通过不同的均质化方法从小鼠大脑/脊髓中检索到的多种细胞类型的同步流细胞测量特征

摘要

我们提出了一种流式细胞测定方法，用于识别从小鼠大脑或脊髓中检索到的不同细胞类型。该方法可用于分离或描述神经退行性疾病中的纯细胞群，或量化细胞靶向在体内给病毒载体或纳米粒子的靶向范围。

摘要

病毒载体和纳米材料科学的最新进展为研究或操纵中枢神经系统（CNS）的新方法开辟了道路。然而，这些技术的进一步优化将受益于在体内病毒载体或纳米粒子的培养后，能够快速和简化地确定中枢神经系统和细胞特定靶向的范围的方法。在这里，我们提出一个协议，利用流式细胞学的高通量和多路复用功能，允许从小鼠大脑或脊髓中分离的不同细胞亚型，即微胶质/巨噬细胞、淋巴细胞、星细胞、寡核苷酸细胞、神经元和内皮细胞进行直接定量。我们应用这种方法来突出两个组织均质方法在细胞产量、活力和组成方面的重要差异。这可以指示用户根据感兴趣的单元格类型和特定应用程序选择最佳方法。此方法不适合分析解剖分布，因为组织是同质化的，以产生单细胞悬浮液。然而，它允许与活细胞一起工作，它可以与细胞分类相结合，为几种应用开辟了道路，这些应用可以扩大神经科学家手中的工具范围，从建立从纯细胞种群衍生的初级培养物，到基因表达分析以及神经退行性疾病背景下明确定义的细胞亚型的基因表达或功能测定，在药物治疗或基因治疗时。

引言

基因和药物输送技术（如病毒载体和纳米粒子）已成为一个强大的工具，可以应用来获得对神经退行性疾病中改变的特定分子途径的更好见解，并开发创新的治疗方法1，2，3。这些工具的优化取决于以下方面:（1） 不同管理途径在中枢神经系统的渗透程度，以及（2） 针对特定细胞群。组织学分析通常应用于可视化荧光报告基因或荧光标记纳米粒子在不同的CNS区域和不同的细胞类型，通过免疫染色特定细胞^标记4，5识别。尽管这种方法提供了关于施用基因或药物输送工具的生物分布的宝贵信息，但该技术可能非常耗时和耗费大量人力，因为它需要:（1） 组织固定、冷冻保存或石蜡嵌入和切片;（2） 组织固定、冷冻保存或石蜡嵌入和切片;（2） 有时需要抗原检索的特定细胞标记物的染色;（3） 通过荧光显微镜采集，通常允许在同一实验中分析有限数量的不同标记;（4）图像处理，允许对感兴趣的信号进行适当的量化。

流式细胞学已成为一种广泛使用的技术，它利用非常特殊的荧光标记，不仅允许根据表面或细胞内抗原的表达对细胞悬浮液中的不同细胞表型进行快速定量评估，而且还允许功能测量（例如，凋亡率、增殖率、细胞周期分析等）。也可以通过荧光活化细胞分类对细胞进行物理分离，从而进一步进行下游应用（例如，细胞培养、RNAeq、生化分析等）^6，7，8.

组织均质化是获得单细胞悬浮液以进行可靠和可重复的下游流细胞测量的关键步骤。对成人脑组织均质化有不同的方法，主要目的是分离微胶质细胞9、10、11;它们可分为两大类:（1）机械分离， 它使用研磨或剪切力通过Dce均质剂（DH）撕开细胞从他们的利基，并形成一个相对均质的单细胞悬浮液，和（2）酶消化，它依赖于在37°C的分块组织块在存在蛋白酶，如胰蛋白酶，如胰蛋白酶，如胰蛋白酶，有利于细胞外基质的降解，以创建一个相当均质的细胞悬浮^液12。

无论使用哪种方法，在组织均质化后，建议通过密度梯度上的离心或磁^选择9、12去除骨髓，然后再转移到下游应用。

在这里，我们描述了一种基于木瓜素消化（PD）的组织处理方法，随后在密度梯度上进行纯化，经过优化，以时间敏感的方式从小鼠大脑或脊髓获得可行的异质细胞悬浮液，并适合流动细胞学。此外，我们描述了一个9色流细胞测定面板和我们在实验室采用的浇注策略，允许同时区分不同的CNS人群、活/死细胞或荧光报告机的积极性，如绿色荧光蛋白或罗达明染料。通过应用这种流式细胞测定分析，我们可以比较不同的组织处理方法，即PD与DH，在保持细胞活力和不同细胞类型的产量方面。

我们本文提供的细节可以指导根据感兴趣的特定细胞类型和下游分析（例如，温度敏感度）在流式细胞测定面板中使用的同质化协议和抗体组合。应用、特定荧光标记的跟踪、体外培养、功能分析）。

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研究方案

此处描述的所有方法均已获得达纳法伯癌症研究所的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（协议号16-024）。

1. 准备实验所需的解决方案

1. 用无菌水稀释10xHBSS，制备1x汉克的平衡盐溶液（HBSS）。在冰上预冷溶液。每个样品至少需要25 mL的溶液。
2. 通过将 10 倍无菌 HBSS 1:10 与密度梯度介质（即 Percoll）混合，制备等值贴贴胶溶液 （IPS）。在冰上预冷。
   注:IPS 可在 4°C 下存储长达 30 天。
3. 制备流式细胞学 （FACS） 阻断 （BL） 溶液 （1% 牛血清白蛋白 [BSA]， 5% 胎儿牛血清 [FBS] 在磷酸盐缓冲盐水 [PBS]）。在冰上预冷。

2. 通过心脏内灌注和组织解剖进行动物安乐死

注:实验中使用了8周大的C57BL/6J小鼠，无论是性别还是性别。在进行组织消化之前，使用PBS溶液进行灌注以消除器官的血液污染。

1. 使用氯胺酮/木氨酸的混合物（90⁄200毫克/千克氯胺酮，10毫克/千克木兰辛）对小鼠进行麻醉。将鼠标放在其背面，并将每个肢体向下胶带到支架。通过检查戒断反射来验证麻醉的充分深度。
2. 在胸腔入口的水平进行中线皮肤切口，以暴露胸骨。使用钳子抓住胸骨的尖端，然后在肋笼的每一侧切开一个1厘米的切口。最后切开隔膜，打开胸骨，足以使心脏形象化。
3. 使用钳子轻轻抓住心脏的右心室，并提起到中线和稍微出胸部。
4. 将 23 G 蝴蝶针插入左心室的尖端，朝向主塔并牢固地握住。
5. 使用 1x PBS 开始灌注。用剪刀刺穿右侧的尿孔，让渗透器退出循环。将PBS的流速设置为3 mL/min。
   注:肝脏和肠血管的发泡是良好的灌注迹象。如有必要，预输液量可以增加，直到流出心脏的液体没有血液，此时冲洗线可以停止。
6. 灌注后，将大脑从脊髓中切断，用剪刀和钳子将大脑从头骨上取出。去除毛皮，以提高解剖过程中的可见性和控制力，并避免携带头发污染物。使用装有PBS的3 mL注射器将脊髓从柱中冲洗出来。
7. 将每个组织转移到一个6孔多孔板的井中，预填充2 mL的冰冷1x HBSS，并保持在冰上直到消化。
8. 沿着纵线将大脑和脊髓分成两半。
   注:每个组织有一半是均质的（见下文各节），以便进行流动细胞学分析;另一半可分配给不同的处理替代分析（例如，浸在组织学的甲醛固定溶液中）。

3. 脑和脊髓的酶消化

注:本节中描述的体积足以消化半脑或脊髓。

1. 用剪刀将纸巾切成1⁄2毫米厚的碎片。
2. 用剪刀切割 1000 μL 移液器的尖端，使其足够大，以便收集组织件。用 1x HBSS 预冲洗移液器尖端。然后使用移液器将含有切碎组织的2 mL HBSS溶液转移到15 mL锥形管中。
   注意:移液器尖端的预浸水对于防止吸头内组织块粘附很重要。
3. 用额外的2 mL冰冷1x HBSS清洗油井，并将溶液转移到含有组织片的相应15 mL锥形管中。
4. 在4°C下，在250 x g下将每个样品离心5分钟。
5. 制备神经组织分离试剂盒（NTDK;材料表）将50μL的酶P与每个样品的1900μL缓冲X混合。在水浴中，在37°C下将热酶混合1。在37°C下孵育酶1，在使用前至少10分钟，以便完全激活酶。
6. 从15 mL锥形管中吸出上清液，并将1.95 mL的酶混合1到每个样品中。轻轻涡旋，确保颗粒重新悬浮。
7. 在 37°C 下在车轮或摇床上孵育样品 15 分钟。
8. 同时，通过将酶A的10μL与每个样品20μL的缓冲Y混合，制备NTDK的酶混合物2;在水浴中37°C预加热溶液。
9. 在用酶混合1孵育结束时，在每个样品中加入30μL的酶混合物2。
10. 通过使用 1x HBSS 预冲洗的 1000 μL 移液器尖端，轻轻混合样品。
11. 在 37°C 下在车轮或摇床上孵育样品 15 分钟。
12. 孵育后，在每个管中加入10 mL的冰冷1x HBSS，以灭活酶混合物1和酶混合2。
13. 在4°C下，在320 x g下将每个样品离心10分钟。
14. 丢弃上清液;在每个管子中加入冰冷的1x HBSS，最终体积达到7 mL，并通过涡旋轻轻重新悬浮颗粒。
15. 继续第 5 节清除碎屑。

4. 大脑和脊髓的机械均质化

注:本节中描述的体积足以使半脑或脊髓均匀化。本节中描述的协议可用作第 3 节中所述协议的方法替代方法，具体取决于下面讨论的用户需求。

1. 预冷在冰上的达克斯组织磨床的玻璃砂浆（材料表）。
2. 在砂浆中加入 3 mL 的预冷却 1x HBSS。
3. 将组织（大脑或脊髓）从 6 孔板的井转移到玻璃砂浆中，确保将其浸入 1x HBSS 中，并位于砂浆底部。
4. 轻轻粉碎组织与10冲程的刺A，然后10中风的虫子B.转移同质混合到一个新的15 mL锥形管。
5. 使用预冷却的 1x HBSS 和离心机在 4 °C 下以 320 x g的速度将管注入 10 mL 的最终体积。
6. 吸出上清液，将冰冷的 1x HBSS 添加到每根管中，最终体积为 7 mL，并通过涡旋轻轻重新悬浮颗粒。
7. 继续第 5 节清除碎屑。

5. 清除碎片

注:去除主要由未消化组织和骨髓护套组成的碎屑，是使组织均质物有效染色以进行后续流式细胞测定的关键步骤。

1. 通过70μm细胞过滤器过滤每个样品，以去除任何未消化的组织块。这一步尤其重要，特别是在处理脊髓组织时，因为这些样本更有可能包含未消化的神经片段或脑膜，可能会影响后续步骤。
2. 确保每个样品管的最终体积为 7 mL。如果没有，请加注冰冷 1x HBSS，最高为 7 mL。
3. 在每个样品中加入3 mL的预冷却IPS，使含有密度梯度培养基的溶液的最终体积为10 mL，最终浓度为30%。轻轻涡旋样品，以确保它们均匀混合。
4. 在18°C下在700 x g下进行15分钟的离心样品，确保离心机的加速度设置为7，制动器设置为0。
   注:离心大约需要 30 分钟。
5. 从离心机中小心地取出样品。
   注:由碎屑和骨髓组成的白色圆盘应可见漂浮在溶液表面。在管的底部应可见颗粒（包含感兴趣的细胞）。
6. 小心地吸出所有白色碎屑盘，然后吸出上清液的其余部分，确保不会移开颗粒。将约 100 μL 溶液留在细胞颗粒顶部，以避免无意中将其移开的风险。
7. 加入 1 mL 的 FACS BL，用 1000 μL 移液器尖端上下移液来重新悬浮颗粒，并将样品转移到 1.5 mL 管中。
8. 在室温 （RT） 下，在 450 x g下离心 5 分钟。
9. 轻轻吸出上清液，并将颗粒重新悬浮在与下游分析兼容的适当缓冲液中（参见第 6 节，了解用于多种细胞类型的流式细胞测量的协议）。

6. 用于多种细胞类型的流式细胞测定的染色

1. 用350 μL的FACS BL重新悬浮步骤5.9中获得的颗粒。以5μg/mL的最终浓度向每个样品添加Fc-block。
   注:至少100 μL的样品应用于一个染色，以确保处理足够的细胞，以便进行可靠的分析。
2. 在继续染色之前，在4°C下孵育样品10分钟。
3. 根据表1准备抗体混合物。
4. 将抗体混合物加入每根管中，涡旋5秒，在黑暗中4°C下孵育样品15分钟。
5. 在RT处以450 x g向每管、涡流和离心机添加1 mL的PBS5分钟。
6. 同时根据表1准备链球菌混合剂。
7. 丢弃上清液，并在步骤 6.6 中准备的链球蛋白混合物中重新悬浮颗粒。对于每个样品，使用与步骤 6.4 中用于染色的体积相同的体积。
8. 涡旋5秒，在黑暗中4°C下孵育样品10分钟。
9. 在RT处以450 x g向每管、涡流和离心机添加1 mL的PBS5分钟。
10. 丢弃上清液，在FACS BL中重新悬浮颗粒。对于每100μL的样品染色，使用300μL的FACS BL。
11. 在每个样品中加入7-氨基-actinocin D（7-AAD）溶液。对于步骤 6.10 中制备的每 300 μL 样品，使用 5 μL 的 7-AAD。
12. 在黑暗中将样品储存在4°C下，直到进行细胞氟化分析。从样品制备开始16小时内进行分析，保证大于60%的细胞活力。

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结果

我们比较了应用于小鼠大脑和脊髓的两种不同的均质化方法（DH与PD），以测试检索适合下游应用的不同可行细胞类型的效率。为此，我们利用了一个9色流细胞测定面板，设计成在同一样本中，包括微胶质、淋巴细胞、神经元、星形细胞、寡核苷酸和内皮球在内的不同中枢神经系统细胞类型。

从不同的小鼠（n = 6）中检索大脑和脊髓组织，纵向分成两半，使用Duce均质器（DH方?...

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讨论

本文介绍一种协议，用于对小鼠大脑和脊髓中一些最相关的CNS细胞进行共纯化和并发流细胞学分析。传统上，组织学分析已应用于描述纳米粒子的分布或病毒载体在CNS^5，13的转导效率，或提供在病理学或药理治疗期间特定细胞类型发生的形态和分子变化的^见解14。然而，组织学缺乏过程性，由于可以同时分析的标记数量有限，因此无法...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)	Gibco	14185-052
70 mm Cell Strainer	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugated
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibody	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibody	BD Bioscience	562939	BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibody	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody	Biolegend	202518	PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody	Biolegend	1005325	PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)	CellTreat	229411
Conical Tubes (50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody	BD Pharmingen	553142
Fetal Bovine Serum	Benchmark	100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibody	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotin conjugated
Percoll	GE Healthcare	10266569	sold as not sterile reagent
Percoll	Sigma	65455529	sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	reagent containing very low traces of endotoxin
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugated