JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем круговую стратегию на основе РТ-ПЦР путем объединения круговой РТ-ПЦР, количественного RT-PCR, полифосфатазы РНК 5 и Северной подья. Этот протокол включает в себя шаг нормализации, чтобы свести к минимуму влияние нестабильной 5' трифосфат, и он подходит для распознавания и отображения первичных и обработанных стенограмм стабильно накопленных в митохондрии кукурузы.

Аннотация

В митохондриях растений, некоторые устойчивые состояния стенограммы имеют 5' трифосфат, полученный из транскрипции инициации (первичные транскрипты), в то время как другие содержат 5' монофосфата, генерируемого посттранскриптионно (обработанные транскрипты). Для разлиения между этими двумя типами стенограмм было разработано несколько стратегий, и большинство из них зависит от наличия/отсутствия 5' трифосфата. Тем не менее, трифосфат на первичном 5 ' termini нестабилен, и это препятствует явной дискриминации двух типов стенограмм. Для систематического дифференцировать и картировать первичные и обработанные транскрипты, старично накопленные в митохондрии кукурузы, мы разработали круговую стратегию на основе RT-PCR (cRT-PCR) путем объединения cRT-PCR, лечения полифошпатазы RNA 5, количественной РТ-ПЦР (РТ-кПкР) и Северная поместье. В качестве улучшения, эта стратегия включает в себя шаг нормализации РНК, чтобы свести к минимуму влияние нестабильной 5' трифосфата.

В этом протоколе обогащенная митохондриальная РНК предварительно обрабатывается полифосфатами РНК 5, которая преобразует 5' трифофат в монофосфат. После круговой и обратной транскрипции, два cDNAs, полученных из 5' полифосфатазы и необработанных РНК нормализуются кукурузой 26S зрелой rRNA, которая имеет обработанный 5 ' конец и нечувствительна к 5' полифосфаза. После нормализации первичные и обработанные транскрипты дискриминируются путем сравнения продуктов cRT-PCR и RT-qPCR, полученных из обработанных и необработанных РНК. Транскрипт термини определяются путем клонирования и секвенирования продуктов CRT-PCR, а затем проверяются Северной подись.

С помощью этой стратегии, наиболее устойчивый состояние стенограммы в митохондрии кукурузы были определены. Из-за сложной схемы транскрипта некоторых митохондриальных генов, несколько транскриптов устойчивого состояния не были дифференцированы и/или отображены, хотя они были обнаружены в северной погредете. Мы не уверены, подходит ли эта стратегия для дискриминации и картирования стабильного состояния стенограммы в других митохондриях растений или в пластидов.

Введение

В митохондриях растений, многие зрелые и предшественники РНК накапливаются как несколько изоформ, и устойчивый состояние стенограммы могут быть разделены на две группы на основе разницы в их 5 'концы1,2,3, 4. Первичные транскрипты имеют 5' трифосфатных концов, которые получены от инициации транскрипции. В отличие от этого, обработанные транскрипты имеют 5' монофосфат, генерируемый посттранскрипционной обработкой. Дискриминация и картирование двух типов транскриптов имеют важное значение для разгадки молекулярных механизмов, лежащих в основе транскрипции и транскрипта конца созревания.

Для проведения различия между первичными и обработанными транскриптами в митохондрии растений были разработаны четыре основные стратегии. Первая стратегия заключается в предварительной обработке митохондриальных РНК с табачной кислотой пирофосфаза (TAP), которая преобразует 5' трифосфат в монофосфат и позволяет первичных транскриптов быть циркуляризированы РНК лигазы. Стенограмма обилия TAP-обработанных и необработанных образцов РНК затем сравниваются путем быстрого усиления концов кДНК (RACE) или круговой RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. Во второй стратегии, обработанные стенограммы сначала истощаются из митохондриальных РНК с использованием терминатора 5'-фосфат-зависимых экзонуклеизы (TEX), и первичные стенограммы слева затем отображаются грунтового анализа расширения5,6 . Третья стратегия заключается в предварительной крышкой первичных стенограмм с использованием guanylyl transferase, а затем положение triphosphated 5 ' termini определяется грунтовка расширение вместе с ribonuclease или S1 нуклеаза анализ защиты7,8 ,9. В отличие от тех, в зависимости от наличия / отсутствия 5' трифосфата, четвертая стратегия сочетает в себе в пробирке транскрипции, сайт-направленный мутагенез, и анализ расширения грунтовки, чтобы охарактеризовать предполагаемых промоутеров и определить транскрипцию сайтыпосвящения 8,10,11. С помощью этих стратегий, многие первичные и обработанные стенограммы были определены в митохондриях растений.

Тем не менее, несколько исследований сообщили, что 5' трифосфат первичных стенограмм были нестабильны, и они были легко преобразованы в монофосфат по неизвестной причине2,4,12,13. Эта проблема препятствует явной дискриминации двух типов стенограмм с помощью методов в зависимости от наличия/отсутствия 5' трифосфата, а также предыдущих попыток систематически различать первичные и обработанные транскрипты на заводе митохондрий не удалось2,12.

В этом протоколе мы объединяем cRT-PCR, лечение полифосфатазы РНК 5, RT-qPCR и Северный пятно, чтобы систематически различать первичные и обработанные транскрипты, стабилизированные в кукурузе(Цеа май)митохондрион (рисунок1). cRT-PCR позволяет одновременное отображение 5' и 3' конечностей молекулы РНК, и это обычно адаптированы для карты транскрипт термини в растениях2,12,14,15. ПОЛифосфатаза РНК 5'может удалить два фосфата из трифосфатных 5' termini, что делает первичные транскрипты доступны для самостоятельной лигиции РНК лигаза. Предыдущие исследования показали, что зрелые 26S rRNA в кукурузе были обработаны 5 ' терминов, и он был нечувствительным к РНК 5' полифосфатаза1,16. Чтобы свести к минимуму влияние нестабильного трифосфата на первичные 5' термини, 5' полифосфатазно-обработанные и необработанные РНК нормализуются зрелыми 26S rRNA, а первичные и обработанные транскрипты затем дифференцированы путем сравнения продукты cRT-PCR, полученные из двух образцов РНК. Результаты картирования и дискриминации cRT-PCR проверяются соответственно "Северным пятном" и РТ-кПкР. Наконец, альтернативные праймеры используются для усиления этих транскриптов, обнаруженных в Северном пятно, но не cRT-PCR. С помощью этой стратегии на основе cRT-PCR, наиболее устойчивый состояние стенограммы в митохондрии кукурузы были дифференцированы и отображены1.

протокол

1. Праймер Дизайн

  1. Дизайн генных праймеров для обратной транскрипции (RT) с использованием ПЦР праймер дизайн программного обеспечения (Таблица материалов) на основе общих правил грунтовки дизайн17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: RT праймеры очень специфичны для целевых стенограмм, и они, как правило, закреплены на 5 ' часть последовательности кодирования (зрелые мРНК и прекурсор РНК), или 500-600 nt вниз по течению ожидаемого 5 ' конец (18S и 26S rRNAs).
  2. Дизайн пары расходящихся грунтовки для усиления циркулярных стенограмм по cRT-PCR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парные расходящихся грунтовки фланг 5'-3 'стыковка круговых стенограмм, и их позиции варьируются между целевой стенограммы проанализированы (Рисунок S1). Некоторые стенограммы имеют длинные UTRs; например, nad2-1 5' UTR и rps4-1 3' UTR 1,985 и 1,826/1,834 nt, соответственно1. Если оба грунтовки закреплены на области кодирования, будет трудно усилить целевые транскрипты. В отличие от этого, некоторые UTRs являются короткими; например, 3' UTRs nad2-1 и nad4-1 являются 34/35 и 29-31 nt, соответственно1. Если парные грунтовки расположены далеко от последовательностей кодирования, ПЦР выйдет из строя. Как правило, две пары расходящихся праймеров предназначены для каждой целевой стенограммы, в то время как несколько пар могут быть необходимы для картирования тех, чьи модели стенограммы являются сложными и / или UTRs очень долго.
  3. Дизайн пары конвергентных грунтовки для подготовки РНК зондов для Северной подьеносец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парные грунтовки расположены на области кодирования целевого гена, а размер продукта ПЦР должен находиться в диапазоне от 100 до 1000 б.п. Каждый передний грунтовка должен содержать место фермента ограничения, чтобы свести к минимуму векторные последовательности в результирующих зондах.

2. Подготовка сырой митохондрии из кукурузы развивающихся ядер

  1. Стерилизовать пестики, растворы, стеклянные воронки, трубки, и советы автоклава, и высушить их в духовке.
  2. Выполняйте все процедуры при 4 градусах Цельсия или на льду, и предварительно охладить все растворы.
  3. Подготовка 100 мл буфера извлечения (EB), состоящий из 0,3 М сахарозы, 5 мМ тетранадия пирофосфат, 10 мМ KH2PO4, 2 мМ EDTA, 1% "W / V" polyvinylpyrrolidone 40, 1% "W / V" сывороточной сыворотки, 5 мМ L-цистеин, и 20 м. Отрегулируйте к pH 7.3 с KOH и стерилизовать фильтрацией.
  4. Приготовьте 100 мл буфера для мытья (WB), состоящего из 0,3 М сахарозы, 1 мМ EGTA и 10 мМ MOPS (3-(N-morpholino)пропанесульфоновая кислота). Отрегулируйте к pH 7.2 с NaOH и стерилизовать фильтрацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается подготовить EB и WB с использованием DEPC-обработанных деионизированных H2O.
  5. Соберите 20 г развивающихся ядер через 11–20 дней после опыления (DAP) в трубку 50 мл, размещенную на льду, а затем перенесите ядра в предварительно охлажденные минометы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соотношение 100 мл EB до 20 г ядер кукурузы.
  6. Добавьте 10-20 мл ледяного EB к каждому раствору и полностью измельчите ядра.
  7. Добавить больше EB, и фильтровать землю тканей через два слоя фильтра ткани (Таблица материалов).
  8. Centrifuge фильтрата на 8000 х г в течение 10 минут, и отбросить гранулы.
  9. Перенесите супернатант на новую трубку и центрифугиего на 20000 х г в течение 10 минут.
  10. Налейте супернатант, и resuspend гранулы в 6 мл ВБ.
  11. Aliquot подвески до пяти 1,5 мл RNase-бесплатных труб, и центрифуга их на 14000 х г в течение 5 минут.
  12. Откажитесь от супернатанта, заморозьте митохондриальные гранулы в жидком азоте и храните при -80 градусах Цельсия.

3. Извлечение митохондриальной РНК

  1. Извлекайте митохондриальную РНК с помощью коммерческого реагента(Таблицаматериалов) в соответствии с инструкциями производства.
    ПРЕДЕКТО: Этот реагент содержит фенол и гуанидин изотиоцианат. Работайте с ним в дымовом капюшоне, и носите лабораторное пальто и перчатки.
  2. Растворите изолированную митохондриальную РНК в DEPC-обработанной деионизированной H2O, и оцените концентрацию РНК и чистоту с помощью спектрофотометра (Таблицаматериалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, митохондриальная РНК в размере 250 евро получается из 20 г ядер кукурузы 15-DAP.
  3. Приготовьте один агарозный гель, состоящий из 1x буфера TAE (40 мм Tris, 20 мм уксусной кислоты, 1мМ EDTA), 1,5% агарозы(Таблицаматериалов), и 1x ядерного окрашивания красителя (Таблицаматериалов).
  4. Добавьте соответствующий объем 10-кратного буфера загрузки (0,5% бромофенола синего, 0,5% ксилена цианола FF и 50% глицерола) и загрузите митохондриальную РНК/загрузку буферной смеси на 1,5% геля агарозы.
  5. Запустите гель в буфере 1x TAE на 5-6 V/cm в течение 20-25 мин, и оценить целостность митохондриальной РНК путем визуализации геля с системой документации геля(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие двух различных полос (3 510 евро и 1 970 nt для митохондриальных 26S и 18S rRNA, соответственно) является приемлемым стандартом для нетронутой митохондриальной РНК. Чтобы исключить возможную деградацию, целостность РНК должна быть исследована в течение нескольких этапов круговой подготовки РНК(рисунок 2).

4. РНК 5' Полифосфатаза Лечение

  1. Настройте полифосфатазу РНК 5'(Таблица и материалы)лечение (таблица1),и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30-60 мин.
  2. Восстановите 5' полифосфатазы обработанных РНК с РНК очистки комплекта (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Повторите шаги от 3,3 до 3,5.

5. Рнка Круговая

  1. Подготовьте две реакции круговой циркуляции, используя те же количества 5' полифосфатазы и необработанных митохондриальных РНК(Таблица 2), и инкубировать обе реакции при 16 градусов по Цельсию в течение 12-16 ч.
  2. Восстановить два набора самолигированных РНК с помощью того же комплекта, что и в шаге 4.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что только часть митохондриальной РНК будет самолигитированной, а восстановленная РНК будет смесью линейных и круговых транскриптов.
  3. Повторите шаги от 3,3 до 3,5.

6. Обратная транскрипция

  1. Синтезировать два набора кДНС из одного и того же количества циркулярных 5' полифосфатазных и необработанных РНК (200 нг).
  2. Подготовьте грунтовую смесь, добавив равное соотношение 26S-CRT и до 7 других праймеров RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация грунтовой смеси должна сосуться 1 км.
  3. Подготовка двух предварительной смеси путем объединения реагентов, перечисленных в таблице 3, инкубировать при 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем охладить на льду в течение 2 мин.
  4. Соберите две системы реакции RT(таблица4), и инкубировать их при 42 градусах по Цельсию в течение 50 минут.
  5. Нагрейте обе реакции RT при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем охладите их на льду.

7. Нормализация

  1. Подготовьте две реакции ПЦР, добавив тот же объем шаблона cDNAs, полученных из 5' полифосфатазы или необработанных РНК, расходящихся грунтовки, фланговые 5'-3 'соединения круговой 26S rRNA (т.е. 26S-CF1 и -CR1), и т.д. (Таблица 5).
  2. Выполнить две реакции в тепловой циклатор (Таблица материалов) в условиях, описанных в таблице 6.
  3. Приготовьте один агарозный гель, состоящий из буфера 1x TAE, 1,0% агарозы и 1x ядерного окрашивания красителя.
  4. Добавьте 2 буфера загрузки 10x (0,5% бромофенол синий, 0,5% ксилена цианола FF, и 50% глицерола) к каждому из двух продуктов ПЦР, и загрузить их на гель.
  5. Запустите гель в буфере 1x TAE на 5-6 V/cm в течение 30-40 мин, и изображение его с помощью той же системы документации геля, как шаг 3.5.
  6. Сравните обилие двух продуктов PCR с помощью компьютерного программного обеспечения(Таблица материалов, Рисунок 4A),и оптимизировать нормализацию путем изменения количества шаблонов cDNAs при необходимости.

8. Усиление ПЦР

  1. Подготовьте пары реакций ПЦР, добавив соответствующий объем нормализованных cDNA и пару дивергентных грунтовок фланговых 5'-3'соединения целевых транскриптов(Таблица 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество шаблонов cDNA, используемых для pcR-усиления целевых транскриптов, определяется результатами нормализации 26S rRNA.
  2. Выполните реакции ПЦР в соответствии с программой, описанной в таблице 8.
  3. Повторите шаги от 7,3 до 7,5.
  4. Изменение вложенных дивергентных праймеров и проверка результатов ПЦР в первом раунде, повторяя шаги 8.1 и 8.2.
  5. Повторите шаги от 7,3 до 7,5.
  6. Восстановить видные полосы, которые могут быть повторены в двух раундах pcR усиления с помощью комплекта гель ДНК восстановления(Таблица материалов).

9. Определение Стенограммы Термини

  1. Клонировать гель-очищенные продукты ПЦР в тупой вектор(Таблица материалов) с использованием стандартных методов.
  2. Выполните колонии PCR, чтобы выбрать положительные клоны, содержащие целевые вставки, и последовательности их коммерчески.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные клоны, содержащие вставки с переменным размером, как правило, обнаруживаются из одной восстановленной полосы, потому что многие устойчивые состояния стенограммы в митохондриальной растении имеют неоднородные 5' и / или 3' концы1,12.
  3. Выравнивание данных по секвенированию с митохондриальным геномом кукурузы с помощью базового инструмента локального поиска выравнивания (BLAST) национального центра биотехнологической информации (NCBI). Выберите организм "кукуруза (такси:4577)", а также поисковую базу данных "Нуклеотидная коллекция (nr/nt)".
  4. Найдите 5'-3' соединение круговой стенограммы, и определить позиции 5' и 3' транскрипт termini.
  5. Рассчитайте размер целевых транскриптов.

10. Проверка результатов картирования cRT-PCR с помощью гибридизации РНК Гель Блот

ПРИМЕЧАНИЕ: Гибридизация РНК-гель-помарки осуществляется с помощью коммерческого комплекта(Таблицаматериалов), который содержит реагенты для транскрипции маркировки РНК с дигоксигенином (DIG) и Полимеразой РНК T7, гибридизацией и иммунологическим обнаружением. Для более подробной информации о протоколах, представленных в этом комплекте, обратитесь. Убедитесь, что только RNase бесплатное оборудование используется для всей процедуры.

  1. Усильте фрагмент ДНК, используемый для подготовки РНК-зонда, и клоните его до того же вектора, что и в шаге 9.1, который содержит промоутер T7 17 bp вверх по течению от места вставки.
  2. Линейная конструкция с использованием надлежащего фермента ограничения, восстановить линейной плазмиды с помощью комплекта очистки ДНК(Таблицаматериалов), и растворить его в DEPC-обработанных деионизированных H2O.
  3. Этикетка РНК зондов с DIG-11-UTP по коммерческому комплекту (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Подготовка 500 мл 10x MOPS буфера (0,2 M MOPS, 50 мм ацетат ацетат ацетат ацетата натрия, и 10 мм EDTA) с помощью DEPC-обработанных деионизированных H2O. Отрегулируйте pH 7.0 на NAOH, и стерилизовать путем фильтрации.
  5. Добавьте 2-3 тома погрузочного буфера (50% формамида, 6,2% формальдегида, 1x MOPS, 10% глицерола и 0,1% бромфенола синего) к митохондриальной РНК, подготовленной шагами 3,1-3,3.
  6. Денатурная образец РНК/загрузка буферной смеси при 65 градусах по Цельсию в течение 10 мин, а затем охладите на льду в течение 1 мин.
  7. Приготовьте денатурированный гель агарозы (2% формальдегида, 1,2% агарозы и 1x MOPS) и загрузите образец РНК/Загрузка буферной смеси на гель (1-2 мкг митохондриальной РНК на скважину).
  8. Выполнить гель в 1x MOPS на 3-4 V /cm для 4 ч.
  9. Подготовка 2 L из 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0). Лечить его с 0,1% DEPC ночь, и стерилизовать автоклавом.
  10. Промыть гель дважды в 20x SSC (15 минут каждый раз), и передать гель РНК нейлоновой мембраны (Таблица материалов) капиллярной передачи с 20x SSC для 10-16 ч.
  11. Зафиксировать РНК в мембрану, выпекая при 120 градусах По Цельсия в течение 30 мин.
  12. Выполните гибридизацию РНК и иммунологическое обнаружение с помощью коммерческого комплекта(Таблица материалов) в соответствии с инструкцией производителя.

11. Дискриминация первичных и обработанных 5' концов

  1. Различать первичные и обработанные 5', сравнивая продукты cRT-PCR, полученные из нормализованных 5' полифосфатазных и необработанных РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для первичных стенограмм, обилие ПЦР продуктов из 5 'полифосфатазы обработанных РНК гораздо выше, чем от необработанных аналогов(Рисунок 1, "Гена А", и Рисунок 4A). Однако, к обработанным транскриптам, соответствующий уровень продуктов PCR был бы усилен от 2 комплектов митохондриальных RNAs(рисунок1, 'Gene B').
  2. Дизайн праймеров RT-qPCR на основе результатов картирования cRT-PCR.
  3. Проверить результаты дискриминации cRT-PCR по RT-qPCR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два образца кДНК, полученные из 5' полифосфатазных и необработанных РНК, нормализованы продуктами РТ-кПЦР 26S зрелой рРНК.

Результаты

Оценка эффективности циркуляризации митохондриальной РНК

В предыдущем исследовании, как общий и митохондриальной РНК были использованы для cRT-PCR картирования митохондриальной транскрипт термини в Arabidopsis (Arabidopsis thaliana

Обсуждение

В предыдущем исследовании, всего и митохондриальных РНК из клеточной культуры подвески Arabidopsis были использованы для картирования митохондриальной транскрипт термини cRT-PCR, и аналогичные результаты были получены12. Однако, только обогащенная митохондриальная РНК была ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 31600250, Y.З.), Научно-технические проекты города Гуанчжоу (грант No 201804020015, H.N.), и Китайской системой сельскохозяйственных исследований (грант No). КАРС-04-PS09, H.N.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidAladdin, ChinaA112880To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerThermo Fisher Scientific, USA4359659Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acidSigma-aldrich, USAV900134For preparation of extraction buffer
Biowest AgaroseBiowest, Spain9012-36-6To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albuminSigma-aldrich, USAA1933For preparation of extraction buffer
Bromophenol blueSigma-aldrich, USAB8026For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPCSigma-aldrich, USAV900882Deactivation of RNase
DIG Northern starter kitRoche, USA12039672910For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTASigma-aldrich, USAV900106For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTASigma-aldrich, USAE3889For preparation of wash buffer
Gel documentation systemBio-Rad, USAGel Doc XR+To image the agarose gel
GlycerolSigma-aldrich, USAG5516For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x)Solarbio,. ChinaG8142DNA staining
Hybond-N+, Nylon membraneAmersham Biosciences, USARPN119For Northern blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4Sigma-aldrich, USAV900041For preparation of extraction buffer
KOHAladdin, ChinaP112284For preparation of extraction buffer
L-cysteineSigma-aldrich, USAV900399For preparation of extraction buffer
MillexMillipore, USASLHP033RBTo sterile extraction and wash buffers by filtration
MiraclothCalbiochem, USA475855-1RTo filter the ground kernel tissues
MOPSSigma-aldrich, USAV900306For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDropThermo Fisher Scientific, USA2000CFor RNA concentration and purity assay
NaOHSigma-aldrich, USAV900797For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vectorTransGen Biotech, ChinaCB111Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymeraseVazyme, ChinaP505DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40Sigma-aldrich, USAV900008For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, USAPrimer Premier 6.24To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptaseTakara, Japan2690To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kitThermo Fisher Scientific, USA12183025For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphataseEpicentre, USARP8092HTo convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitorNew England Biolabs, UKM0314A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetateSigma-aldrich, USAV900212For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chlorideSigma-aldrich, USAV900058To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixesBio-Rad, USA1725202For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs, UKM0437For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphateSigma-aldrich, USA221368For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kitTiangen Biotech, ChinaDP209To purify DNA fragments from agarose gel
TrisAladdin, ChinaT110601To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagentInvitrogen, USA15596026To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kitTiangen Biotech, ChinaDP214To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FFSigma-aldrich, USAX4126For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

Ссылки

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149RT PCRRT PCR5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены