אפיון מרובה של סוגי תאים שאוחזרו ממוח העכבר/חוט השדרה דרך שיטות הומוקות שונות

Summary

אנו מציגים שיטת הזרמה cy, כדי לזהות בו סוגי תאים שונים שאוחזרו ממוח העכבר או חוט השדרה. שיטה זו יכול להיות מנוצל כדי לבודד או לאפיין אוכלוסיות תאים טהורה במחלות ניווניות או לכמת את היקף המיקוד של התא על vivo ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים.

Abstract

ההתקדמות האחרונה ב וקטורים וקטוריים ומדעי הננו פתחו את הדרך לגישות חדשניות לקידום החקירה או לטיפול במערכת העצבים המרכזית (CN). עם זאת, אופטימיזציה נוספת של טכנולוגיות אלה היה להפיק תועלת מהשיטות המאפשרות מהירה ולייעל את היקף מידת המיקוד הספציפי לתא על ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים בגוף. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אשר מנצל את התפוקה הגבוהה ואת יכולות ריבוב של זרימה cy, נסה לאפשר כימות ישירה של תת תאים שונים מבודדים ממוח העכבר או חוט השדרה, כלומר microglia/מקרופאגים, לימפוציטים, astrocytes, oligodendrocytes הפוך, נוירונים ותאי אנדותל. אנו מיישמים גישה זו כדי להדגיש הבדלים קריטיים בין שתי שיטות הומוקות רקמות במונחים של התשואה התא, הכדאיות והקומפוזיציה. הדבר יכול להורות למשתמש לבחור את השיטה הטובה ביותר בהתאם לסוג התא (ים) של עניין וליישום הספציפי. שיטה זו אינה מתאימה לניתוח של התפלגות אנטומית, שכן הרקמה היא הומוגניים כדי ליצור השעיה תא בודד. עם זאת, הוא מאפשר לעבוד עם תאים קיימא והוא יכול להיות משולב עם מיון תאים, פתיחת הדרך עבור מספר יישומים שיכולים להרחיב את הרפרטואר של כלים בידיים של נוירומדען, החל הקמת התרבויות הראשיות נגזר אוכלוסיות תאים טהורים, לניתוח גנים ביטוי ביוכימיים או פונקציונלי מוגדר על תת-מוגדרים היטב תאים בהקשר של מחלות ניווניות, על טיפול תרופתי או טיפול גנטי.

Introduction

ג'ין וטכנולוגיות משלוח התרופה (כגון וקטורים וקטורי חלקיקים) הפכו כלי רב עוצמה שניתן להחיל כדי להשיג תובנות טובות יותר על מסלולים מולקולריים ספציפיים שונה במחלות ניווניות ולפיתוח גישות טיפוליות חדשניות^1,2,3. אופטימיזציה של כלים אלה מסתמך על כימות של: (1) את היקף החדירה בתוך ה-CN על נתיבי שונים של ניהול ו (2) פילוח של אוכלוסיות תאים ספציפיות. ניתוחים היסטלוגיים מוחלים בדרך כלל על הדמיה של הכתב הפלורסנט גנים או fluorescently אופן מתויג חלקיקים באזורים שונים של המרכז העצמי ועל פני סוגי תאים שונים, מזוהה על ידי כתמים חיסוני עבור סמנים תא ספציפיים^4,5. למרות גישה זו מספקת מידע רב ערך על ההתפלגות הביומלית של הגן המנוהל או כלי משלוח התרופות, הטכניקה יכולה להיות גוזלת זמן עבודה אינטנסיבית מאז שהוא דורש: (1) קיבוע רקמות, הקפאה או פרפין-הטבעה וחותך; (2) כתמים עבור סמנים סלולריים ספציפיים לעתים דורשים אחזור אנטיגן; (3) רכישה של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית, אשר בדרך כלל מאפשר ניתוח של מספר מוגבל של סמנים שונים בתוך אותו ניסוי; (4) עיבוד תמונה כדי לאפשר קוונפיקציה נאותה של אות הריבית.

הפכה cy, להיות טכניקה בשימוש נרחב אשר מנצל סמני פלורסנט ספציפיים מאוד כדי לאפשר לא רק הערכה כמותית מהירה של פנוטיפים תא שונים בשעיות התא, מבוסס על הביטוי של אנטיגנים או משטחים, אלא גם מדידות תפקודית (g., שיעור של אפופטוזיס, התפשטות, ניתוח מחזור התא, וכו '). בידוד פיזי של תאים באמצעות פלורסנט מופעל מיון התא אפשרי גם, המאפשר במורד הזרם יישומים (למשל, תרבות התא, RNAseq, ניתוחים ביוכימיים וכו ') . ^{שש,שבע,שמונה}

המגון רקמה היא צעד קריטי הכרחי כדי לקבל השעיית תא בודד כדי לאפשר אמין ומלא להזרים הערכות בזרם הסייטומטרימטרי. שיטות שונות תוארו עבור למבוגרים רקמת המוח המגון, בעיקר עם המטרה לבודד תאים מיקרוגלייה^9,10,11; הם יכולים להיות מסווגים באופן כללי בשתי קטגוריות עיקריות: (1) דיסוציאציה מכנית, אשר משתמשת שחיקה או הטיית כוח באמצעות הומוגניד Dounce (DH) כדי לקרוע את התאים מתוך נישות שלהם וליצור הבולם הומוגניים באופן יחסי הולם התא היחיד, ו (2) העיכול האנזימטי, המסתמך על דגירה של נתחי רקמות טחון ב-37 ° c בנוכחות אנזימים בעלי חרדה, כגון טריפסין או פאפאין, העדפה על השפלה של המטריצה המגמטית ליצור השעיית תאים הומוגניים למדי¹².

ללא קשר לשיטה מנוצל, צעד טיהור מומלץ לאחר המגון רקמות להסיר את המיאלין דרך צנטריפוגה על הדרגתי צפיפות או על ידי בחירה מגנטית^9,12, לפני המעבר יישומים במורד הזרם.

כאן, אנו מתארים שיטת עיבוד רקמות מבוסס על העיכול פפאין (PD) ואחריו טיהור על הדרגתי צפיפות, אופטימיזציה כדי להשיג השעיות תא הטרוגנית קיימא ממוח העכבר או חוט השדרה באופן רגיש זמן ומתאים לזרימה cy, try. יתר על כן, אנו מתארים 9-צבע הפאנל cy, לנסות את האסטרטגיה שאימצנו במעבדה כדי לאפשר את האפליה הסימולטני של אוכלוסיות שונות של ה-CN, חי/מת תאים או חיוביות עבור כתבים פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק או צבע rhodamine. על-ידי החלת ניתוח זה של הזרימה, אנו יכולים להשוות שיטות שונות של עיבוד רקמות, כלומר, PD מול DH, מבחינת שימור הכדאיות התאית ותשואות של סוגי תאים שונים.

הפרטים שאנו מספקים במסמך זה יכולים להורות על החלטה על פרוטוקול המגון ושילוב הנוגדן לשימוש בלוח הזרימה cy, מבוסס על סוג תא (ים) מסוים של עניין וניתוח במורד הזרם (g., רגישות לטמפרטורה יישומים, מעקב אחר סמני פלורסנט ספציפיים, בתרבות חוץ גופית, ניתוחים פונקציונליים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של דנה פרבר סרטן המכון (פרוטוקול מספר 16-024).

1. הכנת הפתרונות הדרושים לניסוי

1. הכינו את פתרון המלח המאוזן של האנק (HBSS) על ידי דילול של 10 x HBSS עם מים סטריליים. . לפני שתרגיע את הפתרון בקרח לפחות 25 מ ל של פתרון נחוצים עבור כל דוגמה.
2. להכין את התמיסה הפרסואלי של חלחול (IPS) על ידי ערבוב של 10x 1:10 HBSS סטרילי עם צפיפות מעבר בינונית (כלומר, חלחול). . לפני הצינה בקרח
   הערה: IPS ניתן לאחסן עד 30 יום ב -4 ° c.
3. להכין את הזרימה cy, לחסום את התמיסה (BL) פתרון (1% בסרום פרה אלבומין [BSA], 5% סרום של שור העובר [FBS] ב מלוחים מואגור פוספט [PBS]). . לפני הצינה בקרח

2. המתת חסד של בעלי חיים על-ידי הפרזיה וניתוח רקמות

הערה: עכברים C57BL/6J בני שמונה שבועות, או מין, שימשו בניסויים. Perfusion עם פתרון PBS מבוצע כדי למנוע זיהום דם מאיברים, לפני שתמשיך בעיכול רקמות.

1. באמצעות תערובת של קטמין/xylazine (90-200 מ"ג/ק ג קטמין, 10 מ"ג/ק"ג xylazine). הנח את העכבר על גבו והדבק כל איבר עד לתמיכה. אמת עומק מתאים של הרדמה על ידי בדיקת רפלקס הנסיגה.
2. בצע חתך העור באמצע קו ברמה של כניסת הבית החזה כדי לחשוף את עצם החזה. מלקחיים להשתמש כדי לתפוס את הקצה של עצם החזה, ואז לעשות חתך אחד 1 ס מ על כל צד של כלוב הצלעות. לבסוף לחתוך את הסרעפת ולפתוח את עצם החזה באופן נרחב מספיק כדי לדמיין את הלב.
3. השתמש מלקחיים כדי לתפוס בעדינות את הלב על ידי החדר הימני ולהרים אותו לקו האמצע וקצת מחוץ לחזה.
4. הכנס מחט פרפר 23 G לקצה החדר השמאלי, לכיוון העורקים ולהחזיק בחוזקה.
5. התחל את המיזוג עם 1x PBS. פירס דרך האוריקל הימני באמצעות מספריים כדי לאפשר את המאפשר לצאת מהמחזור. הגדר את קצב הזרימה של ה-PBS ב-3 mL/min. מבשם עם לפחות 15 מ ל של PBS 1 x כדי להבטיח את הרקמות הן ברורות.
   הערה: חולצ'ינג של הכבד וכלי דם מצע הם סימנים של perfusion טוב. במידת הצורך, ניתן להגדיל את נפח הפרזיה עד שהנוזל יוצא מהלב הוא ברור מדם, ובנקודה זו ניתן לעצור את קו הריקון.
6. לאחר הפרזיה, לנתק את המוח מחוט השדרה ולהסיר את המוח מהגולגולת עם מספריים ומלקחיים. הסירו את הפרווה כדי להגביר את הניראות והשליטה במהלך הניתוח ולהימנע מנשיאת מזהמים בשיער. ריקון חוט השדרה מתוך הטור שלה באמצעות מזרק 3 מ ל ממולא PBS.
7. העבר כל רקמה בבאר של 6-באר רב היטב צלחת מלאה עם 2 מ ל של קרח קר 1x HBSS ולשמור על קרח עד העיכול.
8. מחלקים את המוח ואת חוט השדרה לשני חצאים, לאורך קו האורך.
   הערה: חלק אחד של כל רקמה הוא הומוגניים (ראה סעיפים להלן) כדי לאפשר ניתוח ציטומטלי זרימה; החצי השני יכול להיות מוקצה עיבוד שונה עבור ניתוחים חלופיים (למשל, טבל הפתרון הקבע של היסטולוגיה).

3. העיכול האנזימטי של המוח וחוט השדרה

הערה: אמצעי האחסון המתוארים בסעיף זה מספיקים לעיכול של חצי מוח או חוט שדרה.

1. השתמש בזוג מספריים כדי להפוך את הרקמות ל 1-2 מ"מ חתיכות עבות.
2. חותכים את הקצה של 1000 μL עם זוג מספריים כדי להפוך אותו לגדול מספיק כדי לאפשר את האוסף של חתיכות הרקמה. לשטוף מראש את הטיפ עם HBSS 1x. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי להעביר את 2 mL של פתרון HBSS המכיל את הרקמה הקצוצה ל 15 מ"ל צינור חרוט.
   הערה: שטיפה מראש של טיפ הפיפטה חשוב למנוע דביקות של חתיכות הרקמה בתוך הקצה.
3. לשטוף את הבאר עם תוספת 2 מ ל של ice-קר 1x HBSS ולהעביר את הפתרון המקביל 15 mL הצינור המכיל את חתיכות הרקמה.
4. צנטריפוגה כל דוגמה עבור 5 דקות ב 250 x g ב 4 ° c.
5. הכינו את תערובת האנזים 1 של ערכת הדיסוציאציה של רקמת העצבים (NTDK; רשימת חומרים) על ידי ערבוב 50 μL של אנזים P עם 1900 μL של מאגר X לכל מדגם. שילוב אנזים חם 1 ב 37 ° c באמבט מים. שילוב האנזים של דגירה 1 ב 37 ° c עבור לפחות 10 דקות לפני השימוש כדי לאפשר את ההפעלה המלאה של האנזים.
6. מתיף את סופרנטאנט מצינור 15 מ"ל ולהוסיף 1.95 mL של ערבוב אנזימים 1 לכל מדגם. מערבולת עדינה כדי לוודא. שהגלולה מושעית מחדש
7. מודקון את הדגימות על הגלגל או שייקר במשך 15 דקות ב 37 ° c.
8. בינתיים, להכין את האנזים לערבב 2 של NTDK על ידי ערבוב 10 μL של אנזים A עם 20 μL של מאגר Y לכל מדגם; חמם את התמיסה מראש ב-37 ° c באמבט מים.
9. בסוף הדגירה עם שילוב אנזים 1, להוסיף 30 μL של ערבוב אנזים 2 לכל מדגם.
10. בעדינות לערבב את הדגימות על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם טיפ 1000 μL הצינורות מראש שוטפים עם 1x HBSS.
11. מודאת המדגם על גלגל או שייקר במשך 15 דקות ב 37 ° c.
12. לאחר הדגירה, להוסיף 10 מ ל של קרח קר 1x HBSS לכל צינור כדי להשבית את האנזים מיקס 1 ו האנזים לערבב 2.
13. צנטריפוגה כל דוגמה עבור 10 דקות ב 320 x g ב 4 ° c.
14. השמט את הסופרנטאנט; להוסיף קרח קר 1x HBSS לכל צינור עד הכרך הסופי של 7 mL ולהשעות בעדינות את הגלולה על ידי vortexing.
15. המשך לסעיף 5 להסרת פסולת.

4. הומוגון מכני של המוח וחוט השדרה

הערה: אמצעי האחסון המתוארים בסעיף זה מספיקים לצורך הומוגון של מוח במחצית או חוט השדרה. הפרוטוקול המתואר בסעיף זה יכול לשמש כחלופה לשיטה המתוארת בסעיף 3, בהתאם לצורך המשתמש כפי שמתואר להלן.

1. השקה מראש את מרגמה הזכוכית של מטחנת הרקמה הדיאונקיית (טבלת חומרים) שנקבעה על הקרח.
2. הוסיפו 3 מ ל לחומר המליטה מקורר מצוננים של 1x HBSS.
3. העבר את הרקמה (המוח או חוט השדרה) מן הבאר של 6-הצלחת הלוח לתוך מרגמה הזכוכית מוודא שהוא טבל ב 1x HBSS יושב בתחתית המרגמה.
4. לרסק בעדינות את הרקמה עם 10 משיכות של כתש ואחריו 10 משיכות של כתש B. להעביר את התערובת הומוגניים לתוך צינור חדש 15 mL.
5. למלא את הצינור לנפח הסופי של 10 מ ל באמצעות מקורר 1x HBSS ו צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 320 x g ב 4 ° c.
6. משף את הסופרנטאנט ומוסיפים את הקרח הקר 1x HBSS לכל צינור עד לנפח סופי של 7 מ ל ומחדש בעדינות את הגלולה על ידי vortexing.
7. המשך לסעיף 5 להסרת פסולת.

5. הסרת פסולת

הערה: הסרת פסולת, המורכבת בעיקר של רקמה בלתי מתעכלת ומעילי מיאלין, הוא צעד קריטי כדי לאפשר כתמים יעילים של רקמת העור לניתוחים הבאים לצורך זרימה.

1. לסנן כל מדגם דרך מסננת תא 70 יקרומטר כדי להסיר קטע רקמות לא מתעכל. שלב זה חשוב במיוחד במיוחד כאשר עובדים עם רקמות חוט השדרה מאז דגימות אלה נוטים יותר להכיל שברי עצב מתעכל או קרומי שינה שיכול להשפיע על הצעדים הבאים.
2. ודא שאמצעי האחסון הסופי הוא 7 mL בכל צינור לדוגמה. אם לא, למלא עם קרח קר 1x HBSS עד 7 מ ל.
3. הוסף 3 מ ל של מקורר לפני כל מדגם כדי להפוך את הנפח הסופי של 10 מ ל של פתרון המכיל צפיפות בינונית הדרגתי ב 30% הריכוז הסופי. בעדינות מערבולת הדגימות כדי לוודא שהם מעורבים הומובאופן מאוד.
4. דגימות צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 700 x g ב 18 ° c ודאו להגדיר את האצת הצנטריפוגה ל 7 ואת בלם ל 0.
   הערה: צנטריפוגה אמור להימשך כ -30 דקות.
5. . הסר בעדינות את הדגימות מהצנטריפוגה
   הערה: דיסק לבנבן המורכב מפסולת ומיאלין צריך להיות גלוי צף על פני השטח של הפתרון. גלולה (המכילה את תאי העניין) צריכה להיות גלויה בתחתית הצינורית.
6. בזהירות לחלק את כל הדיסק לבנבן של פסולת ולאחר מכן את שאר הסופרנט מוודא לא להוציא את הגלולה. השאירו כ 100 μL של הפתרון על גבי הגלולה התא כדי למנוע את הסיכון של חוסר בשוגג אותו.
7. להוסיף 1 מ ל של FACS BL, להשעות מחדש את הגלולה על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם טיפ 1000 μL הצינורות ודגימות להעביר כדי 1.5 mL צינורות.
8. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 450 x g בטמפרטורת החדר (RT).
9. השתמש בעדינות את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה במאגר המתאים התואם לניתוחי במורד הזרם (ראה סעיף 6 עבור הפרוטוקול המשמש להערכת הערכה של מספר סוגי תאים).

6. צביעת להערכת הערכת הציטוטומטריות בסוגי תאים מרובים

1. השהה מחדש את הגלולה שהושגה בשלב 5.9 עם 350 μL של FACS BL. הוסף לחסום את Fc-בלוק לכל מדגם בריכוז הסופי של 5 μg/mL.
   הערה: לפחות 100 μL של המדגם יש להשתמש עבור כתמים אחד, כדי להבטיח לעבד מספיק תאים כדי לאפשר ניתוחים אמינים.
2. מודאת המדגם עבור 10 דקות ב 4 ° צ' לפני שתמשיך עם ההכתמים.
3. הכינו מיקס נוגדן לפי שולחן 1.
4. הוסף שילוב נוגדן לכל צינור, מערבולת עבור 5 s ו-מודטה דגימות עבור 15 דקות ב 4 ° c בחושך.
5. הוסף 1 mL של PBS לכל צינור, מערבולת וצנטריפוגה עבור 5 דקות ב 450 x g ב RT.
6. בינתיים להכין streptavidin mix לפי שולחן 1.
7. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה בתערובת streptavidin מוכן בשלב 6.6. עבור כל דוגמה, השתמש באותו אמצעי אחסון כמו זה ששימש את ההכתמים בשלב 6.4.
8. מערבולת עבור 5 s ו מודות את הדגימות עבור 10 דקות ב 4 ° c בחושך.
9. הוסף 1 mL של PBS לכל צינור, מערבולת וצנטריפוגה עבור 5 דקות ב 450 x g ב RT.
10. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה ב-FACS BL. השתמש ב-300 μL של FACS BL עבור כל 100 μL של דגימת מוכתם.
11. הוסף פתרון 7-אמינו-אקטינומיצין D (7-עמ מ) לכל דוגמה. השתמש 5 μL של 7 עמ מ עבור כל 300 μL של מדגם שהוכן בשלב 6.10.
12. החנות דגימות ב 4 ° c בחושך עד בדיקה ציטופלוורימטרית. בצע את הניתוח בתוך 16 h מהכנה למדגם, כדי להבטיח > 60% הכדאיות תא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השוונו שתי שיטות שונות של הומוגון (DH נגד PD) להחיל על המוח העכבר ואת חוט השדרה, כדי לבדוק את היעילות באחזור סוגי תאים שונים קיימא מתאים ליישומי מטה. כדי לעשות זאת, אנו מנצלים 9-צבע הפאנל cy, לנסות לאפיין, במדגם זהה, סוגים שונים של תאי ה-CN הכוללים microglia, לימפוציטים, נוירונים, astrocytes, oligodendrocytes הפוך ו ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח שיתוף טיהור וזרימה במקביל של חלק מתאי ה-CN הרלוונטיים ממוח העכבר וחוט השדרה. באופן מסורתי, ניתוחים היסטולוגיים הוחלו כדי לתאר את התפלגות חלקיקים או את היעילות התמרה של וקטורים ויראליות ב-cn^5,13, או כדי לספק תובנות על שינויים מורפו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)	Gibco	14185-052
70 mm Cell Strainer	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugated
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibody	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibody	BD Bioscience	562939	BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibody	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody	Biolegend	202518	PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody	Biolegend	1005325	PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)	CellTreat	229411
Conical Tubes (50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody	BD Pharmingen	553142
Fetal Bovine Serum	Benchmark	100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibody	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotin conjugated
Percoll	GE Healthcare	10266569	sold as not sterile reagent
Percoll	Sigma	65455529	sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	reagent containing very low traces of endotoxin
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugated