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요약

우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.

초록

바이러스 벡터 및 나노 물질 과학의 최근 발전은 중추 신경계를 조사하거나 조작하는 새로운 최첨단 접근법 (CNS)의 길을 열었습니다. 그러나, 이러한 기술의 추가 최적화는 체내에서 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 투여 시 CNS 및 세포 별 표적화의 정도를 신속하고 능률적인 측정을 허용하는 방법의 혜택을 누릴 것입니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌 또는 척수, 즉 microglia/대식세포, 림프세포, 성상세포, 올리고덴드로세포, 올리고덴드로소이트, 내피 세포에서 분리된 상이한 세포 아류형의 간단한 정량화를 허용하기 위해 유세포분석의 높은 처리량 및 다중화 기능을 활용하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 세포 수율, 생존력 및 조성의 관점에서 두 조직 균질화 방법 사이의 중요한 차이점을 강조하기 위해이 방법을 적용합니다. 이렇게 하면 사용자가 관심 있는 셀 유형 및 특정 응용 프로그램에 따라 최상의 방법을 선택하도록 지시할 수 있습니다. 이 방법은 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 조직이 균질화되기 때문에 해부학 적 분포의 분석에 적합하지 않습니다. 그러나, 그것은 가능한 세포로 작동할 수 있고, 순수한 세포 인구에서 파생된 1 차적인 배양의 설치에서, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석학에 구역 수색하는 신경과학자의 손에 있는 공구의 레퍼토리를 확장할 수 있는 몇몇 응용을 위한 방법을 여는 세포 분류와 결합될 수 있습니다.

서문

유전자 및 약물 전달 기술(예: 바이러스 벡터 및 나노입자)은 신경 퇴행성 질환에서 변경된 특정 분자 경로에 대한 더 나은 통찰력을 얻고 혁신적인 치료 접근법의개발을 위해 적용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다1,2,3. 이러한 도구의 최적화는 정량화에 의존합니다: (1) 다른 투여 경로에 대한 CNS의 침투 범위 및 (2) 특정 세포 집단의 표적화. 조직학적 분석은 일반적으로 특정 세포마커4,5에대한 면역 염색에 의해 확인된 다른 CNS 지역 및 상이한 세포 모형에 있는 형광 리포터 유전자 또는 형광 태그나노입자를 구상하기 위하여 적용됩니다. 이 접근법은 투여된 유전자 또는 약물 전달 도구의 생체 분포에 대한 귀중한 정보를 제공하지만, 이 기술은 (1) 조직 고정, 동결 보존 또는 파라핀 삽입 및 슬라이스를 필요로 하기 때문에 시간이 많이 걸리고 노동이 강렬할 수 있다; (2) 때로는 항원 검색을 필요로 하는 특정 세포 마커에 대한 염색; (3) 형광 현미경 검사법에 의한 획득, 이는 일반적으로 동일한 실험 내에서 제한된 수의 다른 마커의 분석을 가능하게 한다; (4) 관심 있는 신호를 적절히 정량화할 수 있도록 이미지 처리.

유세포 분석은 표면 또는 세포 내 항원의 발현에 기초하여 세포 현탁액에서 다른 세포 표현형의 신속한 정량적 평가뿐만 아니라 기능적 측정 (예를 들어, 세포 사멸의 속도, 증식, 세포 주기 분석 등)를 허용하기 위해 매우 특이적 형광 마커를 활용하는 널리 사용되는 기술이되었습니다. 형광 활성화 세포 선별을 통한 세포의 물리적 분리도 가능하여 추가다운스트림 응용(예: 세포 배양, RNAeq, 생화학 적 분석 등)을 허용합니다. 6,7,8.

조직 균질화는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 하류 유동 세포 측정 평가를 허용하기 위해 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필요한 중요한 단계입니다. 다른 방법은 성인 뇌 조직 균질화를 위해 설명되었으며, 주로 미세 글리아 세포를 분리하는 것을 목표로9,10,11; 그들은 전반적으로 두 가지 주요 범주로 분류 될 수있다 : (1) Dounce 균질화 (DH)를 통해 연삭 또는 전단력을 사용하여 틈새 에서 세포를 찢어 상대적으로 균질화 된 단일 세포 현탁액을 형성하는 기계적 해리, 및 (2) 효소 소화는 37°C에서 다진 조직 덩어리의 인큐베이션에 의존하며, 트립신 또는 파파인과 같은 단백질 분해 효소의 존재, 상당히 균질화된 세포현탁액(12)을생성하기 위해 세포외 매트릭스의 분해를 선호한다.

어떤 방법을 활용하든, 정화 단계는 조직 균질화 후 밀도 구배 또는 자기 선택9,12에의해 원심분리를 통해 미엘린을 제거하기 위해 하류 응용 프로그램으로 이동하기 전에 권장됩니다.

여기서, 우리는 파파인 소화(PD)에 기초한 조직 처리 방법을 설명하고 밀도 구도에 대한 정제를 거쳐, 시간 민감성 방식으로 마우스 뇌 또는 척수로부터 생존 가능한 이기종 세포 현탁액을 얻기 위해 최적화되고 유세포 분석에 적합하다. 또한, 우리는 녹색 형광 단백질 또는 로다민 염료와 같은 형광 기자를 위한 다른 CNS 인구, 살아있는/죽은 세포 또는 양성의 동시 적인 차별을 허용하기 위하여 실험실에서 채택한 9 색 교류 세포 측정 위원회 및 게이팅 전략을 기술합니다. 이 유동 세포 측정 분석을 적용함으로써, 우리는 조직 처리의 다른 방법을 비교할 수 있습니다, 즉, PD 대 DH, 세포 생존력과 다른 세포 유형의 수율의 보존측면에서.

본 명세서에서 당사가 제공하는 세부 사항은 관심 있는 특정 세포 유형 및 다운스트림 분석(예를 들어, 온도 민감성)에 기초하여 유세포측정 패널에서 사용하는 균질화 프로토콜 및 항체 조합에 대한 결정을 지시할 수 있다. 특정 형광 마커 추적, 시험관 내 배양, 기능 분석).

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 다나 파버 암 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다(프로토콜 번호 16-024).

1. 실험에 필요한 솔루션 준비

  1. 멸균수로 10x HBSS를 희석하여 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 1회 준비합니다. 용액을 얼음에 미리 식힙니다. 각 샘플에 대해 최소 25mL의 용액이 필요합니다.
  2. 10x 멸균 HBSS 1:10을 밀도 그라데이션 매미(즉, Percoll)와 혼합하여 동위 원소 퍼콜 용액(IPS)을 준비합니다. 얼음에 미리 식히세요.
    참고: IPS는 4°C에서 최대 30일 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 유세포분석(FACS) 차단(BL) 용액(1% 소 혈청 알부민[BSA], 5% 태아 소 혈청 [FBS]를 인산완충식염수[PBS])에 준비한다. 얼음에 미리 식히세요.

2. 심장 내 관류 및 조직 해부에 의한 동물 안락사

참고: 8주 된 C57BL/6J 마우스, 어느 성별, 실험에 사용 되었다. PBS 용액을 가진 관류는 조직 소화로 진행하기 전에 장기에서 혈액 오염을 제거하기 위해 수행됩니다.

  1. 케타민 /자일라진 (90-200 mg / kg 케타민, 10 mg / kg 자일라진)의 혼합물을 사용하여 마우스를 마취. 마우스를 뒷면에 놓고 각 팔다리를 지지대에 테이프로 놓습니다. 철수 반사를 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.
  2. 흉골 입구의 수준에서 중간 선 피부 절개를 확인흉을 노출합니다. 집게를 사용하여 흉골의 끝을 잡은 다음 흉곽의 각 측면에 1cm 절개를합니다. 마지막으로 다이어프램을 잘라 심장을 시각화 할 만큼 널리 흉골을 엽니 다.
  3. 우심실로 심장을 부드럽게 잡고 중간선과 가슴에서 약간 들어 올리기 위해 집게를 사용합니다.
  4. 좌심실 의 끝에 23G 나비 바늘을 삽입하고 대동맥쪽으로 단단히 잡습니다.
  5. 1x PBS로 관류를 시작합니다. 가위를 사용하여 오른쪽 구멍을 관통하여 향수가 순환을 종료 할 수 있도록합니다. PBS의 유량을 3 mL/min. Perfuse에서 1x PBS의 최소 15mL로 설정하여 조직이 명확하도록 합니다.
    참고 : 간및 간장의 희게하는 것은 좋은 관류의 징후입니다. 필요한 경우, 심장을 빠져 나가는 유체가 혈액이 제거 될 때까지 프리퓨전의 양을 증가 시킬 수 있으며, 이 시점에서 플러시 라인을 멈출 수 있습니다.
  6. 관류 후 척수에서 뇌를 분리하고 가위와 집게로 두개골에서 뇌를 제거하십시오. 해부 시 가시성과 제어력을 높이고 모발 오염 물질을 운반하는 것을 피하기 위해 모피를 제거하십시오. PBS로 채워진 3 mL 주사기를 사용하여 척수를 기둥에서 내뿜습니다.
  7. 얼음 차가운 1x HBSS 2 mL로 미리 채워진 6 웰 멀티 웰 플레이트의 우물에서 각 조직을 옮기고 소화 될 때까지 얼음을 유지하십시오.
  8. 세로선을 따라 뇌와 척수를 두 개의 반쪽으로 나눕니다.
    참고 : 각 조직의 절반은 유세포 분석을 허용하기 위해 균질화 (아래 섹션 참조); 나머지 절반은 대체 분석을 위해 다른 처리에 할당 될 수 있습니다 (예를 들어, 조직학을위한 파라 포름 알데히드 고정 용액에 담근).

3. 뇌와 척수의 효소 소화

참고: 이 섹션에 설명된 부적은 반쪽 뇌 또는 척수의 소화에 충분합니다.

  1. 가위를 사용하여 조직을 1−2mm 두께의 조각으로 자릅니다.
  2. 1000 μL 파이펫의 끝을 가위 한 쌍으로 잘라서 조직 조각을 수집 할 수 있도록 충분히 크게 만듭니다. 1x HBSS로 파이펫 팁을 미리 헹구어 보시고 자합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 다진 조직을 함유하는 HBSS 용액의 2 mL을 15 mL 원점 튜브로 이송합니다.
    참고: 파이펫 팁의 사전 헹구는 것은 팁 내부의 티슈 조각의 끈적거림을 방지하는 데 중요합니다.
  3. 얼음 차가운 1x HBSS의 추가 2 mL로 잘 세척하고 조직 조각을 포함하는 해당 15 mL 원추형 튜브에 용액을 옮김을 옮김.
  4. 4 °C에서 250 x g에서 5 분 동안 각 샘플을 원심 분리기.
  5. 신경 조직 해리 키트의 효소 믹스 1을 준비 (NTDK; 재료 표) 50 μL의 효소 P를 샘플 당 1900 μL의 버퍼 X와 혼합하여. 따뜻한 효소는 수조에서 37 °C에서 1을 혼합합니다. 효소의 완전한 활성화를 허용하기 위해 사용하기 전에 적어도 10 분 동안 37 °C에서 1을 배양 효소 혼합.
  6. 15 mL 원엽 튜브에서 상류를 흡인하고 각 샘플에 1.95 mL의 효소 혼합물 1을 추가합니다. 펠릿이 다시 일시 중단되었는지 확인하기 위해 부드럽게 소용돌이.
  7. 37 °C에서 15 분 동안 휠 또는 셰이커에 샘플을 인큐베이션합니다.
  8. 한편, NTDK의 효소 믹스 2를 시료당 20 μL의 완충Y와 A 효소 의 10 μL과 혼합하여 준비; 수조에서 37 °C에서 용액을 미리 데우다.
  9. 효소 믹스 1로 배양이 끝나면 각 샘플에 효소 믹스 2 30 μL을 추가합니다.
  10. 1x HBSS로 미리 헹구는 1000 μL 파이펫 팁으로 시료를 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
  11. 37 °C에서 15 분 동안 휠 또는 셰이커에 샘플을 인큐베이션합니다.
  12. 배양 후, 각 튜브에 얼음-차가운 1x HBSS 10 mL을 추가하여 효소 믹스 1과 효소 믹스 2를 비활성화합니다.
  13. 4°C에서 320 x g에서 10분 동안 각 샘플을 원심분리기.
  14. 상급자 폐기; 얼음으로 차가운 1x HBSS를 각 튜브에 7 mL의 최종 부피까지 추가하고 소용돌이로 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.
  15. 이물질 제거를 위해 섹션 5를 계속합니다.

4. 뇌와 척수의 기계적 균질화

참고 : 이 섹션에 설명 된 볼륨은 반 뇌 또는 척수의 균질화에 충분합니다. 이 섹션에 설명된 프로토콜은 아래에 설명된 바와 같이 사용자 필요에 따라 섹션 3에 설명된 대안으로 사용될 수 있다.

  1. 얼음위에 놓인 Dounce 티슈그라인더(재료표)의유리 모르타르를 미리 식힙니다.
  2. 박격포에 미리 냉각된 1x HBSS 3mL를 추가합니다.
  3. 6웰 플레이트의 우물에서 유리 모르타르로 조직(뇌 또는 척수)을 옮겨 1x HBSS에 담그고 박격포 바닥에 앉습니다.
  4. 부드럽게 10 스트로크의 유봉 A로 조직을 분쇄하고 유봉 B. 균질화 된 혼합물을 새로운 15 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 옮김.
  5. 4°C에서 320 x g에서 10분 동안 미리 냉각된 1x HBSS 및 원심분리기를 사용하여 튜브를 최종 부피 10 mL로 채웁니다.
  6. 상월체를 흡인하고 각 튜브에 얼음처럼 차가운 1x HBSS를 추가하여 최종 부피 인 7 mL까지 가열하여 펠릿을 부드럽게 재돌이합니다.
  7. 이물질 제거를 위해 섹션 5를 계속합니다.

5. 파편 제거

참고: 주로 소화되지 않은 조직과 미엘린 칼집으로 구성된 이물질을 제거하는 것은 후속 유동 세포 측정 분석을 위해 조직 균질한 조직의 효율적인 염색을 허용하는 중요한 단계입니다.

  1. 70 μm 세포 스트레이너를 통해 각 샘플을 필터링하여 소화되지 않은 조직 덩어리를 제거합니다. 이 견본은 후속 단계에 영향을 미칠 수 있는 소화되지 않은 신경 단편 또는 수막을 포함하기 위하여 확률이 높기 때문에 이 단계는 척수 조직으로 일할 때 특히 중요합니다.
  2. 각 샘플 튜브의 최종 부피가 7mL인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 얼음 차가운 1x HBSS를 최대 7 mL로 채우소서.
  3. 각 샘플에 미리 냉각된 IPS 3mL를 추가하여 최종 농도30%에서 밀도 그라데이션 매질을 함유하는 용액의 최종 부피를 10mL로 만듭니다. 샘플을 균일하게 혼합할 수 있도록 샘플을 부드럽게 소용돌이시다.
  4. 원심분리기 샘플은 18°C에서 700 x g에서 15분 동안 시료를 사용하여 원심분리기의 가속을 7로 설정하고 브레이크를 0으로 설정합니다.
    참고 : 원심 분리는 약 30 분이 소요됩니다.
  5. 원심분리기에서 샘플을 섬세하게 제거합니다.
    참고: 파편과 미엘린으로 구성된 희끄무레한 디스크는 용액 표면에 떠 있는 것을 볼 수 있어야 합니다. 펠릿 (관심있는 세포를 포함하는)은 튜브의 바닥에 표시되어야합니다.
  6. 조심스럽게 파편의 모든 희끄무레한 디스크를 흡인하고 상급의 나머지는 펠릿을 빼내지 않도록합니다. 약 100 μL의 용액을 세포 펠릿 위에 두어 실수로 제거할 위험을 피하십시오.
  7. FACS BL 1mL를 추가하고, 100μL 파이펫 팁으로 위아래로 파이펫팅하여 펠릿을 다시 일시 중단하고 샘플을 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 넣습니다.
  8. 실온 (RT)에서 450 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
  9. 상판을 부드럽게 흡인하고 다운스트림 분석과 호환되는 적절한 버퍼에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다(여러 세포 유형의 유동 세포 측정 평가에 사용되는 프로토콜의 섹션 6 참조).

6. 여러 세포 유형의 유세포 측정 평가를위한 염색

  1. FACS BL의 350 μL로 5.9 단계에서 얻은 펠릿을 다시 중단. 5 μg/mL의 최종 농도에서 각 샘플에 Fc 블록을 추가합니다.
    참고: 신뢰할 수 있는 분석을 허용하기에 충분한 세포를 처리하기 위해 시료의 최소 100 μL을 하나의 염색에 사용해야 합니다.
  2. 염색을 진행하기 전에 4°C에서 10분 동안 샘플을 배양하였다.
  3. 표 1에따라 항체 혼합을 준비한다.
  4. 각 튜브에 항체 혼합물을 추가하고, 5 s의 소용돌이를 넣고 어둠 속에서 4 °C에서 15 분 동안 샘플을 배양합니다.
  5. 각 튜브, 소용돌이 및 원심분리기에 1 mL의 PBS를 추가하여 RT에서 450 x g에서 5 분 동안 추가하십시오.
  6. 한편 표 1에따라 스트렙타비딘 믹스를 준비한다.
  7. 상급체를 버리고 6.6단계에서 제조된 스트렙타비딘 혼합물에 펠릿을 다시 놓습니다. 각 샘플에 대해 6.4단계에서 염색에 사용되는 것과 동일한 부피를 사용하십시오.
  8. 소용돌이 5 s를 위해 4°C에서 10분 동안 샘플을 암흑에서 배양하였다.
  9. 각 튜브, 소용돌이 및 원심분리기에 1 mL의 PBS를 추가하여 RT에서 450 x g에서 5 분 동안 추가하십시오.
  10. 상급체를 버리고 FACS BL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
  11. 각 샘플에 7-아미노 액티노마이신 D(7-AAD) 용액을 첨가합니다. 6.10단계에서 제조된 시료 300μL마다 7-AAD 5 μL을 사용하십시오.
  12. 세포 불소화 분석까지 어두운 4 °C에서 샘플을 저장합니다. 시료 전형에서 16시간 이내에 분석을 수행하여 >60% 세포 생존가능성을 보장합니다.

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결과

우리는 마우스 뇌와 척수에 적용된 두 가지 균질화 방법(DH 대 PD)을 비교하여 다운스트림 애플리케이션에 적합한 다양한 생존 세포 유형을 검색하는 효율성을 테스트했습니다. 이를 위해, 우리는 마이크로글리아, 림프구, 뉴런, 성상 세포, 올리고덴드로시테 및 내피를 포함한 다른 CNS 세포 유형을 특성화하도록 설계된 9 색 유동 세포 분석 패널을 이용했습니다.

뇌 및 척수 조?...

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토론

본 명세서에서 우리는 마우스 뇌 및 척수로부터 가장 관련성이 높은 CNS 세포의 일부의 동시 정제 및 동시 유동 세포측정 분석을 위한 프로토콜을 기술한다. 전통적으로, 조직학 분석은 CNS5,13에서바이러스 벡터의 나노입자 또는 트랜스덕션 효율의 분포를 설명하거나, 병리학 또는 약리학적 치료 시 특정 세포 유형에서 발생하는 형태학적 및 분자 변화에...

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공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 연구는 A.B., ALSA 교부금 nr에 보스턴 아동 병원 창업 기금에 의해 투자되었습니다. 17-IIP-343에서 M.P.에, 그리고 상 번호에 따라 근위축성 측삭 경화증 연구 프로그램을 통해 건강 담당 차관의 사무실. W81XWH-17-1-0036 ~ M.P. 우리는 기술 지원을 위해 DFCI 흐름 세포 측정 코어를 인정합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)Gibco14185-052
70 mm Cell StrainerCorning431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibodyMiltenyi Biotec130-117-535APC conjugated
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibodyInvitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibodyBD Bioscience562939BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibodyBiolegend103138Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibodyBiolegend202518PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibodyBiolegend1005325PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)CellTreat229411
Conical Tubes (50 mL)CellTreat229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibodyBD Pharmingen553142
Fetal Bovine SerumBenchmark100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibodyMiltenyi Biotec130-095-895Biotin conjugated
PercollGE Healthcare10266569sold as not sterile reagent
PercollSigma65455529sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01reagent containing very low traces of endotoxin
StreptavidinInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 conjugated

참고문헌

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