JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم طريقه قياس التدفق الخلوي للتعرف علي أنواع مختلفه من الخلايا التي يتم استردادها من دماغ الماوس أو الحبل الشوكي في نفس الوقت. ويمكن استغلال هذه الطريقة لعزل أو توصيف مجموعات الخلايا النقية في الامراض التنكسية العصبية أو لقياس مدي استهداف الخلايا في الاداره المجرية لنواقل أو جسيمات نانويه فيروسية.

Abstract

وقد فتحت التطورات الاخيره في مجال النواقل الفيروسية والعلوم النانوماتيرياله الطريق امام نهج متطورة جديده للتحقيق في الجهاز العصبي المركزي أو التلاعب به (CNS). ومع ذلك ، فان الاستفادة المثلي من هذه التكنولوجيات ستستفيد من الأساليب التي تسمح بالتحديد السريع والمبسط لمدي التركيز العصبي الخلوي والاستهداف الخاص بالخلايا علي أداره النواقل الفيروسية أو الجسيمات النانويه في الجسم. هنا ، نقدم البروتوكول الذي يستفيد من الانتاجيه العالية وقدرات الإرسال المتعدد لقياس التدفق الخلوي للسماح بالتحديد الكمي المباشر للأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا المعزولة عن دماغ الماوس أو الحبل الشوكي ، اي الخلايا الصغيرة/الضامة ، اللمفاويات ، استروسينتيس نحن نطبق هذا النهج لتسليط الضوء علي الاختلافات الحاسمة بين طريقتين تجانس الانسجه من حيث الغلة الخلية ، والقدرة علي البقاء والتكوين. وهذا يمكن ان يرشد المستخدم لاختيار أفضل طريقه اعتمادا علي نوع (s) الخلية من الفائدة وتطبيق معين. هذا الأسلوب غير مناسب لتحليل التوزيع التشريحي ، لان النسيج متجانس لتوليد تعليق خليه واحده. ومع ذلك ، فانه يسمح للعمل مع خلايا قابله للحياة وانه يمكن الجمع بين الخلية الفرز ، فتح الطريق امام العديد من التطبيقات التي يمكن ان توسع ذخيرة الاداات في ايدي الأعصاب ، بدءا من إنشاء الثقافات الاوليه المستمدة من الخلايا النقية ، إلى تحليلات التعبير الجيني والاختبارات البيوكيميائية أو الوظيفية علي الأنواع الفرعية المحددة جيدا في سياق امراض الأعصاب

Introduction

أصبحت تقنيات توصيل الجينات والادويه (مثل النواقل الفيروسية والجسيمات النانويه) أداه قويه يمكن تطبيقها للحصول علي رؤى أفضل حول المسارات الجزيئية المحددة التي تم تغييرها في امراض الأعصاب ولتطوير الطرق العلاجية المبتكرة1،2،3. وتعتمد الاستفادة المثلي من هذه الاداات علي القياس الكمي لما يلي: (1) مدي التغلغل في الجهاز العصبي العام عند طرق الاداره المختلفة و (2) استهداف فئات معينه من الخلايا. وعاده ما يتم تطبيق التحليلات النسيجية لتصور الجينات مراسل الفلورسنت أو فلوريسسينتلي الموسومة النانويه في مختلف المناطق العصبية وعبر أنواع الخلايا المختلفة ، التي حددتها المناعية لعلامات خليه محدده4،5. وعلي الرغم من ان هذا النهج يوفر معلومات قيمه عن التوزيع الإحيائي للجينات التي تدار بالجينات أو أدوات تسليم المخدرات ، فان هذه التقنية يمكن ان تستغرق وقتا طويلا وتكون كثيفه العمالة لأنها تتطلب: (1) تثبيت الانسجه ، أو الحفظ بالتبريد ، أو تضمين البارافين وتقطيعها ؛ (2) تلطيخ لعلامات خلوية محدده تتطلب أحيانا استرجاع مستضد ؛ (3) الاستحواذ عن طريق المجهر الفلوري ، الذي يسمح عاده بتحليل عدد محدود من العلامات المختلفة في نفس التجربة ؛ (4) معالجه الصور للسماح بالتحديد الكمي المناسب لاشاره الفائدة.

وقد أصبح التدفق الخلوي تقنيه تستخدم علي نطاق واسع والتي تستفيد من علامات الفلورسنت محدده جدا للسماح ليس فقط التقييم الكمي السريع لمختلف الظواهر الخلوية في تعليق الخلية ، استنادا إلى التعبير عن المستضدات السطحية أو داخل الخلايا ، ولكن أيضا قياسات وظيفية (مثل معدل المبرمج ، والانتشار ومن الممكن أيضا العزل المادي للخلايا من خلال فرز خلايا الفلورسنت المنشطة ، مما يسمح بالمزيد من التطبيقات النهائية (علي سبيل المثال ، ثقافة الخلايا ، RNAseq ، التحاليل البيوكيميائية الخ) 6،7،8.

تجانس الانسجه هو خطوه حاسمه ضرورية للحصول علي تعليق خليه واحده للسماح موثوق بها وقابله للتكرار التقييمات الخلوية تدفق المصب. وقد وصفت طرق مختلفه لتجانس انسجه المخ الكبار ، وذلك أساسا بهدف عزل الخلايا الدقيقة الصغرى9،10،11؛ ويمكن تصنيفها بشكل عام في فئتين رئيسيتين: (1) التفكك الميكانيكي ، الذي يستخدم الطحن أو القص القوه من خلال الخالط Dounce (DH) لتمزيق الخلايا من منافذها وتشكيل تعليق خليه واحده متجانسة نسبيا ، و (2) الهضم الانزيمي ، الذي يعتمد علي احتضان قطع الانسجه المفرومة في 37 درجه مئوية في وجود الانزيمات البروتينية ، مثل التريبسين أو بابين ، لصالح تدهور المصفوفة خارج الخلية لإنشاء تعليق خليه متجانسة إلى حد ما12.

بغض الفضل عن الطريقة التي يتم استخدامها ، ينصح خطوه تنقيه بعد تجانس الانسجه لأزاله الميلين من خلال طرد علي التدرج الكثافة أو عن طريق اختيار المغناطيسي9،12، قبل الانتقال إلى التطبيقات المصب.

هنا ، ونحن وصف طريقه معالجه الانسجه علي أساس الهضم بابين (PD) تليها تنقيه علي التدرج الكثافة ، الأمثل للحصول علي تعليق الخلايا غير المتجانسة قابله للحياة من الدماغ الماوس أو الحبل الشوكي في طريقه حساسة للوقت ومناسبه لقياس التدفق الخلوي. وعلاوة علي ذلك ، فاننا وصف لوحه التدفق الخلوي 9 لون واستراتيجية النابضة التي اعتمدناها في المختبر للسماح التمييز في وقت واحد من مختلف السكان CNS ، والخلايا الحية/الميتة أو الايجابيه للصحفيين الفلورسنت مثل البروتين الفلوري الأخضر أو صبغ الرومين. من خلال تطبيق هذا التحليل الخلوي التدفق ، يمكننا مقارنه الطرق المختلفة لمعالجه الانسجه ، اي PD مقابل DH ، من حيث الحفاظ علي القدرة الخلوية والغلة من أنواع الخلايا المختلفة.

التفاصيل التي نقدمها هنا يمكن ان توعز قرار بشان بروتوكول التجانس وتركيبه الأجسام المضادة لاستخدامها في لوحه تدفق الخلوي ، استنادا إلى نوع الخلية المحددة (ق) من الفائدة والتحليلات المصب (علي سبيل المثال ، حساسة لدرجه الحرارة التطبيقات ، وتتبع علامات الفلورسنت محدده ، في المختبر الثقافة ، والتحليلات الوظيفية).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية (IACUC) في معهد دانا فاربر للسرطان (البروتوكول رقم 16-024).

1-اعداد الحلول اللازمة للتجربة

  1. أعد 1x محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) عن طريق تمييع 10x HBSS بالماء المعقم. قبل البرد الحل علي الجليد. هناك حاجه إلى 25 مل علي الأقل من الحل لكل عينه.
  2. اعداد محلول Percoll متساوي النظائر (IPS) عن طريق خلط 10x العقيمة HBSS 1:10 مع الكثافة التدرج المتوسط (اي Percoll). قبل البرد علي الجليد.
    ملاحظه: يمكن تخزين IPS لمده تصل إلى 30 يوما في 4 درجه مئوية.
  3. اعداد محلول التدفق الخلوي (FACS) حجب (BL) الحل (1 ٪ الزلال المصل البقري [جيش الصرب البوسنيين] ، 5 ٪ مصل الأبقار الجنينية في الفوسفات-مخزنه المالحة [تلفزيوني]). قبل البرد علي الجليد.

2. القتل الرحيم الحيواني من خلال التروية الدماغية وتشريح الانسجه

ملاحظه: تم استخدام الفئران C57BL/6J القديمة ثمانيه أسابيع ، اما الجنس ، في التجارب. يتم تنفيذ perfusion مع حل تلفزيوني للقضاء علي تلوث الدم من الأعضاء ، قبل المضي قدما في هضم الانسجه.

  1. تخدير الماوس باستخدام خليط من الكيتامين/اكسيليازين (90 − 200 مغ/كغ الكيتامين ، 10 مغ/كغ اكسيليازين). ضع الماوس علي ظهره والشريط كل طرف وصولا إلى الدعم. تحقق من عمق كاف من التخدير عن طريق التحقق من منعكس الانسحاب.
  2. جعل شق الجلد الخط الأوسط علي مستوي مدخل الصدر لفضح القص. استخدام ملقط لفهم غيض من عظم القص ، ثم جعل واحده شق 1 سم علي كل جانب من القفص الصدري. وأخيرا قطع من خلال الحجاب الحاجز وفتح القص علي نطاق واسع بما يكفي لتصور القلب.
  3. استخدم الملقط لامساك القلب برفق بالبطين الأيمن ورفعه إلى الخط الوسطي والخروج قليلا من الصدر.
  4. ادخل ابره فراشه 23 غ في طرف البطين الأيسر ، نحو الشريان الابهر وتمسك بثبات.
  5. بدء ترويه مع 1x تلفزيوني. يخترق من خلال الأذين الأيمن باستخدام مقص للسماح perfusate للخروج من الدورة الدموية. تعيين معدل تدفق تلفزيوني في 3 مل/دقيقه. Perfuse مع ما لا يقل عن 15 مل من 1x تلفزيوني لضمان الانسجه واضحة.
    ملاحظه: الابيضاض من الكبد والاوعيه الدموية المساريقي علامات التروية جيده. إذا لزم الأمر ، يمكن زيادة حجم ما قبل الانصهار حتى السائل الخروج من القلب واضح من الدم ، وعند هذه النقطة يمكن إيقاف خط دافق.
  6. بعد الانصهار ، قطع الدماغ من الحبل الشوكي وأزاله الدماغ من الجمجمة مع مقص وملقط. أزاله الفراء لزيادة الرؤية والسيطرة خلال تشريح وتجنب حمل أكثر من ملوثات الشعر. مسح الحبل الشوكي من العمود الخاص به باستخدام حقنه 3 مل مليئه بالتلفزيونية.
  7. نقل كل الانسجه في بئر من 6-بئر متعددة حسنا لوحه معباه مع 2 مل من الجليد الباردة 1x HBSS والحفاظ علي الجليد حتى الهضم.
  8. يقسم الدماغ والحبل الشوكي إلى نصفين ، علي طول الخط الطولي.
    ملاحظه: يتم تجانس نصف كل نسيج (انظر الأقسام أدناه) للسماح بتحليلات التدفق الخلوي ؛ ويمكن تعيين النصف الآخر لمعالجه مختلفه للتحليلات البديلة (علي سبيل المثال ، انخفض في محلول مثبت بارافورماليتيف لأنسجه النسيج).

3. الهضم الانزيمي للدماغ والحبل الشوكي

ملاحظه: وحدات التخزين الموصوفة في هذا القسم كافيه لهضم نصف الدماغ أو الحبل الشوكي.

  1. استخدمي مقصا لفرم الانسجه في قطعه واحده سميكه بسماكة 1 − 2 مم.
  2. قطع غيض من ماصه 1000 μL مع زوج من مقص لجعلها كبيره بما فيه الكفاية للسماح لجمع قطع الانسجه. قبل شطف طرف الماصة باستخدام 1x HBSS. ثم استخدم الماصة لنقل 2 مل من محلول HBSS الذي يحتوي علي النسيج المفروم إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
    ملاحظه: الشطف المسبق لطرف الماصة مهم لمنع التصاق قطع الانسجه داخل الطرف.
  3. اغسل البئر مع 2 مل إضافي من الثلج البارد 1x HBSS ونقل الحل إلى أنبوب مخروطي 15 مل المقابلة التي تحتوي علي قطع الانسجه.
  4. الطرد المركزي كل عينه لمده 5 دقائق في 250 x g في 4 ° c.
  5. اعداد مزيج الانزيم 1 من مجموعه التفكك الانسجه العصبية (NTDK; جدول المواد) عن طريق خلط 50 μL من انزيم P مع 1900 μL من المخزن المؤقت X لكل عينه. مزيج الانزيم الدافئ 1 عند 37 درجه مئوية في حمام مائي. احتضان مزيج انزيم 1 في 37 درجه مئوية لمده 10 دقائق علي الأقل قبل الاستخدام من أجل السماح للتنشيط الكامل لانزيم.
  6. يستنشق ماده طافي من أنبوب مخروطي 15 مل وأضافه 1.95 مل من مزيج انزيم 1 لكل عينه. دوامه بلطف للتاكد من أعاده تعليق بيليه.
  7. احتضان العينات علي عجله أو شاكر لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  8. في هذه الاثناء ، واعداد مزيج انزيم 2 من NTDK عن طريق خلط 10 μL من الانزيم A مع 20 μL من العازلة Y لكل عينه ؛ قبل الحارة الحل عند 37 درجه مئوية في حمام مائي.
  9. في نهاية الحضانة مع مزيج انزيم 1 ، أضافه 30 μL من مزيج الانزيم 2 لكل عينه.
  10. امزج العينات برفق عن طريق الشطف لاعلي ولأسفل باستخدام طرف ماصه بسعة 1000 μL مع 1 × HBSS.
  11. احتضان العينة علي عجله أو شاكر لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  12. بعد الحضانة ، أضافه 10 مل من البرد الجليدي 1x HBSS لكل أنبوب لتنشيط مزيج انزيم 1 ومزيج الانزيم 2.
  13. الطرد المركزي كل عينه لمده 10 دقيقه في 320 x g في 4 ° c.
  14. تجاهل سوبرناتانت. أضافه الجليد الباردة 1x HBSS لكل أنبوب يصل إلى حجم النهائي من 7 مل وأعاده التعليق بلطف بيليه بواسطة vortexing.
  15. الاستمرار في القسم 5 لأزاله الحطام.

4. التجانس الميكانيكي للدماغ والحبل الشوكي

ملاحظه: وحدات التخزين الموصوفة في هذا القسم كافيه لتجانس نصف الدماغ أو الحبل الشوكي. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف في هذا القسم كطريقه بديله للطريقة الموصوفة في القسم 3 ، حسب حاجه المستخدم كما هو موضح أدناه.

  1. قبل البرد الزجاج هاون من طاحونة الانسجه داونصه (جدول المواد) تعيين علي الجليد.
  2. أضافه 3 مل من قبل المبردة 1x HBSS إلى هاون.
  3. نقل الانسجه (الدماغ أو الحبل الشوكي) من بئر 6-بئر لوحه في هاون الزجاج التاكد من انها انخفضت في 1x HBSS ويجلس في الجزء السفلي من هاون.
  4. سحق بلطف الانسجه مع 10 السكتات الدماغية من مدقه A تليها 10 السكتات الدماغية من مدقه b. نقل مزيج متجانسة إلى أنبوب مخروطي جديد 15 مل.
  5. ملء أنبوب لحجم النهائي من 10 مل باستخدام قبل المبردة 1x HBSS وأجهزه الطرد المركزي لمده 10 دقيقه في 320 x g في 4 ° c.
  6. يستنشق ماده طافي وأضافه الجليد الباردة 1x hbss لكل أنبوب يصل إلى حجم النهائي من 7 مل وأعاده التعليق بلطف بيليه بواسطة vortexing.
  7. الاستمرار في القسم 5 لأزاله الحطام.

5-أزاله الأنقاض

ملاحظه: أزاله الأنقاض ، التي تتكون أساسا من الانسجه غير المهضومة والمروج المايلين ، هي خطوه حاسمه للسماح تلطيخ فعاله من الانسجه المتجانسة للتحليلات الخلوية تدفق اللاحقة.

  1. تصفيه كل عينه من خلال مصفاه الخلية 70 μm لأزاله اي قطعه الانسجه غير مهضوم. هذه الخطوة مهمة بشكل خاص عند العمل مع انسجه الحبل الشوكي لان هذه العينات هي أكثر عرضه لاحتواء شظايا العصب غير مهضوم أو السحايا التي يمكن ان تؤثر علي الخطوات اللاحقة.
  2. تاكد من ان حجم النهائي هو 7 مل في كل أنبوب عينه. ان لم يكن ، وملء مع الجليد الباردة 1x HBSS تصل إلى 7 مل.
  3. أضافه 3 مل من IPS قبل المبردة لكل عينه لجعل حجم النهائي من 10 مل من محلول يحتوي علي متوسط التدرج الكثافة في 30% تركيز نهائي. دوامه بلطف العينات للتاكد من انها مختلطة متجانسة.
  4. عينات الطرد المركزي لمده 15 دقيقه في 700 x g في 18 °c التاكد من تعيين تسارع الطرد المركزي إلى 7 والفرامل إلى 0.
    ملاحظه: يجب ان يستغرق طرد حوالي 30 دقيقه.
  5. أزاله العينات بدقه من جهاز الطرد المركزي.
    ملاحظه: يجب ان يكون القرص الأبيض المكون من الحطام والميالين مرئيا عائما علي سطح المحلول. بيليه (التي تحتوي علي خلايا الفائدة) يجب ان تكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب.
  6. يستنشق بعناية كل القرص الأبيض من الحطام ومن ثم بقية ماده طافي التاكد من عدم أزاحه بيليه. ترك حوالي 100 μL من الحل علي راس بيليه الخلية لتجنب خطر التفكك عن غير قصد.
  7. أضافه 1 مل من FACS BL ، أعاده تعليق بيليه عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا مع غيض ماصه 1000 μL ونقل عينات إلى أنابيب 1.5 mL.
  8. الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 450 x g في درجه حرارة الغرفة (RT).
  9. يستنشق بلطف ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في المخزن المؤقت المناسب متوافق مع التحليلات المصب (انظر القسم 6 للبروتوكول المستخدمة لتقييم تدفق الخلوية من أنواع متعددة من الخلايا).

6. تلطيخ لتقييم تدفق الخلوي لأنواع متعددة من الخلايا

  1. أعاده تعليق بيليه الحصول عليها في الخطوة 5.9 مع 350 μL من FACS BL. أضافه Fc-بلوك لكل عينه في تركيز نهائي من 5 ميكروغرام/مل.
    ملاحظه: يجب استخدام ما لا يقل عن 100 μL من العينة لتلطيخ واحد ، للتاكد من معالجه ما يكفي من الخلايا للسماح تحليلات موثوق بها.
  2. احتضان العينة لمده 10 دقيقه في 4 درجه مئوية قبل المضي قدما في تلطيخ.
  3. اعداد مزيج الأجسام المضادة وفقا للجدول 1.
  4. أضافه مزيج الأجسام المضادة لكل أنبوب ، دوامه ل 5 ليالي واحتضان العينات لمده 15 دقيقه في 4 درجه مئوية في الظلام.
  5. أضافه 1 مل من تلفزيوني لكل أنبوب ، دوامه والطرد المركزي لمده 5 دقائق في 450 x g في RT.
  6. وفي الوقت نفسه اعداد العقديات مزيج وفقا للجدول 1.
  7. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في مزيج العقديات التي أعدت في الخطوة 6.6. لكل عينه ، استخدم نفس وحده التخزين كواحده المستخدمة لتلطيخ في الخطوة 6.4.
  8. دوامه لمده 5 ليالي واحتضان عينات لمده 10 دقيقه في 4 درجه مئوية في الظلام.
  9. أضافه 1 مل من تلفزيوني لكل أنبوب ، دوامه والطرد المركزي لمده 5 دقائق في 450 x g في RT.
  10. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في facs bl. استخدام 300 μl من facs bl لكل 100 μl من عينه ملطخه.
  11. أضافه 7-امينو-اكتيمومايسين D (7-عاد) حل لكل عينه. استخدام 5 μL من 7-عاد لكل 300 μL من عينه أعدت في الخطوة 6.10.
  12. يخزن العينات عند درجه حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى التحليل الخلوي. اجراء التحليل في غضون 16 ساعة من اعداد العينة ، لضمان بقاء الخلية > 60 ٪.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

قارننا طريقتين تجانس مختلفه (DH مقابل PD) تطبيقها علي الدماغ الماوس والحبل الشوكي ، لاختبار الكفاءة في استرداد أنواع الخلايا القابلة للحياة مختلفه مناسبه للتطبيقات المصب. للقيام بذلك ، قمنا باستغلال 9-لون تدفق لوحه الخلوي مصممه لتوصيف ، في نفس العينة ، وأنواع مختلفه من الخلايا العصبية بما ف?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا نحن وصف بروتوكول لتنقيه المشتركة والمتزامنة تحليل التدفق الخلوي لبعض الخلايا العصبية الأكثر صله من الدماغ الماوس والحبل الشوكي. تقليديا ، تم تطبيق التحليلات النسيجية لوصف توزيع الجسيمات النانويه أو كفاءه المحولات الفيروسية في CNS5،13، أو لتوفير رؤى حول ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسة من قبل مستشفي الأطفال بوسطن لبدء الأموال إلى A.B., ALSA منحه nr. IIP-343 إلى عضو البرلمان ، ومكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية من خلال برنامج بحوث التصلب الجانبي الضموري تحت الجائزة رقم W81XWH-17-1-0036 إلى عضو البرلمان ونحن نعترف DFCI تدفق الخلوية الاساسيه للدعم التقني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)Gibco14185-052
70 mm Cell StrainerCorning431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibodyMiltenyi Biotec130-117-535APC conjugated
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibodyInvitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibodyBD Bioscience562939BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibodyBiolegend103138Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibodyBiolegend202518PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibodyBiolegend1005325PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)CellTreat229411
Conical Tubes (50 mL)CellTreat229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibodyBD Pharmingen553142
Fetal Bovine SerumBenchmark100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibodyMiltenyi Biotec130-095-895Biotin conjugated
PercollGE Healthcare10266569sold as not sterile reagent
PercollSigma65455529sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01reagent containing very low traces of endotoxin
StreptavidinInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 conjugated

References

  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371(2019).
  3. Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67(2019).
  4. Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272(2016).
  5. Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
  6. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  7. Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
  8. Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
  9. Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
  10. Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
  11. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635(2012).
  12. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
  13. Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
  14. Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
  15. Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
  16. Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
  17. Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153 oligodendrocytes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved