Discrimintion et cartographie des transcriptions primaires et traitées dans la mitochondndrion de maïs à l'aide d'une stratégie circulaire basée sur rt-PCR

Résumé

Nous présentons une stratégie circulaire basée sur RT-PCR en combinant la RT-PCR circulaire, la RT-PCR quantitative, le traitement polyphosphatase d'ARN 5' et la tache nordique. Ce protocole comprend une étape de normalisation pour minimiser l'influence du triphosphate instable de 5' et il convient de discriminer et de cartographier les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs.

Résumé

Dans les mitochondries végétales, certaines transcriptions à état stable contiennent un triphosphate de 5' dérivé de l'initiation à la transcription (transcriptions primaires), tandis que les autres contiennent 5' monophosphate généré sapostolassme post-transcriptionnelle (transcriptions traitées). Pour faire la distinction entre les deux types de transcriptions, plusieurs stratégies ont été élaborées, et la plupart d'entre elles dépendent de la présence ou de l'absence de triphosphate de 5'. Cependant, le triphosphate au termini primaire de 5' est instable, et il entrave une discrimination claire des deux types de transcriptions. Pour différencier et cartographier systématiquement les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs, nous avons développé une stratégie circulaire basée sur la RT-PCR (cRT-PCR) en combinant cRT-PCR, RNA 5' traitement polyphoshpatase, quantitatif RT-PCR (RT-qPCR), et Northern blot. À titre d'amélioration, cette stratégie comprend une étape de normalisation de l'ARN pour minimiser l'influence du triphosphate instable de 5'.

Dans ce protocole, l'ARN mitochondrial enrichi est pré-traité par l'ARN 5' polyphosphatase, qui convertit 5' triphsophate en monophosphate. Après la circularisation et la transcription inverse, les deux CDNA dérivés de 5' polyphosphatase-traités et non-traités RNAs sont normalisés par le maïs 26S rRNA mature, qui a une extrémité traitée de 5' et est insensible à 5' polyphosphatase. Après normalisation, les transcriptions primaires et traitées sont discriminées en comparant les produits cRT-PCR et RT-qPCR obtenus à partir des ARN traités et non traités. Les termini de transcription sont déterminés par le clonage et le séquençage des produits cRT-PCR, puis vérifiés par la tache nordique.

En utilisant cette stratégie, la plupart des transcriptions à l'état stable dans la mitochondrie du maïs ont été déterminées. En raison du modèle compliqué de transcription de quelques gènes mitochondriques, quelques transcriptions stables-état n'ont pas été différenciées et/ou cartographiées, bien qu'elles aient été détectées dans une tache nordique. Nous ne sommes pas sûrs si cette stratégie est appropriée pour discriminer et cartographier les transcriptions à état stable dans d'autres mitochondries végétales ou dans les plastides.

Introduction

Dans les mitochondries végétales, de nombreux ARN matures et précurseurs sont accumulés sous forme d'isoformes multiples, et les transcriptions à état stable peuvent être divisées en deux groupes en fonction de la différence à leurs 5' extrémités^{1,2,3, 4}. Les transcriptions primaires ont des extrémités triphosphate de 5' qui sont dérivées de l'initiation de transcription. En revanche, les transcriptions traitées ont 5' monophosphate généré par le traitement post-transcriptionnel. La discrimination et la cartographie des deux types de transcriptions sont importantes pour démêler les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transcription et à la maturation de fin de transcription.

Pour faire la distinction entre les transcriptions primaires et traitées dans la mitochondrie végétale, quatre stratégies majeures ont été élaborées. La première stratégie consiste à prétraiter les ARN mitochondriaux avec de la pyrophosphatase (TAP) à l'acide du tabac, qui convertit le triphosphate de 5 po en monophosphate et permet de circulariser les transcriptions primaires par la ligase d'ARN. Les abondances de transcription des échantillons d'ARN TAP-traités et non-traités sont alors comparées par l'amplification rapide des extrémités de cDNA (RACE) ou circulaires RT-PCR (cRT-PCR)^2,3,4. Dans la deuxième stratégie, les transcriptions traitées sont d'abord épuisées des ARN mitochondriaux à l'aide de l'exonuclease (TEX) de terminator 5'-phosphate-dépendant, et les transcriptions primaires restantes sont ensuite cartographiées par l'analyse d'extension d'amorce^5,6 . La troisième stratégie consiste à précaper les transcriptions primaires à l'aide de la gouanylyl transferase, puis la position du termini triphosphated 5' est déterminée par extension d'amorce avec l'analyse de protection de nucléane de ribonuclease ou de S1^{7,8 ,9}. Différente de celles selon la présence/absence du triphosphate de 5', la quatrième stratégie combine la transcription in vitro, la mutagénèse dirigée par le site, et l'analyse d'extension d'amorce pour caractériser les promoteurs putatifs et déterminer la transcription sites d'initiation^8,10,11. En utilisant ces stratégies, de nombreuses transcriptions primaires et traitées ont été déterminées dans les mitochondries végétales.

Cependant, plusieurs études ont rapporté que le triphosphate de 5' des transcriptions primaires étaient instables, et ils ont été facilement convertis en monophosphate pour la raison inconnue^2,4,12,13. Ce problème entrave une discrimination claire des deux types de transcriptions en utilisant des techniques en fonction de la présence/absence de triphosphate de 5', et les efforts antérieurs pour discriminer systématiquement entre les transcriptions primaires et traitées dans les usines mitochondries a échoué^2,12.

Dans ce protocole, nous combinons cRT-PCR, RNA 5' traitement polyphosphatase, RT-qPCR, et la tache du Nord pour distinguer systématiquement les transcriptions primaires et traitées stablement accumulées dans le maïs (Zea mays) mitochondndrion (Figure 1). cRT-PCR permet la cartographie simultanée des extrémités de 5' et 3' d'une molécule d'ARN, et il est généralement adapté pour cartographier les termini de transcription dans les plantes^2,12,14,15. La polyphosphatase de l'ARN 5' pourrait enlever deux phosphates du termini triphosphated 5', qui rend les transcriptions primaires disponibles pour l'auto-ligaation par ligase d'ARN. Des études antérieures ont montré que l'ARNr 26S mature dans le maïs avait traité le terminus de 5' et qu'il était insensible à la polyphosphatase^1,16. Afin de minimiser l'influence du triphosphate instable au termini primaire de 5', les ARN de 5' traités par polyphosphatase et non traités sont normalisés par l'ARNr 26S mature, et les transcriptions primaires et traitées sont ensuite différenciées en comparant le cRT-PCR provenant des deux échantillons d'ARN. Les résultats de la cartographie et de la discrimination cRT-PCR sont vérifiés par Northern blot et RT-qPCR, respectivement. Enfin, d'autres amorces sont utilisées pour amplifier les transcriptions détectées dans Northern blot, mais pas par cRT-PCR. En utilisant cette stratégie basée sur le cRT-PCR, la plupart des transcriptions à état stable dans la mitochondrie du maïs ont été différenciées et cartographiées¹.

Protocole

1. Conception d'apprêt

1. Concevoir des amorces spécifiques aux gènes pour la transcription inversée (RT) à l'aide d'un logiciel de conception d'amorce PCR (Table of Materials) basé sur les règles générales de conception d'amorce¹⁷.
   REMARQUE: Les amorces DE sont très spécifiques aux transcriptions cibles, et elles sont généralement ancrées sur la partie 5' des séquences de codage (ARNm matures et ARN précurseurs), ou 500 à 600 nt en aval de l'extrémité prévue de 5' (18S et 26S rARN).
2. Concevoir des paires d'amorces divergentes pour amplifier les transcriptions circulaires par cRT-PCR.
   REMARQUE : Les amorces divergentes jumelées flanquent la jonction de 5'-3' des transcriptions circulaires, et leurs positions varient entre les transcriptions cibles analysées (Figure S1). Certaines transcriptions ont de longs URs; par exemple, nad2-1 5' UTR et rps4-1 3' UTR sont 1.985 et 1.826/1,834 nt, respectivement¹. Si les deux amorces sont ancrées sur la région de codage, il sera difficile d'amplifier les transcriptions cibles. En revanche, certains UR sont courts; par exemple, les 3' UTRs de nad2-1 et nad4-1 sont 34/35 et 29-31 nt, respectivement¹. Si les amorces appariées sont situées loin des séquences de codage, le PCR échouera. En général, deux paires d'amorces divergentes sont conçues pour chaque transcription cible, tandis que plusieurs paires peuvent être nécessaires pour cartographier ceux dont les modèles de transcription sont compliqués et/ou les ORC sont très longs.
3. Concevoir des paires d'amorces convergentes pour préparer des sondes d'ARN pour la tache nordique.
   REMARQUE: Les amorces appariées sont situées sur la région de codage du gène cible, et la taille du produit PCR devrait être de l'ordre de 100 à 1 000 pb. Chaque apprêt avant doit contenir un site enzymatique de restriction pour minimiser les séquences vectorielles dans les sondes qui en résultent.

2. Préparation de mitochondrie brute à partir de grains en développement de maïs

1. Stériliser les pilons, les mortiers, les entonnoirs en verre, les tubes et les pointes par autoclave, et les sécher au four.
2. Effectuer toutes les procédures à 4 oC ou sur glace, et pré-refroidir toutes les solutions.
3. Préparer 100 ml de tampon d'extraction (EB), composé de 0,3 M de saccharose, 5 mM de pyrophosphate tétrasodium, 10 mM KH₂PO₄, 2 mM EDTA, 1% [w/v] polyvinylpyrrolidone 40, 1% [w/v] albumin etolitique de sérum bovin, 5 mM L-cystéine, et 20 mM d'acide ascorbique. Ajuster au pH 7.3 avec KOH et stériliser par filtration.
4. Préparer 100 ml de tampon de lavage (WB) composé de 0,3 M de saccharose, 1 mM EGTA et 10 mM moPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid). Ajuster au pH 7.2 avec NaOH et stériliser par filtration.
   REMARQUE: Il est suggéré de préparer EB et WB en utilisant DEPC-traité déionized H₂O.
5. Recueillir 20 g de grains en développement à 11 à 20 jours après la pollinisation (DAP) dans un tube de 50 ml placé sur la glace, puis transférer les grains dans des mortiers pré-refroidis.
   REMARQUE: Utiliser un rapport de 100 ml d'EB à 20 g de grains de maïs.
6. Ajouter 10 à 20 ml d'EB glacé à chaque mortier et moudre complètement les grains.
7. Ajouter plus d'EB, et filtrer les tissus du sol à travers deux couches de tissu filtre (Table des matériaux).
8. Centrifuger le filtrate à 8 000 x g pendant 10 min, et jeter la pastille.
9. Transférer le supernatant dans un nouveau tube et le centrifuger à 20 000 x g pendant 10 min.
10. Verser le supernatant, et resuspendre la boulette dans 6 mL WB.
11. Aliquot la suspension à cinq tubes sans RNase de 1,5 mL, et les centrifuger à 14 000 x g pendant 5 min.
12. Jeter le supernatant, congeler le granule mitochondrial dans de l'azote liquide et le stocker à -80 oC.

3. Extraction de l'ARN mitochondrial

1. Extraire l'ARN mitochondrial avec un réactif commercial (Table of Materials) selon les instructions de la manufacture.
   MISE EN GARDE: Ce réactif contient du phénol et de l'isothiocyanate de guanidine. Travaillez avec elle dans une hotte de fumée, et portez le manteau et les gants de laboratoire.
2. Dissoudre l'ARN mitochondrial isolé dans le H₂O déionisé traité par DEPC et estimer la concentration et la pureté de l'ARN à l'égard d'un spectrophotomètre (tableaudes matériaux).
   REMARQUE: En général, l'ARN mitochondrial de 250 g est obtenu à partir de 20 g de grains de maïs 15-DAP.
3. Préparer un gel d'agarose composé de 1x tampon TAE (40 mM Tris, 20 mM d'acide acétique, 1mM EDTA), 1,5% agarose (Table of Materials), et 1x colorant nucléaire ( Table ofMaterials).
4. Ajouter un volume approprié de tampon de chargement 10x (0,5 % bleu bromophénol, 0,5 % de xylène cyanol FF et 50 % de glycérol), et charger le mélange tampon d'ARN/chargement mitochondrial sur le gel agarose de 1,5 %.
5. Exécuter le gel en tampon 1x TAE à 5 à 6 V/cm pendant 20 à 25 min, et évaluer l'intégrité de l'ARN mitochondrial en imagerie du gel avec un système de documentation gel (Tableau des matériaux).
   REMARQUE: La présence de deux bandes distinctes (3 510 et 1 970 nt pour le maïs mitochondrial 26S et 18S, respectivement) est une norme acceptable pour l'ARN mitochondrial intact. Pour exclure une dégradation possible, l'intégrité de l'ARN doit être étudiée au cours des multiples étapes de la préparation circulaire de l'ARN (figure 2).

4. RNA 5' Traitement de polyphosphatase

1. Mettre en place le traitement de l'ARN 5' polyphosphatase (Table et Matériaux)(tableau 1), et incuber à 37 oC pendant 30 à 60 min.
2. Récupérer l'ARN traité à la polyphosphatase de 5' avec un kit de purification de l'ARN (Tableau des Matériaux) selon les instructions du fabricant.
3. Répétez les étapes 3.3 à 3.5.

5. Circularisation de l'ARN

1. Préparer deux réactions de circularisation en utilisant les mêmes quantités de 5' polyphosphatase-traités et non-traités RNA mitochondriaux (tableau 2), et couver les deux réactions à 16 oC pour 12-16 h.
2. Récupérez les deux séries d'ARN auto-ligated en utilisant le même kit que dans l'étape 4.2.
   REMARQUE: Il convient de noter que seule une fraction de l'ARN mitochondrial sera auto-ligated, et l'ARN récupéré sera un mélange de transcriptions linéaires et circulaires.
3. Répétez les étapes 3.3 à 3.5.

6. Transcription inversée

1. Synthétiser deux ensembles de CDNA à partir des mêmes quantités d'ARN circulaires de 5' traités par polyphosphatase et non traités (200 ng).
2. Préparer un mélange d'amorce en ajoutant un rapport égal de 26S-CRT et jusqu'à 7 autres amorces RT.
   REMARQUE: La concentration finale du mélange d'amorce doit être de 1 M.
3. Préparer deux pré-mélanges en combinant les réactifs énumérés dans le tableau3, incuber à 65 oC pendant 5 min, puis réfrigérer sur la glace pendant 2 min.
4. Assembler deux systèmes de réaction RT (tableau4) et les incuber à 42 oC pendant 50 min.
5. Chauffer les deux réactions de RT à 70 oC pendant 5 min, puis les refroidir sur la glace.

7. Normalisation

1. Préparer deux réactions PCR en ajoutant le même volume de modèles cDNA dérivés de 5' polyphosphatase-traités ou non traités RNAs, amorces divergentes flanquant la jonction 5'-3' de circulaire 26S rRNA (c.-à-26S-CF1 et -CR1), etc (tableau 5).
2. Exécuter les deux réactions dans un cycleur thermique (Tableau des matériaux) dans des conditions décrites dans le tableau 6.
3. Préparer un gel d'agarose composé de 1x tampon TAE, 1,0% d'agarose et 1x colorant nucléaire.
4. Ajouter un tampon de chargement de 2 l1x (0,5 % bleu bromophénol, 0,5 % de cyylène xylène FF et 50 % de glycérol) à chacun des deux produits PCR, et les charger sur le gel.
5. Faites fonctionner le gel dans un tampon TAE 1x à 5 à 6 V/cm pendant 30 à 40 minutes, et imagez-le en utilisant le même système de documentation de gel que l'étape 3.5.
6. Comparez l'abondance des deux produits PCR à l'aide d'un logiciel informatique (Tableaudes matériaux, Figure 4A), et optimisez la normalisation en modifiant les quantités de modèles cDNA si nécessaire.

8. Amplification DE PCR

1. Préparer des paires de réactions PCR en ajoutant un volume approprié des CDNA normalisés et une paire d'amorces divergentes flanquant la jonction de 5'-3' des transcriptions cibles (tableau 7).
   REMARQUE: La quantité de cDNA de modèle utilisé pour l'amplification de PCR des transcriptions cibles est déterminée par les résultats de normalisation 26S rRNA.
2. Effectuer les réactions PCR selon le programme décrit dans le tableau 8.
3. Répétez les étapes 7.3 à 7.5.
4. Changer les amorces divergentes imparables et vérifier les résultats du PCR du premier tour en répétant les étapes 8.1 et 8.2.
5. Répétez les étapes 7.3 à 7.5.
6. Récupérer les bandes proéminentes qui pourraient être répétées en deux séries d'amplification PCR à l'aide d'un kit de récupération d'ADN gel (Tableau des matériaux).

9. Détermination de Transcript Termini

1. Clonez les produits PCR purifiés en gel dans un vecteur émoussé (Tableau des matériaux) en utilisant des techniques standard.
2. Effectuer la pcR de la colonie pour sélectionner les clones positifs contenant les inserts cibles, et les séquencer commercialement.
   REMARQUE: Les clones positifs contenant des inserts de taille variable sont généralement détectés à partir d'une seule bande récupérée parce que de nombreuses transcriptions à l'état stable dans les mitochondries végétales ont des extrémités hétérogènes de 5' et/ou 3'^1,12.
3. Harmoniser les données de séquençage avec le génome mitochondrial du maïs à l'aide de l'outil local de base de recherche sur l'alignement (BLAST) du Centre national d'information sur la biotechnologie (NCBI). Choisissez l'organisme "maïs (taxid:4577)", et la base de données de recherche "Collection de nucléotides (nr/nt)".
4. Trouvez la jonction 5'-3' de la transcription circulaire, et déterminez les positions de 5' et 3' termini de transcription.
5. Calculez la taille des transcriptions cibles.

10. Vérification des résultats de cartographie cRT-PCR par hybridation de blot de gel d'ARN

REMARQUE: L'hybridation de tache de gel d'ARN est exécutée en utilisant un kit commercial (tableau des matériaux), qui contient les réactifs pour la transcription-étiquetage de l'ARN avec la digoxinine (DIG) et la polymérase d'ARN T7, l'hybridation, et la détection immunologique. Veuillez consulter les protocoles fournis dans ce kit pour plus de détails. Assurez-vous que seul l'équipement sans RNase est utilisé pour l'ensemble de la procédure.

1. Amplifiez le fragment d'ADN utilisé pour préparer la sonde d'ARN, et clonez-le au même vecteur que dans l'étape 9.1, qui contient un promoteur T7 17 bp en amont du site d'insertion.
2. Linéarisez la construction à l'aide d'enzymes de restriction appropriées, récupérez le plasmide linéaire par un kit de purification de l'ADN (Table of Materials), et dissoutez-le dans le H₂O déionisé traité par DEPC.
3. Étiquette sondes d'ARN avec DIG-11-UTP par un kit commercial (Table of Materials) selon les instructions du fabricant.
4. Préparer 500 ml de tampon MOPS 10x (0,2 M MOPS, 50 mm d'acétate de sodium et 10 mM EDTA) à l'aide de H₂O. déionisé traités par DEPC et de le pH 7,0 par NaOH, et stériliser par filtration.
5. Ajoutez 2 à 3 volumes de tampon de chargement (50 % de formamide, 6,2 % de formaldéhyde, 1x MOPS, 10 % de glycérol et 0,1 % de bleu bromophénol) à l'ARN mitochondrial préparé à l'étape 3.1-3.3.
6. Dénaturer l'échantillon d'ARN/Charger le mélange tampon à 65 oC pendant 10 min, puis refroidir sur la glace pendant 1 min.
7. Préparer un gel d'agarose dénaturé (2 % de formaldéhyde, 1,2 % d'agarose et 1x MOPS) et charger l'échantillon d'ARN/mélange tampon de chargement au gel (1 à 2 g d'ARN mitochondrial par puits).
8. Exécuter le gel en 1x MOPS à 3 x 4 V/cm pour 4 h.
9. Préparer 2 L de 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M de citrate de sodium, pH 7,0). Traitez-le avec 0,1% DEPC pendant la nuit, et stérilisez par autoclave.
10. Rincer le gel deux fois en 20x SSC (15 min à chaque fois), et transférer l'ARN gel à une membrane de nylon (Table of Materials) par transfert capillaire avec 20x SSC pour 10 à 16 h.
11. Fixer l'ARN à la membrane en faisant cuire à 120 oC pendant 30 min.
12. Effectuer l'hybridation de l'ARN et la détection immunologique avec un kit commercial (Table of Materials) selon les instructions du fabricant.

11. Discrimination des fins primaires et traitées de 5'

1. Distinguer les extrémités primaires et traitées de 5' en comparant les produits cRT-PCR obtenus à partir des ARN normalisés de 5' polyphosphatase-traités et non traités.
   REMARQUE: Pour les transcriptions primaires, l'abondance des produits PCR à partir de 5' polyphosphatase-traité ARN est beaucoup plus élevé que celle de la contrepartie non traitée (Figure 1, «Gène A, » et Figure 4A). Toutefois, pour les transcriptions traitées, un niveau comparable de produits PCR serait amplifié à partir des deux ensembles d'ARN mitochondriaux (figure1, « gène B »).
2. Concevoir des amorces RT-qPCR basées sur les résultats cartographiques cRT-PCR.
3. Vérifier les résultats de discrimination cRT-PCR par RT-qPCR.
   REMARQUE: Les deux échantillons d'ADNc dérivés de 5' polyphosphatase-traités et non-traités RNAs sont normalisés par les produits RT-qPCR de 26S rRNA mature.

Résultats

Estimation de l'efficacité de la circularisation de l'ARN mitochondrial

Dans une étude précédente, les ARN totaux et mitochondriaux ont été utilisés pour la cartographie cRT-PCR de termini de transcription mitochondriale dans Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), et les deux types d'ARN ont donné des résultats de cartographie similaires¹². Au départ, nous avons ?...

Discussion

Dans une étude précédente, les ARN totaux et mitochondriaux de la culture de suspension cellulaire d'Arabidopsis ont été employés pour cartographier le termini mitochondrial de transcription par cRT-PCR, et des résultats semblables ont été obtenus¹². Cependant, seulement l'ARN mitochondrial enrichi a été employé pour cartographier le termini de transcription mitochondrial dans beaucoup d'autres études^1,2,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Aladdin, China	A112880	To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid	Sigma-aldrich, USA	V900134	For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose	Biowest, Spain	9012-36-6	To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin	Sigma-aldrich, USA	A1933	For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue	Sigma-aldrich, USA	B8026	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, USA	V900882	Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit	Roche, USA	12039672910	For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA	Sigma-aldrich, USA	V900106	For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA	Sigma-aldrich, USA	E3889	For preparation of wash buffer
Gel documentation system	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	To image the agarose gel
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x)	Solarbio,. China	G8142	DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane	Amersham Biosciences, USA	RPN119	For Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4	Sigma-aldrich, USA	V900041	For preparation of extraction buffer
KOH	Aladdin, China	P112284	For preparation of extraction buffer
L-cysteine	Sigma-aldrich, USA	V900399	For preparation of extraction buffer
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	To filter the ground kernel tissues
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	For RNA concentration and purity assay
NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector	TransGen Biotech, China	CB111	Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase	Vazyme, China	P505	DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40	Sigma-aldrich, USA	V900008	For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase	Takara, Japan	2690	To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase	Epicentre, USA	RP8092H	To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor	New England Biolabs, UK	M0314	A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate	Sigma-aldrich, USA	V900212	For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride	Sigma-aldrich, USA	V900058	To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs, UK	M0437	For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate	Sigma-aldrich, USA	221368	For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit	Tiangen Biotech, China	DP209	To purify DNA fragments from agarose gel
Tris	Aladdin, China	T110601	To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent	Invitrogen, USA	15596026	To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit	Tiangen Biotech, China	DP214	To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis