Caractérisation cytométrique simultanée des types de cellules multiples récupérées du cerveau de la souris / moelle épinière grâce à différentes méthodes d'homogénéisation

Résumé

Nous présentons une méthode de cytométrie de flux pour identifier simultanément différents types de cellules récupérées du cerveau de souris ou de la moelle épinière. Cette méthode pourrait être exploitée pour isoler ou caractériser les populations cellulaires pures dans les maladies neurodégénératives ou pour quantifier l'étendue du ciblage cellulaire sur l'administration in vivo de vecteurs viraux ou de nanoparticules.

Résumé

Les progrès récents des sciences des vecteurs viraux et des nanomatériaux ont ouvert la voie à de nouvelles approches de pointe pour étudier ou manipuler le système nerveux central (SNC). Cependant, une optimisation plus poussée de ces technologies bénéficierait de méthodes permettant une détermination rapide et rationalisée de l'étendue du SNC et du ciblage cellulaire spécifique à l'administration de vecteurs viraux ou de nanoparticules dans l'organisme. Ici, nous présentons un protocole qui tire parti des capacités de haut débit et de multiplexage de la cytométrie du débit pour permettre une simple quantification de différents sous-types cellulaires isolés du cerveau de souris ou de la moelle épinière, à savoir des microglies/macrophages, des lymphocytes, des astrocytes, des oligodendrocytes, des neurones et des cellules endothéliales. Nous appliquons cette approche pour mettre en évidence les différences critiques entre deux méthodes d'homogénéisation des tissus en termes de rendement cellulaire, de viabilité et de composition. Cela pourrait demander à l'utilisateur de choisir la meilleure méthode en fonction du type de cellule (s) d'intérêt et de l'application spécifique. Cette méthode n'est pas adaptée à l'analyse de la distribution anatomique, puisque le tissu est homogénéisé pour générer une suspension unicellulaire. Cependant, il permet de travailler avec des cellules viables et il peut être combiné avec le tri cellulaire, ouvrant la voie à plusieurs applications qui pourraient élargir le répertoire des outils dans les mains du neuroscientifique, allant de l'établissement de cultures primaires dérivées de populations cellulaires pures, à des analyses d'expression génique et des essais biochimiques ou fonctionnels sur des sous-types cellulaires bien définis dans le contexte des maladies neurodégénératives, sur le traitement pharmacologique ou la thérapie génique.

Introduction

Les technologies d'administration de gènes et de médicaments (comme les vecteurs viraux et les nanoparticules) sont devenues un outil puissant qui peut être appliqué pour obtenir de meilleures connaissances sur des voies moléculaires spécifiques modifiées dans les maladies neurodégénératives et pour le développement d'approches thérapeutiques innovantes^1,2,3. L'optimisation de ces outils repose sur la quantification de : (1) l'étendue de la pénétration du SNC sur différents axes d'administration et (2) le ciblage de populations cellulaires spécifiques. Les analyses histologiques sont généralement appliquées pour visualiser les gènes des reporters fluorescents ou les nanoparticules étiquetées fluorescentes dans différentes zones du SNC et dans différents types de cellules, identifiées par l'immunostaining pour des marqueurs cellulaires spécifiques^4,5. Même si cette approche fournit des informations précieuses sur la biodistribution du gène administré ou des outils de livraison de médicaments, la technique peut être longue et laborieuse, car elle nécessite : (1) fixation des tissus, cryoconservation ou encastrage et découpage de paraffine; (2) la coloration de marqueurs cellulaires spécifiques nécessitant parfois la récupération d'antigènes; (3) acquisition par microscopie fluorescence, qui permet habituellement l'analyse d'un nombre limité de marqueurs différents au sein d'une même expérience; (4) le traitement d'image pour permettre une quantification appropriée du signal d'intérêt.

La cytométrie de flux est devenue une technique largement utilisée qui tire parti de marqueurs fluorescents très spécifiques pour permettre non seulement une évaluation quantitative rapide de différents phénotypes cellulaires dans les suspensions cellulaires, basée sur l'expression d'antigènes de surface ou intracellulaires, mais aussi des mesures fonctionnelles (p. ex., taux d'apoptose, prolifération, analyse du cycle cellulaire, etc.). L'isolement physique des cellules par le tri des cellules activées fluorescentes est également possible, permettant d'autres applications en aval (p. ex., culture cellulaire, RNAseq, analyses biochimiques, etc.) ^6,7,8.

L'homogénéisation tissulaire est une étape critique nécessaire pour obtenir une suspension cellulaire unique afin de permettre des évaluations cytométriques fiables et reproductibles en aval. Différentes méthodes ont été décrites pour l'homogénéisation adulte de cerveau-tissu, principalement dans le but d'isoler des cellules^demicroglie 9^,10,11; ils peuvent être classés dans l'ensemble dans deux catégories principales : (1) dissociation mécanique, qui utilise la force de broyage ou de cisaillement à travers un homogénéisateur Dounce (DH) pour déchirer les cellules de leurs niches et former une suspension à cellule unique relativement homogénéisée, et (2) la digestion enzymatique, qui repose sur l'incubation de morceaux de tissu haché à 37 oC en présence d'enzymes protéolytiques, telles que la trypsine ou la papaïne, favorisant la dégradation de la matrice extracellulaire pour créer une suspension cellulaire assez homogène¹².

Quelle que soit la méthode utilisée, une étape de purification est recommandée après l'homogénéisation des tissus pour enlever la myéline par centrifugation sur un gradient de densité ou par sélection magnétique^9,12, avant de passer aux applications en aval.

Ici, nous décrivons une méthode de traitement de tissu basée sur la digestion de papain (PD) suivie de la purification sur un gradient de densité, optimisée pour obtenir des suspensions hétérogènes viables de cellules du cerveau de souris ou de la moelle épinière d'une manière temporelle et appropriée pour la cytométrie d'écoulement. En outre, nous décrivons un panneau de cytométrie de flux de 9 couleurs et la stratégie de gating que nous avons adoptée en laboratoire pour permettre la discrimination simultanée de différentes populations de SNC, cellules vivantes/mortes ou positivité pour les journalistes fluorescents tels que la protéine fluorescente verte ou la teinture de rhodamine. En appliquant cette analyse cytométrique de flux, nous pouvons comparer différentes méthodes de traitement des tissus, c'est-à-dire la DP par rapport à la DH, en termes de préservation de la viabilité cellulaire et des rendements de différents types de cellules.

Les détails que nous fournissons dans les présentes peuvent indiquer la décision sur le protocole d'homogénéisation et la combinaison d'anticorps à utiliser dans le panneau de cytométrie de débit, basé sur le type de cellule spécifique (s) d'intérêt et les analyses en aval (par exemple, la température sensible applications, suivi de marqueurs fluorescents spécifiques, culture in vitro, analyses fonctionnelles).

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Dana Farber Cancer Institute (protocole numéro 16-024).

1. Préparation des solutions nécessaires à l'expérience

1. Préparer la solution de sel équilibrée (HBSS) de 1x Hank en diluant 10x HBSS avec de l'eau stérile. Pré-réfrigérer la solution sur glace. Au moins 25 ml de solution sont nécessaires pour chaque échantillon.
2. Préparer la solution isotonique Percoll (IPS) en mélangeant 10x HBSS stérile 1:10 avec le milieu de gradient de densité (c.-à-d., Percoll). Pré-froid sur glace.
   REMARQUE : L'IPS peut être stocké jusqu'à 30 jours à 4 oC.
3. Préparer la solution de blocage de la cytométrie du débit (FACS) (BL) (1 % d'albumine de sérum bovin [BSA], 5 % de sérum bovin fœtal [FBS] en saline tamponnée de phosphate [PBS]). Pré-froid sur glace.

2. Euthanasie animale par perfusion intracardiaque et dissection tissulaire

REMARQUE : Des souris C57BL/6J de huit semaines, que ce soit le sexe, ont été utilisées dans les expériences. La perfusion avec la solution de PBS est exécutée pour éliminer la contamination de sang des organes, avant de procéder à la digestion de tissu.

1. Anesthésiez la souris à l'aide d'un mélange de kétamine/xylazine (90 à 200 mg/kg de kétamine, 10 mg/kg de xylazine). Placez la souris sur le dos et ruban adhésif chaque membre vers le bas pour le soutien. Vérifier la profondeur adéquate de l'anesthésie en vérifiant le réflexe de sevrage.
2. Faire une incision de la peau de la ligne médiane au niveau de l'entrée thoracique pour exposer le sternum. Utilisez des forceps pour saisir la pointe du sternum, puis faites une incision de 1 cm de chaque côté de la cage thoracique. Enfin couper à travers le diaphragme et ouvrir le sternum assez largement pour visualiser le cœur.
3. Utilisez des forceps pour saisir doucement le cœur par le ventricule droit et le soulever à la ligne médiane et légèrement hors de la poitrine.
4. Insérer une aiguille papillon de 23 G dans la pointe du ventricule gauche, vers l'aorte et tenir fermement.
5. Démarrer la perfusion avec 1x PBS. Percer à travers l'oreillette droite à l'aide de ciseaux pour permettre au perfusat e de sortir de la circulation. Régler le débit de PBS à 3 ml/min. Perfuse avec au moins 15 ml de 1x PBS pour s'assurer que les tissus sont clairs.
   REMARQUE : Le blanchiment du foie et des vaisseaux sanguins mésentériques sont des signes de bonne perfusion. Si nécessaire, le volume de préfusion peut être augmenté jusqu'à ce que le liquide sortant du cœur est clair de sang, à quel point la ligne de chasse d'eau peut être arrêté.
6. Après perfusion, couper le cerveau de la moelle épinière et retirer le cerveau du crâne avec des ciseaux et des forceps. Enlever la fourrure pour augmenter la visibilité et le contrôle pendant la dissection et pour éviter de transporter des contaminants capillaires. Rincer la moelle épinière de sa colonne à l'aide d'une seringue de 3 ml remplie de PBS.
7. Transférer chaque tissu dans un puits d'une plaque multi-puits de 6 puits préremplie de 2 ml de 1x HBSS glacé et conserver sur la glace jusqu'à la digestion.
8. Diviser le cerveau et la moelle épinière en deux moitiés, le long de la ligne longitudinale.
   REMARQUE : La moitié de chaque tissu est homogénéisée (voir les sections ci-dessous) pour permettre des analyses cytométriques de débit; l'autre moitié peut être affectée à différents traitements pour des analyses alternatives (p. ex., trempées dans une solution fixative de paraformaldéhyde pour l'histologie).

3. Digestion enzymatique du cerveau et de la moelle épinière

REMARQUE : Les volumes décrits dans cette section sont suffisants pour la digestion d'une moitié du cerveau ou de la moelle épinière.

1. Utilisez une paire de ciseaux pour hacher les tissus en morceaux d'une épaisseur de 1 à 2 mm.
2. Couper la pointe d'une pipette de 1000 l avec une paire de ciseaux pour la rendre suffisamment grande pour permettre la collecte des morceaux de tissu. Pré-rincez la pointe de pipette avec 1x HBSS. Ensuite, utilisez la pipette pour transférer les 2 ml de solution HBSS contenant le tissu haché à un tube conique de 15 ml.
   REMARQUE : Il est important de pré-rincer la pointe de la pipette pour éviter l'adhérence des morceaux de tissu à l'intérieur de la pointe.
3. Laver le puits avec 2 ml supplémentaires de 1x HBSS glacé et transférer la solution au tube conique correspondant de 15 ml contenant les morceaux de tissu.
4. Centrifuger chaque échantillon pendant 5 min à 250 x g à 4 oC.
5. Préparer le mélange d'enzymes 1 du kit de dissociation des tissus neuronaux (NTDK; Tableau des matériaux) en mélangeant 50 l'enzyme P avec 1900 l de tampon X par échantillon. Mélange d'enzymes chaudes 1 à 37 oC dans un bain d'eau. Incuber le mélange d'enzymes 1 à 37 oC pendant au moins 10 minutes avant utilisation afin de permettre l'activation complète de l'enzyme.
6. Aspirer le supernatant du tube conique de 15 ml et ajouter 1,95 ml de mélange d'enzymes 1 à chaque échantillon. Vortex doucement pour s'assurer que le granule est suspendu.
7. Incuber les échantillons sur une roue ou un shaker pendant 15 min à 37 oC.
8. Pendant ce temps, préparer le mélange d'enzymes 2 du NTDK en mélangeant 10 l d'enzyme a avec 20 l de tampon Y par échantillon; préchauffer la solution à 37 oC dans un bain d'eau.
9. À la fin de l'incubation avec le mélange d'enzymes 1, ajouter 30 l de mélange d'enzymes 2 à chaque échantillon.
10. Mélanger délicatement les échantillons en faisant monter et descendre avec une pointe de pipette de 1000 l pré-rincée avec 1x HBSS.
11. Incuber l'échantillon sur une roue ou un shaker pendant 15 min à 37 oC.
12. Après l'incubation, ajouter 10 ml de 1x HBSS glacé à chaque tube pour inactiver le mélange d'enzymes 1 et le mélange d'enzymes 2.
13. Centrifuger chaque échantillon pendant 10 min à 320 x g à 4 oC.
14. Jeter le supernatant; ajouter 1x HBSS glacé à chaque tube jusqu'à un volume final de 7 ml et resuspendre doucement la pastille par vortex.
15. Continuer à la section 5 pour l'enlèvement des débris.

4. Homogénéisation mécanique du cerveau et de la moelle épinière

REMARQUE : Les volumes décrits dans cette section sont suffisants pour l'homogénéisation d'une demi-cerveau ou de la moelle épinière. Le protocole décrit dans cette section peut être utilisé comme une méthode alternative à celle décrite à la section 3, en fonction des besoins de l'utilisateur comme discuté ci-dessous.

1. Pré-réfrigérer le mortier de verre du broyeur de tissu Dounce (Table of Materials) mis sur la glace.
2. Ajouter 3 ml de 1x HBSS préréfrigéré au mortier.
3. Transférer le tissu (cerveau ou moelle épinière) du puits de la plaque de 6 puits dans le mortier de verre en s'assurant qu'il est trempé dans 1x HBSS et se trouve au fond du mortier.
4. Écraser doucement le tissu avec 10 coups de pilon A suivis de 10 coups de pilon B. Transférer le mélange homogénéisé dans un nouveau tube conique de 15 ml.
5. Remplir le tube à un volume final de 10 ml en utilisant 1x HBSS préréfrigéré et centrifugeuse pendant 10 min à 320 x g à 4 oC.
6. Aspirer le supernatant et ajouter 1x HBSS glacé à chaque tube jusqu'à un volume final de 7 ml et resuspendre doucement la pastille par vortex.
7. Continuer à la section 5 pour l'enlèvement des débris.

5. Enlèvement des débris

REMARQUE : L'enlèvement des débris, composés principalement de tissus non digérés et de gaines de myéline, est une étape critique pour permettre une coloration efficace du tissu homogénéiser pour des analyses cytométriques ultérieures.

1. Filtrer chaque échantillon à travers une passoire cellulaire de 70 m pour enlever tout morceau de tissu non digéré. Cette étape est particulièrement importante, surtout lorsque l'on travaille avec les tissus de la moelle épinière puisque ces échantillons sont plus susceptibles de contenir des fragments de nerf non digérés ou des méninges qui pourraient affecter les étapes suivantes.
2. Assurez-vous que le volume final est de 7 ml dans chaque tube d'échantillon. Si ce n'est pas le cas, remplissez de 1x HBSS glacé jusqu'à 7 ml.
3. Ajouter 3 ml d'IPS préréfrigéré à chaque échantillon pour faire un volume final de 10 ml d'une solution contenant un gradient de densité moyen à 30 % de concentration finale. Vortex doucement les échantillons pour s'assurer qu'ils sont homogènement mélangés.
4. Échantillons de centrifugeuse de 15 min à 700 x g à 18 oC pour s'assurer de fixer l'accélération de la centrifugeuse à 7 et le frein à 0.
   REMARQUE : La centrifugation devrait prendre environ 30 min.
5. Retirer délicatement les échantillons de la centrifugeuse.
   REMARQUE : Un disque blanchâtre composé de débris et de myéline doit être visible flottant à la surface de la solution. Une pastille (contenant les cellules d'intérêt) doit être visible au bas du tube.
6. Aspirez soigneusement tout le disque blanchâtre des débris, puis le reste du supernatant en veillant à ne pas déloger le granule. Laissez environ 100 L de solution sur le dessus de la pastille cellulaire pour éviter le risque de le déloger par inadvertance.
7. Ajouter 1 mL de FACS BL, resuspendre le granule en faisant monter et descendre avec une pointe de pipette de 1000 l et transférer des échantillons dans des tubes de 1,5 mL.
8. Centrifugeuse de 5 min à 450 x g à température ambiante (RT).
9. Aspirez doucement le supernatant et suspendez le granule dans un tampon approprié compatible avec les analyses en aval (voir la section 6 du protocole utilisé pour l'évaluation cytométrique du débit de plusieurs types de cellules).

6. Coloration pour l'évaluation cytométrique de flux de plusieurs types de cellules

1. Resuspendre la pastille obtenue à l'étape 5.9 avec 350 L de FACS BL. Ajouter le bloc Fc à chaque échantillon à une concentration finale de 5 g/mL.
   REMARQUE : Au moins 100 L de l'échantillon doivent être utilisés pour une coloration, afin de s'assurer de traiter suffisamment de cellules pour permettre des analyses fiables.
2. Incuber l'échantillon pendant 10 min à 4 oC avant de procéder à la coloration.
3. Préparer un mélange d'anticorps selon le tableau 1.
4. Ajouter le mélange d'anticorps à chaque tube, le vortex pendant 5 s et incuber les échantillons pendant 15 min à 4 oC dans l'obscurité.
5. Ajouter 1 ml de PBS à chaque tube, vortex et centrifugeuse pendant 5 min à 450 x g à RT.
6. Pendant ce temps préparer le mélange de streptavidin selon le tableau 1.
7. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans le mélange de streptavidin préparé à l'étape 6.6. Pour chaque échantillon, utilisez le même volume que celui utilisé pour la coloration à l'étape 6.4.
8. Vortex pour 5 s et incuber les échantillons pendant 10 min à 4 oC dans l'obscurité.
9. Ajouter 1 ml de PBS à chaque tube, vortex et centrifugeuse pendant 5 min à 450 x g à RT.
10. Jetez le supernatant et suspendez à nouveau la pastille dans FACS BL. Utilisez 300 L de FACS BL pour chaque 100 L d'échantillon taché.
11. Ajouter la solution 7-amino-actinomycine D (7-AAD) à chaque échantillon. Utilisez 5 ll de 7-AAD pour chaque 300 l d'échantillon préparé à l'étape 6.10.
12. Conserver les échantillons à 4 oC dans l'obscurité jusqu'à l'analyse cytofluorimétrique. Effectuer l'analyse dans les 16 h à partir de la préparation de l'échantillon, afin de garantir la viabilité de la cellule à 60 %.

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Résultats

Nous avons comparé deux méthodes différentes d'homogénéisation (DH contre PD) appliquées au cerveau de souris et à la moelle épinière, pour tester l'efficacité dans la récupération de différents types de cellules viables adaptées aux applications en aval. Pour ce faire, nous avons exploité un panneau de cytométrie de flux de 9 couleurs conçu pour caractériser, dans le même échantillon, différents types de cellules du SNC, y compris les microglies, les lymphocytes, les neurones, les astrocytes, les ol...

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Discussion

Ici nous décrivons un protocole pour la co-purification et l'analyse cytométrique simultanée de flux de quelques-unes des cellules les plus pertinentes de CNS du cerveau de souris et de la moelle épinière. Traditionnellement, des analyses histologiques ont été appliquées pour décrire la distribution des nanoparticules ou l'efficacité de la transduction des vecteurs viraux dans le SNC^5,13, ou pour fournir des informations sur les changements morphologiqu...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)	Gibco	14185-052
70 mm Cell Strainer	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugated
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibody	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibody	BD Bioscience	562939	BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibody	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody	Biolegend	202518	PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody	Biolegend	1005325	PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)	CellTreat	229411
Conical Tubes (50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody	BD Pharmingen	553142
Fetal Bovine Serum	Benchmark	100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibody	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotin conjugated
Percoll	GE Healthcare	10266569	sold as not sterile reagent
Percoll	Sigma	65455529	sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	reagent containing very low traces of endotoxin
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugated