JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем метод цитометрии потока для идентификации одновременно различных типов клеток, извлеченных из мозга мыши или спинного мозга. Этот метод может быть использован для изоляции или характеристики чистых популяций клеток при нейродегенеративных заболеваниях или для количественной оценки степени ориентации клеток на in vivo вирусных векторов или наночастиц.

Аннотация

Недавние достижения в области вирусного вектора и наноматериальных наук открыли путь для новых передовых подходов к исследованию или манипулированию центральной нервной системой (ЦНС). Однако дальнейшая оптимизация этих технологий будет способствовать методам, позволяющим быстро и упорядочить определение степени ЦНС и клеточного таргетинга при приеме вирусных векторов или наночастиц в организме. Здесь мы представляем протокол, который использует высокую пропускную способность и мультиплексирование возможности цитометрии потока, чтобы позволить простой количественной оценки различных подтипов клеток, изолированных от мозга мыши или спинного мозга, а именно микроглии / макрофагов, лимфоцитов, астроцитов, олигодендроцитов, нейронов и эндотелиальных клеток. Мы применяем этот подход, чтобы подчеркнуть критические различия между двумя методами гомогенизации тканей с точки зрения урожайности клеток, жизнеспособности и состава. Это может поручить пользователю выбрать лучший метод в зависимости от типа ячейки (ы) интереса и конкретного приложения. Этот метод не подходит для анализа анатомического распределения, так как ткань гомогенизирована для создания одноклеточной суспензии. Тем не менее, это позволяет работать с жизнеспособными клетками и может быть объединена с клеточной сортировкой, открывая путь для нескольких приложений, которые могли бы расширить репертуар инструментов в руках нейробиолога, начиная от создания первичных культур, полученных из чистоклеточных популяций, до анализа генной экспрессии и биохимических или функциональных анализов на четко определенных подтипах клеток в контексте нейрогенеративных заболеваний, на фармакологическом лечении или генной терапии.

Введение

Технологии доставки генов и лекарств (таких как вирусные векторы и наночастицы) стали мощным инструментом, который может быть применен, чтобы получить лучшее представление о конкретных молекулярных путей, измененных в нейродегенеративных заболеваний и для развития инновационных терапевтических подходов1,2,3. Оптимизация этих инструментов основывается на количественной оценке: (1) степень проникновения в ЦНС на различных путях управления и (2) ориентации на конкретные популяции ячеек. Гистологические анализы обычно применяются для визуализации флуоресцентных генов репортера или флуоресцентно помеченных наночастиц в различных областях ЦНС и в различных типах клеток, выявленных иммуномаркировкой для конкретных маркеров клеток4,5. Несмотря на то, что этот подход предоставляет ценную информацию о биораспределении вводимых генов или инструментов доставки лекарств, этот метод может быть трудоемким и трудоемким, поскольку он требует: (1) фиксации тканей, криоконсервации или встраивания парафина и нарезки; (2) окрашивание для конкретных клеточных маркеров, иногда требующих поиска антигена; (3) приобретение флуоресценции микроскопии, которая обычно позволяет анализ ограниченного числа различных маркеров в рамках одного и того же эксперимента; (4) обработка изображений, чтобы обеспечить надлежащую количественную оценку сигнала интереса.

Цитометрия потока стала широко используемой техникой, которая использует очень специфические флуоресцентные маркеры, позволяющие не только быстрой количественной оценки различных клеточных фенотипов в клеточных суспензиях, основанных на экспрессии поверхностных или внутриклеточных антигенов, но и функциональных измерений (например, скорость апоптоза, пролиферания, анализ клеточного цикла и т.д.). Возможна также физическая изоляция клеток через флуоресцентную активированную сортировку клеток, что позволяет дополнительно приступить к применению ниже по течению (например, клеточная культура, РНК, биохимический анализ и т.д.) 6,7,8.

Ткань гомогенизации является критическим шагом, необходимым для получения одной подвески клеток, чтобы надежные и воспроизводимые вниз по течению потока цитометрических оценок. Различные методы были описаны для взрослых гомогенизации мозговой ткани, в основном с целью изоляции микроглии клеток9,10,11; они могут быть классифицированы в целом в двух основных категориях: (1) механическая диссоциация, которая использует шлифовальные или сдвига силы через Dounce гомогенизатор (DH), чтобы разорвать клетки из своих ниш и образуют относительно гомогенизированные одной клетки подвески, и (2) ферментативное пищеварение, которое опирается на инкубацию измельченных тканей куски при 37 градусов по Цельсию в присутствии протеолитических ферментов, таких как трипсин или папаин, в пользу деградации внеклеточной матрицы для создания довольно однородной клеточной суспензии12.

Независимо от того, какой метод используется, шаг очистки рекомендуется после гомогенизации тканей, чтобы удалить миелин через центрифугирование на градиент плотности или магнитным отбором9,12, перед переходом к приложениям вниз по течению.

Здесь мы описываем метод обработки тканей на основе пищеварения папанов (PD), а затем очищение на градиент плотности, оптимизированы для получения жизнеспособных неоднородных клеточных суспензий из мозга мыши или спинного мозга в чувствительных к времени образом и подходит для потока цитометрии. Кроме того, мы описываем 9-цветной цитометрии потока панели и gating стратегии мы приняли в лаборатории, чтобы позволить одновременной дискриминации различных популяций ЦНС, живых / мертвых клеток или положительность для флуоресцентных репортеров, таких как зеленый флуоресцентный белок или родамина красителя. Применяя этот цитометрический анализ потока, мы можем сравнить различные методы обработки тканей, т.е. PD против DH, с точки зрения сохранения жизнеспособности клеток и урожайности различных типов клеток.

Детали, которые мы предоставляем в данном проекте, могут поручить решение о протоколе гомогенизации и комбинации антител для использования в панели цитометрии потока, основанной на конкретном типе клеток (ы) интереса и анализе вниз по течению (например, чувствительных к температуре применения, отслеживание конкретных флуоресцентных маркеров, культура in vitro, функциональный анализ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Института рака Даны Фарбер (протокол No 16-024).

1. Подготовка решений, необходимых для эксперимента

  1. Приготовьте сбалансированный солевой раствор 1x Hank (HBSS), разбавив 10x HBSS стерильной водой. Предварительно охладите раствор на льду. Для каждого образца требуется не менее 25 мл раствора.
  2. Подготовка изотонического решения Percoll (IPS) путем смешивания 10x стерильных HBSS 1:10 со средой градиента плотности (т.е. Percoll). Предварительно охладить на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: IPS может храниться до 30 дней при 4 градусах Цельсия.
  3. Подготовка потока цитометрии (FACS) блокирование (BL) решение (1% бычьей сыворотки альбумина (BSA), 5% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) в фосфат-буферный солен (PBS). Предварительно охладить на льду.

2. Эвтаназия животных путем внутрисердечной перфузии и рассечения тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Восьминедельные мыши C57BL/6J, обоий пол, были использованы в экспериментах. Перфузия с раствором PBS выполняется для устранения загрязнения крови из органов, прежде чем приступить к пищеварению тканей.

  1. Анестезия мыши с помощью смеси кетамина / ксилазина (90-200 мг/кг кетамина, 10 мг/кг ксилазина). Поместите мышь на спину и ленты каждой конечности до поддержки. Проверьте адекватную глубину анестезии, проверяя рефлекс вывода.
  2. Сделайте разрез кожи средней линии на уровне грудного впуска, чтобы разоблачить грудину. Используйте щипцы, чтобы схватить кончик грудины, а затем сделать один 1 см разрез на каждой стороне грудной клетки. Наконец прорезать диафрагму и открыть грудину достаточно широко, чтобы визуализировать сердце.
  3. Используйте щипцвы, чтобы аккуратно ухватить сердце за правый желудочек и поднять его к средней линии и слегка из груди.
  4. Вставьте 23 G бабочки иглы в кончик левого желудочка, к аорте и крепко держать.
  5. Начните перфузию с 1x PBS. Прокол через правый ушной раковины с помощью ножниц, чтобы perfusate выйти из циркуляции. Установите скорость потока PBS на 3 мл/мин. Perfuse с по крайней мере 15 мл 1x PBS для обеспечения тканей ясно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бланширование печени и мезентерических кровеносных сосудов являются признаками хорошей перфузии. При необходимости объем предфуза может быть увеличен до тех пор, пока жидкость, выходящий из сердца, не очистится от крови, после чего флеш-линия может быть остановлена.
  6. После перфузии, разорвать мозг от спинного мозга и удалить мозг из черепа с ножницами и щипками. Удалите мех, чтобы увеличить видимость и контроль во время вскрытия и, чтобы избежать переноса волос загрязняющих веществ. Промыть спинной мозг из своей колонки с помощью 3 мл шприц заполнен pbS.
  7. Перенесите каждую ткань в колодец из 6-колодца с несколькими колодцами пластины предварительно заполнены 2 мл ледяной 1x HBSS и держать на льду до пищеварения.
  8. Разделите мозг и спинной мозг на две половины, вдоль продольной линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Половина каждой ткани гомогенизирована (см. разделы ниже), чтобы циклометрический анализ потока; другая половина может быть назначена на различную обработку для альтернативного анализа (например, смоченной в параформальдегидном фиксаторном растворе для гистологии).

3. Ферментативное пищеварение головного и спинного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы, описанные в этом разделе, достаточны для пищеварения половины мозга или спинного мозга.

  1. Используйте ножницы, чтобы разрубить ткани на части толщиной 1–2 мм.
  2. Вырежьте кончик 1000-й пипетки ножницами, чтобы сделать его достаточно большим, чтобы позволить сбор частей ткани. Предварительно промыть кончик пипетки с 1x HBSS. Затем используйте пипетку для переноса 2 мл раствора HBSS, содержащего измельченные ткани, в коническую трубку 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное промывание наконечника пипетки важно для предотвращения липкости тканей части внутри кончика.
  3. Вымойте скважину дополнительными 2 мл ледяного 1x HBSS и перенесите раствор на соответствующую коническую трубку 15 мл, содержащую кусочки ткани.
  4. Центрифуга каждый образец в течение 5 мин при 250 х г при 4 градусах По цельсию.
  5. Подготовьте ферментную смесь 1 из комплекта диссоциации нервной ткани (NTDK; Таблица материалов) путем смешивания 50 зл фермента P с 1900 л буфера X на образец. Теплый фермент смешать 1 при 37 градусов по Цельсию в водяной бане. Инкубировать фермент ную 1 при 37 градусах По Цельсию в течение по крайней мере 10 мин перед использованием, чтобы обеспечить полную активацию фермента.
  6. Аспирировать супернатант из 15 мл конической трубки и добавить 1,95 мл ферментной смеси 1 к каждому образцу. Аккуратно вихрь, чтобы убедиться, что гранулы повторно.
  7. Инкубировать образцы на колесе или шейкере в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия.
  8. В то же время, подготовить фермент смесь 2 NTDK путем смешивания 10 зл/ фермента А с 20 зл буфера Y в образец; предварительно разогреть раствор при 37 градусах По Цельсию на водяной бане.
  9. В конце инкубации с ферментной смесью 1, добавить 30 зл энзимной смеси 2 к каждому образцу.
  10. Аккуратно смешайте образцы, поднимая трубку вверх и вниз с 1000-м наконечником пипетки, предварительно промытых 1x HBSS.
  11. Инкубировать образец на колесе или шейкере в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия.
  12. После инкубации добавьте 10 мл ледяного 1x HBSS к каждой трубке, чтобы инактивировать ферментную смесь 1 и ферментную смесь 2.
  13. Центрифуга каждый образец в течение 10 мин при 320 х г при 4 градусах По цельсию.
  14. Отбросить супернатант; добавить ледяной 1x HBSS к каждой трубке до окончательного объема 7 мл и осторожно resuspend гранулы путем вихря.
  15. Продолжить раздел 5 для удаления мусора.

4. Механическая гомогенизация головного и спинного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы, описанные в этом разделе, достаточны для гомогенизации половины головного или спинного мозга. Протокол, описанный в этом разделе, может быть использован в качестве альтернативы методу, описанному в разделе 3, в зависимости от потребности пользователя, как описано ниже.

  1. Предварительно охладить стеклянный ступку измельчитель ткани Dounce (Таблица материалов) установлен на льду.
  2. Добавьте 3 мл предварительно охлажденных 1x HBSS в ступку.
  3. Передача ткани (мозг или спинной мозг) из колодца 6-ну пластины в стеклянный раствор убедившись, что он окунается в 1x HBSS и сидит в нижней части раствора.
  4. Аккуратно разбить ткани с 10 ударов пестика, а затем 10 ударов пестика B. Передача гомогенизированной смеси в новый 15 мл конической трубки.
  5. Заполните трубку до конечного объема 10 мл, используя предварительно охлажденный 1x HBSS и центрифугу в течение 10 минут при 320 х г при 4 градусах По Цельсию.
  6. Усилите супернатант и добавьте ледяной 1x HBSS к каждой трубке до конечного объема 7 мл и аккуратно переплетайте гранулы путем вихря.
  7. Продолжить раздел 5 для удаления мусора.

5. Удаление мусора

ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление мусора, состоящего в основном из непереваренных тканей и миелиновых оболочек, является важным шагом, позволяющим эффективно окрашивать ткани гомогената для последующего цитометрического анализа потока.

  1. Фильтр каждого образца через 70 мкм ячейки ситечко, чтобы удалить любой непереваренной ткани кусок. Этот шаг особенно важен, особенно при работе с тканями спинного мозга, так как эти образцы с большей вероятностью содержат непереваренные фрагменты нерва или обезвреженные, которые могут повлиять на последующие шаги.
  2. Убедитесь, что конечный объем составляет 7 мл в каждой пробной трубке. Если нет, заполните ледяной 1x HBSS до 7 мл.
  3. Добавьте 3 мл предварительно охлажденных IPS в каждый образец, чтобы сделать окончательный объем 10 мл раствора, содержащего среду градиента плотности при 30% конечной концентрации. Аккуратно вихрь образцы, чтобы убедиться, что они однородны смешиваются.
  4. Образцы центрифуги в течение 15 мин при 700 х г при 18 градусах По Цельсию, убедившись, что установить ускорение центрифуги до 7 и тормоза до 0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугация должна занять около 30 минут.
  5. Деликатно удалите образцы из центрифуги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: беловатый диск, состоящий из мусора и миелина, должен быть виден плавающим на поверхности раствора. Гранулы (содержащие клетки интереса) должны быть видны в нижней части трубки.
  6. Тщательно аспирировать все беловатый диск мусора, а затем остальная часть supernatant убедившись, что не выбить гранулы. Оставьте около 100 л раствора на верхней части клеточной гранулы, чтобы избежать риска непреднамеренно выбить его.
  7. Добавьте 1 мл FACS BL, приостановите гранулы, протянув вверх и вниз с наконечником пипетки 1000 л и перенесите образцы в трубки 1,5 мл.
  8. Центрифуга в течение 5 мин при температуре 450 х г при комнатной температуре (RT).
  9. Аккуратно аспирируйте супернатант и повторно приостанавливайте гранулы в соответствующем буфере, совместимом с анализами вниз по течению (см. раздел 6 для протокола, используемого для цитометрической оценки потока нескольких типов клеток).

6. Окрашивание для цитометрической оценки потока нескольких типов клеток

  1. Отрептируйте гранулы, полученные в шаге 5.9 с 350 л FACS BL. Добавить fc-block к каждому образцу при конечной концентрации 5 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере 100 л образца должны быть использованы для одного окрашивания, чтобы убедиться, что для обработки достаточноклеток, чтобы надежный анализ.
  2. Инкубировать образец в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия, прежде чем приступить к окрашиванию.
  3. Подготовка смесь антител в соответствии с таблицей 1.
  4. Добавьте смесь антител к каждой трубке, вихрь на 5 с и инкубировать образцы в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия в темноте.
  5. Добавьте 1 мл PBS к каждой трубке, вихрь и центрифуги в течение 5 минут при 450 х г на RT.
  6. Между тем подготовить стрептавидин смесь в соответствии с таблицей 1.
  7. Откажитесь от супернатанта и отрептите гранулы в стрептавидинской смеси, приготовленной в шаге 6.6. Для каждого образца используйте тот же объем, что и тот, который используется для окрашивания в шаге 6.4.
  8. Vortex в течение 5 с и инкубировать образцы в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия в темноте.
  9. Добавьте 1 мл PBS к каждой трубке, вихрь и центрифуги в течение 5 минут при 450 х г на RT.
  10. Откажитесь от супернатанта и приостановите гранулы в FACS BL. Используйте 300 л FACS BL на каждые 100 л окрашенных образцов.
  11. Добавьте в каждый образец 7-амино-актиномицин D (7-AAD). Используйте 5 ЗЛ 7-AAD для каждого 300 зЛ образца, подготовленного в шаге 6.10.
  12. Храните образцы при 4 градусах По итвне в темноте до цитофториметрического анализа. Выполните анализ в течение 16 ч от подготовки образца, чтобы гарантировать жизнеспособность клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы сравнили два различных метода гомогенизации (DH против PD), применяемых к мозгу мыши и спинному мозгу, чтобы проверить эффективность в извлечении различных жизнеспособных типов клеток, пригодных для применения ниже по течению. Для этого мы использовали 9-цветную цитометрию потока пане...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом мы описываем протокол для совместного очищения и одновременного цитометрического анализа потока некоторых из наиболее релевантных клеток ЦНС из мозга мыши и спинного мозга. Традиционно, гистологические анализы были применены для описания распределения наночастиц или трансду?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Бостонской детской больницы стартовых средств для A.B., ALSA грант nr. 17-IIP-343 в М.П., и Управление помощника министра обороны по вопросам здравоохранения через амиотрофический боковой склероз исследовательской программы в соответствии с премией No. W81XWH-17-1-0036 до M.P. Мы признаем DFCI Flow Cytometry Core за техническую поддержку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)Gibco14185-052
70 mm Cell StrainerCorning431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibodyMiltenyi Biotec130-117-535APC conjugated
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibodyInvitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibodyBD Bioscience562939BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibodyBiolegend103138Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibodyBiolegend202518PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibodyBiolegend1005325PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)CellTreat229411
Conical Tubes (50 mL)CellTreat229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibodyBD Pharmingen553142
Fetal Bovine SerumBenchmark100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibodyMiltenyi Biotec130-095-895Biotin conjugated
PercollGE Healthcare10266569sold as not sterile reagent
PercollSigma65455529sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01reagent containing very low traces of endotoxin
StreptavidinInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 conjugated

Ссылки

  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371(2019).
  3. Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67(2019).
  4. Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272(2016).
  5. Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
  6. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  7. Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
  8. Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
  9. Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
  10. Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
  11. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635(2012).
  12. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
  13. Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
  14. Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
  15. Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
  16. Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
  17. Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены