Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-Methode, um gleichzeitig verschiedene Zelltypen zu identifizieren, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus abgerufen wurden. Diese Methode könnte genutzt werden, um reine Zellpopulationen bei neurodegenerativen Erkrankungen zu isolieren oder zu charakterisieren oder das Ausmaß der Zellausrichtung bei der In-vivo-Verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Jüngste Fortschritte in den viralen Vektor- und Nanomaterialwissenschaften haben den Weg für neue innovative Ansätze zur Untersuchung oder Manipulation des Zentralnervensystems (ZNS) geebnet. Eine weitere Optimierung dieser Technologien würde jedoch von Methoden profitieren, die eine schnelle und schlanke Bestimmung des Ausmaßes von ZNS und zellspezifischem Targeting bei verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln im Körper ermöglichen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die hohen Durchsatz- und Multiplexing-Fähigkeiten der Durchflusszytometrie nutzt, um eine einfache Quantifizierung verschiedener Zellsubtypen zu ermöglichen, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus isoliert sind, nämlich Mikroglia/Makrophagen, Lymphozyten, Astrozyten, Oligodendrozyten, Neuronen und Endothelzellen. Wir wenden diesen Ansatz an, um kritische Unterschiede zwischen zwei Gewebehomogenisierungsmethoden in Bezug auf Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Zusammensetzung hervorzuheben. Dies könnte den Benutzer anweisen, die beste Methode zu wählen, abhängig von den von Interesse sindden Zelltypen und der spezifischen Anwendung. Diese Methode eignet sich nicht für die Analyse der anatomischen Verteilung, da das Gewebe homogenisiert ist, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Es ermöglicht jedoch die Arbeit mit lebensfähigen Zellen und kann mit zellsortierung kombiniert werden, was den Weg für mehrere Anwendungen öffnet, die das Repertoire an Werkzeugen in den Händen des Neurowissenschaftlers erweitern könnten, von der Etablierung von Primärkulturen aus reinen Zellpopulationen bis hin zu Genexpressionsanalysen und biochemischen oder funktionellen Assays zu gut definierten Zellsubtypen im Kontext neurodegenerativer Erkrankungen, zur pharmakologischen Behandlung oder Gentherapie.

Einleitung

Gen- und Medikamentenabgabetechnologien (wie virale Vektoren und Nanopartikel) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug geworden, das angewendet werden kann, um bessere Einblicke in spezifische molekulare Pfade zu gewinnen, die bei neurodegenerativen Erkrankungen verändert wurden, und für die Entwicklung innovativer therapeutischer Ansätze^1,2,3. Die Optimierung dieser Werkzeuge beruht auf der Quantifizierung von: (1) dem Ausmaß der Penetration im ZNS auf verschiedenen Verabreichungswegen und (2) der Ausrichtung auf bestimmte Zellpopulationen. Histologische Analysen werden in der Regel angewendet, um fluoreszierende Reportergene oder fluoreszierend markierte Nanopartikel in verschiedenen ZNS-Bereichen und über verschiedene Zelltypen hinweg zu visualisieren, die durch Immunfärbung für bestimmte Zellmarker identifiziert werden^4,5. Obwohl dieser Ansatz wertvolle Informationen über die Bioverteilung des verabreichten Gens oder der Instrumente zur Medikamentenabgabe liefert, kann die Technik zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein, da sie Folgendes erfordert: (1) Gewebefixierung, Kryokonservierung oder Paraffineinbettung und Schneiden; (2) Färbung für bestimmte zelluläre Marker, die manchmal Antigen-Retrieval erfordern; (3) Erfassung durch Fluoreszenzmikroskopie, die in der Regel die Analyse einer begrenzten Anzahl verschiedener Marker innerhalb desselben Experiments ermöglicht; (4) Bildverarbeitung, um eine ordnungsgemäße Quantifizierung des Interessensignals zu ermöglichen.

Die Durchflusszytometrie ist zu einer weit verbreiteten Technik geworden, die sehr spezifische Fluoreszenzmarker nutzt, um nicht nur eine schnelle quantitative Auswertung verschiedener Zellphänotypen in Zellsuspensionen zu ermöglichen, basierend auf der Expression von Oberflächen- oder intrazellulären Antigenen, sondern auch funktionelle Messungen (z. B. Apoptoserate, Proliferation, Zellzyklusanalyse usw.). Die physikalische Isolierung von Zellen durch fluoreszierende aktivierte Zellsortierung ist ebenfalls möglich, was weitere nachgelagerte Anwendungen (z.B. Zellkultur, RNAseq, biochemische Analysen usw.) ermöglicht. ^6,7,8.

Die Gewebehomogenisierung ist ein kritischer Schritt, der notwendig ist, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, um zuverlässige und reproduzierbare zytometrische Auswertungen nachdemdurchzuermöglichen. Für die Homogenisierung des Gehirns und des Gehirngewebes wurden verschiedene Methoden beschrieben, hauptsächlich mit dem Ziel, Mikrogliazellen^9,10,11zu isolieren; sie können insgesamt in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden: (1) mechanische Dissoziation, die Schleif- oder Scherkraft durch einen Dounce Homogenisator (DH) verwendet, um Zellen aus ihren Nischen zu reißen und eine relativ homogenisierte Einzelzellsuspension zu bilden, und (2) enzymatische Verdauung, die auf inkubation von hackenden Gewebestücken bei 37 °C in Gegenwart von proteolytischen Enzymen wie Trypsin oder Papain beruht, was den Abbau der extrazellulären Matrix begünstigt, um eine fair homogene^Zellezu erzeugen.

Unabhängig davon, welche Methode verwendet wird, wird nach der Gewebehomogenisierung ein Reinigungsschritt empfohlen, um Myelin durch Zentrifugation auf einem Dichtegradienten oder durch magnetische Selektion^9,12zu entfernen, bevor man zu den nachgeschalteten Anwendungen übergeht.

Hier beschreiben wir ein Gewebeverarbeitungsverfahren auf Basis der Papainverdauung (PD), gefolgt von der Reinigung auf einem Dichtegradienten, optimiert, um lebensfähige heterogene Zellsuspensionen aus dem Maushirn oder Rückenmark zeitempfindlich und für die Durchflusszytometrie geeignet zu erhalten. Darüber hinaus beschreiben wir ein 9-farbene Strömungszytometrie-Panel und die Gating-Strategie, die wir im Labor angenommen haben, um die gleichzeitige Diskriminierung verschiedener ZNS-Populationen, lebender/toter Zellen oder Positivität für fluoreszierende Reporter wie grünes fluoreszierendes Protein oder Rhodaminfarbstoff zu ermöglichen. Durch die Anwendung dieser zytometrischen Durchflussanalyse können wir verschiedene Methoden der Gewebeverarbeitung, d.h. PD versus DH, in Bezug auf die Erhaltung der zellulären Lebensfähigkeit und der Erträge verschiedener Zelltypen vergleichen.

Die Details, die wir hierin angeben, können die Entscheidung über das Homogenisierungsprotokoll und die Antikörperkombination in der Durchflusszytometrie-Platte auf der Grundlage der spezifischen Zelltypen von Interesse und der nachgelagerten Analysen (z. B. temperaturempfindliche Anwendungen, Verfolgung spezifischer Fluoreszenzmarker, In-vitro-Kultur, funktionelle Analysen).

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Dana Farber Cancer Institute (Protokollnummer 16-024) genehmigt.

1. Vorbereitung der für das Experiment erforderlichen Lösungen

1. Bereiten Sie 1x Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) vor, indem Sie 10x HBSS mit sterilem Wasser verdünnen. Die Lösung auf Eis vorkühlen. Für jede Probe werden mindestens 25 ml Lösung benötigt.
2. Bereiten Sie isotonische Percoll-Lösung (IPS) durch Mischen von 10x sterilem HBSS 1:10 mit Dichtegradientenmedium (d.h. Percoll) vor. Vorchill auf Eis.
   HINWEIS: IPS kann bis zu 30 Tage bei 4 °C gelagert werden.
3. Vorbereitung der Durchflusszytometrie (FACS) Blockierung (BL) Lösung (1% Rinderserumalbumin [BSA], 5% fetales Rinderserum [FBS] in phosphatgepufferter Kochsaline [PBS]). Vorchill auf Eis.

2. Tierische Euthanasie durch intrakardiale Perfusion und Gewebesektion

HINWEIS: Acht Wochen alte C57BL/6J-Mäuse, beide Geschlechtsmäuse, wurden in den Experimenten verwendet. Perfusion mit PBS-Lösung wird durchgeführt, um Blutkontamination von Organen zu beseitigen, bevor sie mit der Gewebeverdauung fortfährt.

1. Anästhesisieren Sie die Maus mit einer Mischung aus Ketamin/Xylazin (90 x 200 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg Xylazin). Legen Sie die Maus auf den Rücken und band jede Gliedmaße bis zur Stütze. Überprüfen Sie die angemessene Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Entzugsreflex überprüfen.
2. Machen Sie einen Mittellinien-Hautschnitt auf der Ebene des Brusteinlasses, um das Brustbein freizulegen. Verwenden Sie Zangen, um die Spitze des Brustbeins zu greifen, dann machen Sie einen 1 cm Schnitt auf jeder Seite des Rippenkäfigs. Schließlich durchschneiden Sie das Zwerchfell und öffnen Sie das Brustbein weit genug, um das Herz zu visualisieren.
3. Verwenden Sie Zangen, um das Herz sanft durch den rechten Ventrikel zu greifen und heben Sie es auf die Mittellinie und leicht aus der Brust.
4. Legen Sie eine 23 G Schmetterlingsnadel in die Spitze des linken Ventrikels in Richtung Aorta und halten Sie fest.
5. Starten Sie die Perfusion mit 1x PBS. Pierce durch die rechte Ohrmuschel mit einer Schere, damit die Perfusate den Kreislauf verlassen kann. Stellen Sie den Durchfluss von PBS auf 3 ml/min. Perfuse mit mindestens 15 ml 1x PBS ein, um sicherzustellen, dass das Gewebe frei ist.
   HINWEIS: Blanchieren der Leber und der mesenterischen Blutgefäße sind Anzeichen einer guten Durchblutung. Bei Bedarf kann das Volumen der Vorfusion erhöht werden, bis die Flüssigkeit, die das Herz austritt, blutfrei ist, an deren Stelle die Spüllinie gestoppt werden kann.
6. Nach der Perfusion, trennen Sie das Gehirn vom Rückenmark und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel mit Schere und Zange. Entfernen Sie das Fell, um die Sichtbarkeit und Kontrolle während der Zerlegung zu erhöhen und um das Übertragen von Haarverunreinigungen zu vermeiden. Spülen Sie das Rückenmark aus seiner Säule, indem Sie eine 3 ml Spritze verwenden, die mit PBS gefüllt ist.
7. Übertragen Sie jedes Gewebe in einem Brunnen einer 6-Well-Multi-Well-Platte, die mit 2 ml eiskaltem 1x HBSS vorgefüllt ist, und halten Sie bis zur Verdauung auf Eis.
8. Teilen Sie das Gehirn und das Rückenmark in zwei Hälften, entlang der Längslinie.
   ANMERKUNG: Die Hälfte jedes Gewebes ist homogenisiert (siehe Abschnitte unten), um zytometrische Durchflussanalysen zu ermöglichen; die andere Hälfte kann für alternative Analysen unterschiedlich verarbeitet werden (z.B. in paraformaldehydfixative Lösung für die Histologie getaucht).

3. Enzymatische Verdauung von Gehirn und Rückenmark

HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Volumina reichen für die Verdauung von halb Gehirn oder Rückenmark aus.

1. Verwenden Sie eine Schere, um das Gewebe in 1 x 2 mm dicke Stücke zu zerkleinern.
2. Schneiden Sie die Spitze einer 1000-L-Pipette mit einer Schere, um sie so groß zu machen, dass die Gewebestücke aufgenommen werden können. Die Pipettenspitze mit 1x HBSS vorspülen. Dann verwenden Sie die Pipette, um die 2 ml HBSS-Lösung, die das gehackte Gewebe enthält, in ein 15 ml konisches Rohr zu übertragen.
   HINWEIS: Das Vorspülen der Pipettenspitze ist wichtig, um eine Klebrigkeit der Gewebestücke in der Spitze zu verhindern.
3. Waschen Sie den Brunnen mit zusätzlichen 2 ml eiskaltem 1x HBSS und übertragen Sie die Lösung auf das entsprechende 15 ml konische Rohr, das die Gewebestücke enthält.
4. Zentrifuge jede Probe für 5 min bei 250 x g bei 4 °C.
5. Vorbereiten des Enzymmix1 des Neuronalgewebe-Dissoziationskits (NTDK; Materialtabelle) durch Mischen von 50 l Enzym P mit 1900 l Puffer X pro Probe. Warmes Enzym mix1 bei 37 °C in einem Wasserbad. Inkubat-Enzym-Mix 1 bei 37 °C für mindestens 10 min vor Gebrauch, um die vollständige Aktivierung des Enzyms zu ermöglichen.
6. Aspirieren Sie den Überstand aus dem 15 ml konischen Rohr und fügen Sie 1,95 ml Enzymmischung 1 zu jeder Probe hinzu. Sanft wirbeln, um sicherzustellen, dass das Pellet resuspendiert wird.
7. Die Proben auf einem Rad oder Shaker 15 min bei 37 °C inkubieren.
8. In der Zwischenzeit bereiten Sie Enzymmix 2 des NTDK vor, indem Sie 10 l Enzym A mit 20 l Puffer Y pro Probe mischen; die Lösung bei 37 °C in einem Wasserbad vorwärmen.
9. Am Ende der Inkubation mit Enzymmix 1, fügen Sie 30 l Enzymmischung 2 zu jeder Probe hinzu.
10. Mischen Sie die Proben vorsichtig, indem Sie die Proben vorsichtig nach oben und unten mit einer 1000 l Pipettespitze vorspülen mit 1x HBSS.
11. Die Probe 15 min bei 37 °C auf einem Rad oder Shaker bebrüten.
12. Nach der Inkubation 10 ml eiskalte1x HBSS in jede Röhre geben, um Enzymmix 1 und Enzymmischung 2 zu inaktivieren.
13. Zentrifuge jede Probe für 10 min bei 320 x g bei 4 °C.
14. Entsorgen Sie den Überstand; Bis zu einem Endvolumen von 7 ml eiskalt 1x HBSS zu jeder Röhre geben und das Pellet durch Wirbeln vorsichtig wieder aufhängen.
15. Fahren Sie mit Abschnitt 5 fort, um Denerzufuhr zu machen.

4. Mechanische Homogenisierung von Gehirn und Rückenmark

HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Volumina reichen für die Homogenisierung von halb Hirn oder Rückenmark aus. Das in diesem Abschnitt beschriebene Protokoll kann je nach Benutzerbedarf als Alternative zu dem in Abschnitt 3 beschriebenen Verfahren verwendet werden, wie unten erläutert.

1. Den Glasmörtel der Dounce-Gewebemühle(Stofftabelle) auf Eis stellen vorkühlen.
2. 3 ml vorgekühlter 1x HBSS in den Mörtel geben.
3. Übertragen Sie das Gewebe (Gehirn oder Rückenmark) aus dem Brunnen der 6-Well-Platte in den Glasmörtel, um sicherzustellen, dass es in 1x HBSS getaucht wird und am Boden des Mörsers sitzt.
4. Zerkleinern Sie das Gewebe vorsichtig mit 10 Schlägen Pestle A gefolgt von 10 Schlägen Pestle B. Übertragen Sie die homogenisierte Mischung in ein neues 15 ml konisches Rohr.
5. Füllen Sie das Rohr auf ein Endvolumen von 10 ml, indem Sie vorgekühlte 1x HBSS und Zentrifuge für 10 min bei 320 x g bei 4 °C verwenden.
6. Den Überstand ansaugen und bis zu einem Endvolumen von 7 ml eiskalt 1x HBSS zu jeder Röhre hinzufügen und das Pellet durch Wirbeln vorsichtig wieder aufhängen.
7. Fahren Sie mit Abschnitt 5 fort, um Denerzufuhr zu machen.

5. Trümmerentfernung

ANMERKUNG: Die Entfernung von Schmutz, die hauptsächlich aus unverdautem Gewebe und Myelinscheiden besteht, ist ein entscheidender Schritt, um eine effiziente Färbung des Gewebehomogenats für nachfolgende zytometrische Durchflussanalysen zu ermöglichen.

1. Filtern Sie jede Probe durch ein 70-m-Zellsieb, um unverdaute Gewebestücke zu entfernen. Dieser Schritt ist besonders wichtig, vor allem bei der Arbeit mit Rückenmarksgewebe, da diese Proben eher unverdaute Nervenfragmente oder Hirnmen, die die nachfolgenden Schritte beeinflussen könnten enthalten.
2. Stellen Sie sicher, dass das Endvolumen in jedem Probenröhrchen 7 ml beträgt. Wenn nicht, mit eiskalten 1x HBSS bis zu 7 ml füllen.
3. Fügen Sie jeder Probe 3 ml vorgekühltes IPS hinzu, um ein Endvolumen von 10 ml einer Lösung herzustellen, die ein Dichtegradientenmedium bei einer Endkonzentration von 30 % enthält. Wirbeln Sie die Proben sanft, um sicherzustellen, dass sie homogen gemischt werden.
4. Zentrifugenproben für 15 min bei 700 x g bei 18 °C und stellen sicher, dass die Beschleunigung der Zentrifuge auf 7 und die Bremse auf 0 eingestellt wird.
   HINWEIS: Die Zentrifugation sollte ca. 30 min dauern.
5. Entfernen Sie die Proben zart aus der Zentrifuge.
   HINWEIS: Eine weißliche Scheibe aus Schmutz und Myelin sollte sichtbar auf der Oberfläche der Lösung schwebend sein. Ein Pellet (das die Zellen enthält) sollte an der Unterseite des Rohres sichtbar sein.
6. Sorgfältig ansaugen alle weißlichen Scheibe von Schutt und dann der Rest des Überstandes sicherstellen, dass nicht das Pellet zu vertreiben. Lassen Sie ca. 100 l Lösung auf dem Zellpellet, um das Risiko zu vermeiden, dass es versehentlich abgelassen wird.
7. 1 ml FACS BL hinzufügen, das Pellet durch Pipettieren mit einer 1000-L-Pipettenspitze wieder auf- und abhängen und Proben in 1,5 ml-Rohre übertragen.
8. Zentrifuge für 5 min bei 450 x g bei Raumtemperatur (RT).
9. Befangen Sie den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet in einem geeigneten Puffer wieder aufsetzen, der mit nachgeschalteten Analysen kompatibel ist (siehe Abschnitt 6 für das Protokoll zur zytometrischen Durchflussbewertung mehrerer Zelltypen).

6. Färbung zur zytometrischen Durchflussbewertung mehrerer Zelltypen

1. Setzen Sie das in Schritt 5.9 erhaltene Pellet mit 350 l FACS BL wieder auf. Fügen Sie jeder Probe einen Fc-Block bei einer Endkonzentration von 5 g/ml hinzu.
   ANMERKUNG: Mindestens 100 l der Probe sollten für eine Färbung verwendet werden, um sicherzustellen, dass genügend Zellen verarbeitet werden, um zuverlässige Analysen zu ermöglichen.
2. Inkubieren Sie die Probe 10 min bei 4 °C, bevor Sie mit der Färbung fortfahren.
3. Bereiten Sie eine Antikörpermischung gemäß Tabelle 1vor.
4. Jedem Rohr Antikörpermischung hinzufügen, 5 s Wirbel geben und die Proben 15 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
5. Fügen Sie 1 ml PBS zu jedem Röhrchen, Wirbel und Zentrifuge für 5 min bei 450 x g bei RT hinzu.
6. In der Zwischenzeit vorbereiten Streptavidin Mischung nach Tabelle 1.
7. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in der in Schritt 6.6 zubereiteten Streptavidinmischung wieder auf. Verwenden Sie für jede Probe das gleiche Volumen wie für die Färbung in Schritt 6.4.
8. Wirbel für 5 s und inkubieren Sie die Proben für 10 min bei 4 °C im Dunkeln.
9. Fügen Sie 1 ml PBS zu jedem Röhrchen, Wirbel und Zentrifuge für 5 min bei 450 x g bei RT hinzu.
10. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in FACS BL wieder auf. Verwenden Sie 300 l FACS BL für jede 100 l der gebeizten Probe.
11. Fügen Sie 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) Lösung zu jeder Probe. Verwenden Sie für jede in Schritt 6.10 erstellte Probe 300 l l 7-AAD.
12. Proben bei 4 °C im Dunkeln bis zur zytofluorimetrischen Analyse lagern. Führen Sie die Analyse innerhalb von 16 h ab der Probenvorbereitung durch, um die Zelllebensfähigkeit von >60 % zu gewährleisten.

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Ergebnisse

Wir verglichen zwei verschiedene Homogenisierungsmethoden (DH versus PD), die auf Das Maushirn und Rückenmark angewendet wurden, um die Effizienz beim Abrufen verschiedener lebensfähiger Zelltypen zu testen, die für nachgelagerte Anwendungen geeignet sind. Dazu nutzten wir ein 9-farbiges Flow-Zytometrie-Panel, das verschiedene ZNS-Zelltypen wie Mikroglia, Lymphozyten, Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Endothel charakterisieren soll.

Hirn- und Rückenmarksgewebe wurden von verschied...

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Diskussion

Hierin beschreiben wir ein Protokoll zur Koreinigung und parallelen zytometrischen Analyse von einigen der relevantesten ZNS-Zellen aus Demhirn und Rückenmark. Traditionell wurden histologische Analysen durchgeführt, um die Verteilung von Nanopartikeln oder die Transduktionseffizienz viraler Vektoren im ZNS^5,13zu beschreiben oder Um Erkenntnisse über morphologische und molekulare Veränderungen zu geben, die in bestimmten Zelltypen während einer Pathologie od...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)	Gibco	14185-052
70 mm Cell Strainer	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugated
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibody	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibody	BD Bioscience	562939	BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibody	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody	Biolegend	202518	PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody	Biolegend	1005325	PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)	CellTreat	229411
Conical Tubes (50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody	BD Pharmingen	553142
Fetal Bovine Serum	Benchmark	100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibody	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotin conjugated
Percoll	GE Healthcare	10266569	sold as not sterile reagent
Percoll	Sigma	65455529	sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	reagent containing very low traces of endotoxin
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugated