normalisierten 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs gewonnen werden.
   HINWEIS: Bei primären Transkripten ist die Häufigkeit von PCR-Produkten aus 5' Polyphosphatase-behandelter RNA viel höher als die von nicht behandelten Gegenstücken (Abbildung 1, "Gene A" und Abbildung 4A). Bei verarbeiteten Transkripten würde jedoch ein vergleichbares Niveau von PCR-Produkten aus den beiden Sätzen mitochondrialer RNAs (Abbildung1, "Gene B") verstärkt.
2. Design RT-qPCR Primer basierend auf den cRT-PCR-Mapping-Ergebnissen.
3. Überprüfen Sie die CRT-PCR-Diskriminierungsergebnisse durch RT-qPCR.
   HINWEIS: Die beiden cDNA-Proben, die aus 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs gewonnen werden, werden durch die RT-qPCR-Produkte von 26S reifer rRNA normalisiert.

Ergebnisse

Abschätzung der mitochondrialen RNA-Zirkularisierungseffizienz

In einer früheren Studie wurden sowohl totale als auch mitochondriale RNAs für die cRT-PCR-Mapping von mitochondrialen Transkripttermini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) verwendet, und die beiden Arten von RNAs ergaben ähnliche Kartierungsergebnisse¹². Anfangs verwendeten wir auch totale RNAs für di...

Diskussion

In einer früheren Studie wurden totale und mitochondriale RNAs aus der Zellsuspensionskultur von Arabidopsis verwendet, um mitochondriale Transkript-Termini durch cRT-PCR zu kartieren, und ähnliche Ergebnisse wurden¹²erzielt. Jedoch, nur angereicherte mitochondriale RNA wurde verwendet, um mitochondriale Transkript termini in vielen anderen Studien^1,2,3,9. Wir...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Aladdin, China	A112880	To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid	Sigma-aldrich, USA	V900134	For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose	Biowest, Spain	9012-36-6	To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin	Sigma-aldrich, USA	A1933	For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue	Sigma-aldrich, USA	B8026	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit	Roche, USA	12039672910	For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	For preparation of wash buffer
Gel documentation system	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	To image the agarose gel
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5000x)	Solarbio,. China	G8142	DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane	Amersham Biosciences, USA	RPN119	For Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	For preparation of extraction buffer
KOH	Aladdin, China	P112284	For preparation of extraction buffer
L-cysteine	Sigma-aldrich, USA	V900399	For preparation of extraction buffer
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	To filter the ground kernel tissues
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	For RNA concentration and purity assay
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector	TransGen Biotech, China	CB111	Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase	Vazyme, China	P505	DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase	Takara, Japan	2690	To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase	Epicentre, USA	RP8092H	To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor	New England Biolabs, UK	M0314	A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate	Sigma-aldrich, USA	V900212	For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride	Sigma-aldrich, USA	V900058	To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate	Sigma-aldrich, USA	221368	For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit	Tiangen Biotech, China	DP209	To purify DNA fragments from agarose gel
Tris	Aladdin, China	T110601	To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent	Invitrogen, USA	15596026	To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit	Tiangen Biotech, China	DP214	To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis