Caratterizzazione citometrica a flusso simultaneo di più tipi di cellule recuperate dal cervello del mouse/cavo spinale attraverso diversi metodi di omogeneizzazione

Riepilogo

Vi presentiamo un metodo di citometria di flusso per identificare contemporaneamente diversi tipi di cellule recuperate dal cervello del topo o dal midollo spinale. Questo metodo potrebbe essere sfruttato per isolare o caratterizzare le popolazioni di cellule pure nelle malattie neurodegenerative o per quantificare l'estensione del targeting cellulare sulla somministrazione in vivo di vettori virali o nanoparticelle.

Abstract

I recenti progressi nelle scienze dei vettori virali e dei nanomateriali hanno aperto la strada a nuovi approcci all'avanguardia per studiare o manipolare il sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, un'ulteriore ottimizzazione di queste tecnologie trarrebbe vantaggio da metodi che consentano una rapida determinazione e una snellimento della portata del SNC e del targeting specifico per le cellule sulla somministrazione di vettori virali o nanoparticelle nel corpo. Qui, presentiamo un protocollo che sfrutta l'alta produttività e le capacità multiplexing della citometria di flusso per consentire una semplice quantificazione di diversi sottotipi di cellule isolati dal cervello del topo o dal midollo spinale, vale a dire microglia/macrofagi, linfociti, astrociti, oligodendrociti, neuroni e cellule endoteliali. Applichiamo questo approccio per evidenziare le differenze critiche tra due metodi di omogeneizzazione dei tessuti in termini di resa cellulare, vitalità e composizione. Questo potrebbe istruire l'utente a scegliere il metodo migliore a seconda del tipo di cella o dei tipi di cella di interesse e dell'applicazione specifica. Questo metodo non è adatto per l'analisi della distribuzione anatomica, poiché il tessuto è omogeneizzato per generare una sospensione a cella singola. Tuttavia, permette di lavorare con cellule vitali e può essere combinato con lo smistamento cellulare, aprendo la strada a diverse applicazioni che potrebbero espandere il repertorio di strumenti nelle mani del neuroscienziato, che vanno dall'istituzione di colture primarie derivate da popolazioni di cellule pure, ad analisi gene-expression e saggi biochimici o funzionali su sottotipi cellulari ben definiti nel contesto di malattie neurodegenerative, sul trattamento farmacologico o sulla terapia genica.

Introduzione

Le tecnologie di somministrazione di geni e farmaci (come vettori virali e nanoparticelle) sono diventate un potente strumento che può essere applicato per ottenere migliori informazioni su percorsi molecolari specifici alterati nelle malattie neurodegenerative e per lo sviluppo di approcci terapeutici innovativi^1,2,3. L'ottimizzazione di questi strumenti si basa sulla quantificazione di: (1) l'entità della penetrazione nel SNC su diverse vie di somministrazione e (2) targeting di specifiche popolazioni cellulari. Le analisi istologiche sono di solito applicate per visualizzare geni reporter fluorescenti o nanoparticelle fluorescenti in diverse aree del SNC e in diversi tipi di cellule, identificate dall'immunostaining per specifici marcatori cellulari^4,5. Anche se questo approccio fornisce informazioni preziose sulla biodistribuzione degli strumenti di parto genico o di somministrazione di farmaci somministrati, la tecnica può richiedere molto tempo e un'intensa attività perché richiede: (1) fissazione dei tessuti, crioconservazione o pastura-incorporazione e affettatura; (2) colorazione per marcatori cellulari specifici che a volte richiedono il recupero dell'antigene; (3) acquisizione mediante microscopia a fluorescenza, che di solito consente l'analisi di un numero limitato di marcatori diversi all'interno dello stesso esperimento; (4) l'elaborazione delle immagini per consentire una corretta quantificazione del segnale di interesse.

La citometria di flusso è diventata una tecnica ampiamente utilizzata che sfrutta marcatori fluorescenti molto specifici per consentire non solo una rapida valutazione quantitativa di diversi fenotipi cellulari nelle sospensioni cellulari, basata sull'espressione di antigeni superficiali o intracellulari, ma anche misurazioni funzionali (ad esempio, tasso di apoptosi, proliferazione, analisi del ciclo cellulare, ecc.). È inoltre possibile l'isolamento fisico delle cellule attraverso lo smistamento fluorescente delle cellule attivate, consentendo ulteriori applicazioni a valle (ad esempio, coltura cellulare, RNA, analisi biochimiche, ecc.) ^6,7,8.

L'omogeneizzazione dei tessuti è un passo fondamentale necessario per ottenere una sospensione a singola cella per consentire valutazioni citometriche a flusso a valle affidabili e riproducibili. Sono stati descritti diversi metodi per l'omogeneizzazione del tessuto cerebrale adulto, principalmente con l'obiettivo di isolare le cellule di microglia^9,10,11; possono essere classificati complessivamente in due categorie principali: (1) dissociazione meccanica, che utilizza la forza di macinazione o di taglio attraverso un omogeneizzatore Dounce (DH) per strappare le cellule dalle loro nicchie e formare una sospensione a singola cella relativamente omogenea, e (2) digestione enzimatica, che si basa sull'incubazione di pezzi di tessuto macinato a 37 gradi centigradi in presenza di enzimi proteolitici, come la prova o la papaina, favorendo la degradazione della matrice extracellulare per creare una sospensione cellulare abbastanza omogenea¹².

Indipendentemente dal metodo utilizzato, si raccomanda una fase di purificazione dopo l'omogeneizzazione dei tessuti per rimuovere la mielina attraverso la centrifugazione su un gradiente di densità o per selezione magnetica^9,12, prima di passare alle applicazioni a valle.

Qui, descriviamo un metodo di lavorazione dei tessuti basato sulla digestione della papaina (PD) seguito dalla purificazione su un gradiente di densità, ottimizzato per ottenere sospensioni cellulari eterogenee praticabili dal cervello del topo o dal midollo spinale in modo sensibile al tempo e adatto per la citometria di flusso. Inoltre, descriviamo un pannello di citometria a flusso a 9 colori e la strategia di gating che abbiamo adottato in laboratorio per consentire la discriminazione simultanea di diverse popolazioni di SNC, cellule vive /morte o positività per giornalisti fluorescenti come proteine fluorescenti verdi o coloranti di rodamina. Applicando questa analisi citometrica del flusso, possiamo confrontare diversi metodi di lavorazione dei tessuti, cioè PD contro DH, in termini di conservazione della vitalità cellulare e rendimenti di diversi tipi di cellule.

I dettagli che forniamo nel presente documento possono istruire la decisione sul protocollo di omogeneizzazione e sulla combinazione di anticorpi da utilizzare nel pannello della citometria di flusso, in base al tipo o alle specifiche cellule di interesse e alle analisi a valle (ad esempio, sensibili alla temperatura applicazioni, tracciamento di specifici marcatori fluorescenti, cultura in vitro, analisi funzionali).

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Dana Farber Cancer Institute (numero di protocollo 16-024).

1. Preparazione delle soluzioni necessarie per l'esperimento

1. Preparare 1x soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS) diluindo 10x HBSS con acqua sterile. Pre-raffreddare la soluzione sul ghiaccio. Per ogni campione sono necessari almeno 25 mL di soluzione.
2. Preparare la soluzione ISotonica Percoll (IPS) mescolando 10x sterile HBSS 1:10 con grado di gradiente di densità (cioè Percoll). Pre-freddo sul ghiaccio.
   NOTA: l'IPS può essere conservato per un massimo di 30 giorni a 4 gradi centigradi.
3. Preparare la soluzione di blocco della citometria a flusso (FACS) (1% di albumin del siero bovino [BSA], il siero bovino fetale 5% [FBS] in salina tampina tamponata da fosfati [PBS]). Pre-freddo sul ghiaccio.

2. Eutanasia animale per perfusione intracardiaca e dissezione tissutale

NOTA: negli esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/6J di otto settimane, entrambi sessuali. La perfusione con soluzione PBS viene eseguita per eliminare la contaminazione del sangue dagli organi, prima di procedere con la digestione tissutale.

1. Anestesizzare il topo utilizzando una miscela di ketamina/xylazina (90-200 mg/kg di ketamina, 10 mg/kg di xilanina). Posizionare il mouse sulla schiena e nastro ogni arto verso il basso per il supporto. Verificare un'adeguata profondità di anestesia controllando il riflesso di prelievo.
2. Fare un'incisione cutanea midline a livello dell'isolotto toracico per esporre lo sterno. Utilizzare le pinze per afferrare la punta dello sterno, quindi fare un'incisione di 1 cm su ciascun lato della gabbia toracica. Infine tagliare il diaframma e aprire lo sterno abbastanza ampiamente per visualizzare il cuore.
3. Utilizzare le pinze per afferrare delicatamente il cuore dal ventricolo destro e sollevarlo alla linea mediana e leggermente fuori dal petto.
4. Inserire un ago di 23 G farfalla nella punta del ventricolo sinistro, verso l'aorta e tenere saldamente.
5. Avviare la perfusione con 1x PBS. Pierce attraverso l'auricolare destro utilizzando le forbici per permettere al perfusate di uscire dalla circolazione. Impostare la portata di PBS a 3 mL/min. Perfuse con almeno 15 mL di 1x PBS per garantire che i tessuti siano chiari.
   NOTA: Sbiancamento del fegato e vasi sanguigni mesenteerici sono segni di buona perfusione. Se necessario, il volume di prefusione può essere aumentato fino a quando il fluido che esce dal cuore è libero dal sangue, a quel punto la linea di scarico può essere fermata.
6. Dopo la perfusione, recidere il cervello dal midollo spinale e rimuovere il cervello dal cranio con forbici e pinze. Rimuovere la pelliccia per aumentare la visibilità e il controllo durante la dissezione ed evitare di portare sopra i contaminanti dei capelli. Svuotare il midollo spinale dalla sua colonna utilizzando una siringa da 3 mL riempita con PBS.
7. Trasferire ogni tessuto in un pozzo di una piastra multi-bene di 6 pozze preriempito con 2 mL di ghiaccio 1x HBSS e tenere sul ghiaccio fino alla digestione.
8. Dividere il cervello e il midollo spinale in due metà, lungo la linea longitudinale.
   NOTA: La metà di ogni tessuto è omogeneizzata (vedi sezioni sotto) per consentire analisi citometriche di flusso; l'altra metà può essere assegnata a diverse elaborazioni per analisi alternative (ad esempio, immersa in soluzione fixativa paraformaldeide per l'istologia).

3. Digestione ezimatica del cervello e del midollo spinale

NOTA: I volumi descritti in questa sezione sono sufficienti per la digestione di metà del cervello o del midollo spinale.

1. Usa un paio di forbici per macinare i tessuti in pezzi spessi 1,2 mm.
2. Tagliare la punta di una pipetta da 1000 gradi con un paio di forbici per renderla sufficientemente grande da consentire la raccolta dei pezzi di tessuto. Pre-risciacquare la punta della pipetta con 1x HBSS. Quindi utilizzare la pipetta per trasferire la soluzione di 2 mL di HBSS contenente il tessuto macinato in un tubo conico da 15 mL.
   NOTA: Il pre-risciacquo della punta della pipetta è importante per evitare la viscosità dei pezzi di tessuto all'interno della punta.
3. Lavare il pozzo con ulteriori 2 mL di ghiaccio-freddo 1x HBSS e trasferire la soluzione al corrispondente tubo conico 15 mL contenente i pezzi di tessuto.
4. Centrifugare ogni campione per 5 min a 250 x g a 4 gradi centigradi.
5. Preparare il mix di enzimi 1 del kit di dissociazione del tessuto neurale (NTDK; Tabella dei materiali) mescolando 50 l di enzima P con 1900 l di tampone X per campione. Miscela di enzimi caldi 1 a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua. Miscela di enzimi incubazione 1 a 37 gradi centigradi per almeno 10 min prima dell'uso al fine di consentire la piena attivazione dell'enzima.
6. Aspirare il supernatante dal tubo conico da 15 mL e aggiungere 1,95 mL di mix di enzimi 1 ad ogni campione. Vortice delicatamente per assicurarsi che il pellet sia risospeso.
7. Incubare i campioni su una ruota o shaker per 15 min a 37 gradi centigradi.
8. Nel frattempo, preparare il mix enzimatico 2 dell'NTDK mescolando 10 : L di enzima A con 20 : L di tampone Y per campione; pre-riscaldare la soluzione a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua.
9. Alla fine dell'incubazione con mix di enzimi 1, aggiungere 30 gradi di mix di enzimi 2 ad ogni campione.
10. Mescolare delicatamente i campioni convogliando su e giù con una punta di pipetta da 1000 luna pre-risciacquata con 1x HBSS.
11. Incubare il campione su una ruota o shaker per 15 min a 37 gradi centigradi.
12. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 mL di ghiaccio-freddo 1x HBSS per ogni tubo per inattivare il mix enzimatico 1 e mix enzima 2.
13. Centrifugare ogni campione per 10 min a 320 x g a 4 gradi centigradi.
14. Scartare il super-natante; aggiungere ghiaccio freddo 1x HBSS ad ogni tubo fino a un volume finale di 7 mL e respendere delicatamente il pellet vortice.
15. Continuare fino alla sezione 5 per la rimozione dei detriti.

4. omogeneizzazione meccanica del cervello e del midollo spinale

NOTA: I volumi descritti in questa sezione sono sufficienti per l'omogeneizzazione di metà del cervello o del midollo spinale. Il protocollo descritto in questa sezione può essere utilizzato come metodo alternativo a quello descritto nella sezione 3, a seconda delle esigenze dell'utente, come descritto di seguito.

1. Pre-freddo la malta di vetro della smerigliatrice di tessuto Dounce (Tabella dei materiali) impostata sul ghiaccio.
2. Aggiungere 3 mL di HBSS pre-raffreddato alla malta.
3. Trasferire il tessuto (cervello o midollo spinale) dal pozzo della piastra 6-well nel mortaio di vetro assicurandosi che sia immerso in 1x HBSS e si siede nella parte inferiore del mortaio.
4. Distruggere delicatamente il tessuto con 10 colpi di pestello A seguiti da 10 colpi di pestello B. Trasferire il mix omogeneizzato in un nuovo tubo conico da 15 mL.
5. Riempire il tubo fino a un volume finale di 10 mL utilizzando 1x HBSS pre-raffreddato e centrifugare per 10 min a 320 x g a 4 gradi centigradi.
6. Aspirare il supernatante e aggiungere ghiaccio-freddo 1x HBSS per ogni tubo fino a un volume finale di 7 mL e respendere delicatamente il pellet vortice.
7. Continuare fino alla sezione 5 per la rimozione dei detriti.

5. Rimozione dei detriti

NOTA: la rimozione dei detriti, composta principalmente da guaine di tessuto non digerito e mielina, è un passo fondamentale per consentire una colorazione efficiente del tessuto omogeneo per le successive analisi citometriche del flusso.

1. Filtrare ogni campione attraverso un colino cellulare di 70 m per rimuovere qualsiasi pezzo di tessuto non digerito. Questo passaggio è particolarmente importante soprattutto quando si lavora con i tessuti del midollo spinale poiché questi campioni sono più propensi a contenere frammenti nervosi non digeriti o meningi che potrebbero influenzare i passaggi successivi.
2. Assicurarsi che il volume finale sia di 7 mL in ogni tubo campione. In caso contrario, riempire con ghiaccio-freddo 1x HBSS fino a 7 mL.
3. Aggiungere 3 mL di IPS pre-raffreddato ad ogni campione per creare un volume finale di 10 mL di una soluzione contenente un mezzo di sfumatura di densità al 30% di concentrazione finale. Vorticare delicatamente i campioni per assicurarsi che siano mescolati omogeneamente.
4. Campioni di centrifuga per 15 min a 700 x g a 18 gradi centigradi assicurandosi di impostare l'accelerazione della centrifuga su 7 e il freno a 0.
   NOTA: La centrifugazione dovrebbe richiedere circa 30 min.
5. Rimuovere delicatamente i campioni dalla centrifuga.
   NOTA: Un disco biancastro composto da detriti e mielina dovrebbe essere visibile galleggiante sulla superficie della soluzione. Un pellet (contenente le cellule di interesse) dovrebbe essere visibile nella parte inferiore del tubo.
6. Attentamente aspirare tutto il disco biancastro di detriti e poi il resto del supernatante facendo in modo di non spostare il pellet. Lasciare circa 100 l di soluzione sopra il pellet cellulare per evitare il rischio di slovagliarlo inavvertitamente.
7. Aggiungere 1 mL di FACS BL, risospendere il pellet conilando su e giù con una punta di pipetta da 1000 l'l e trasferire i campioni a tubi da 1,5 mL.
8. Centrifuga per 5 min a 450 x g a temperatura ambiente (RT).
9. Aspirare delicatamente il supernatante e sospendere nuovamente il pellet in un buffer appropriato compatibile con le analisi a valle (vedere la sezione 6 per il protocollo utilizzato per la valutazione citometrica del flusso di più tipi di cellule).

6. Colorazione per la valutazione citometrica del flusso di più tipi di cellule

1. Risospendere il pellet ottenuto al punto 5,9 con 350 l di FACS BL. Aggiungere il blocco di fc ad ogni campione ad una concentrazione finale di 5 g/mL.
   NOTA: Per una colorazione, è necessario utilizzare almeno 100 l di l del campione, per assicurarsi di elaborare un numero sufficiente di cellule per consentire analisi affidabili.
2. Incubare il campione per 10 min a 4 gradi centigradi prima di procedere con la colorazione.
3. Preparare una miscela di anticorpi secondo la Tabella 1.
4. Aggiungere la miscela di anticorpi ad ogni tubo, vortice per 5 s e incubare i campioni per 15 min a 4 gradi centigradi al buio.
5. Aggiungere 1 mL di PBS ad ogni tubo, vortice e centrifuga per 5 min a 450 x g a RT.
6. Nel frattempo preparare streptavidin mix secondo la tabella 1.
7. Scartare il supernatante e sospendere nuovamente il pellet nella miscela di streptavidin preparata al passaggio 6.6. Per ogni campione, utilizzare lo stesso volume utilizzato per la colorazione nel passaggio 6.4.
8. Vortice per 5 s e incubare i campioni per 10 min a 4 gradi centigradi al buio.
9. Aggiungere 1 mL di PBS ad ogni tubo, vortice e centrifuga per 5 min a 450 x g a RT.
10. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet in FACS BL. Utilizzare 300 l of FACS BL per ogni 100 l l di campione macchiato.
11. Aggiungere 7-amino-actinomycin D (7-AAD) soluzione per ogni campione. Utilizzare 5 L di 7-AAD per ogni 300 - L di campione preparato nel passaggio 6.10.
12. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi al buio fino all'analisi citofluorimetrica. Eseguire l'analisi entro 16 h dalla preparazione del campione, per garantire >60% di vitalità cellulare.

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Risultati

Abbiamo confrontato due diversi metodi di omogeneizzazione (DH contro PD) applicati al cervello del topo e al midollo spinale, per testare l'efficienza nel recupero di diversi tipi di cellule vitali adatti per applicazioni a valle. Per farlo, abbiamo sfruttato un pannello di citometria a flusso a 9 colori progettato per caratterizzare, nello stesso campione, diversi tipi di cellule SNC tra cui microglia, linfociti, neuroni, astrociti, oligodendrociti ed endotelio.

I tessuti cerebrali e del mid...

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Discussione

Qui descriviamo un protocollo per la co-purificazione e l'analisi citometrica del flusso simultaneo di alcune delle cellule CNS più rilevanti dal cervello del topo e dal midollo spinale. Tradizionalmente, le analisi istologiche sono state applicate per descrivere la distribuzione delle nanoparticelle o l'efficienza di trasduzione dei vettori virali nel CNS^5,13, o per fornire informazioni sui cambiamenti morfologici e molecolari che si verificano in specifici tip...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)	Gibco	14185-052
70 mm Cell Strainer	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugated
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibody	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibody	BD Bioscience	562939	BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibody	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody	Biolegend	202518	PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody	Biolegend	1005325	PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)	CellTreat	229411
Conical Tubes (50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody	BD Pharmingen	553142
Fetal Bovine Serum	Benchmark	100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibody	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotin conjugated
Percoll	GE Healthcare	10266569	sold as not sterile reagent
Percoll	Sigma	65455529	sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	reagent containing very low traces of endotoxin
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugated