JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fare beyninden veya omurilikten alınan farklı hücre tiplerini aynı anda belirlemek için bir akış sitometri yöntemi sintometri sitometri sitometri sitometrisi sintometrisi sitometri sintometrisi sintometrisi sintometri Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda saf hücre popülasyonlarını izole etmek veya karakterize etmek veya viral vektörlerin veya nano partiküllerin in vivo uygulamasında hücre hedeflemesinin kapsamını ölçmek için kullanılabilir.

Özet

Viral vektör ve nanomalzeme bilimlerinde son gelişmeler araştırmak veya merkezi sinir sistemi (CNS) işlemek için yeni üstün yaklaşımlar için önünü açmıştır. Ancak, bu teknolojilerin daha fazla optimizasyon cns ve vücutta viral vektörler veya nano tanecikleri uygulanması üzerine hücre özel hedefleme ölçüde hızlı ve aerodinamik belirlenmesine olanak sağlayan yöntemleryararlanacaktır. Burada, fare beyin veya omurilikten izole edilen farklı hücre alt tiplerinin, yani mikroglia/makrofajların, lenfositlerin, astrositlerin, oligodendrositlerin, nöronların ve endotel hücrelerinin basit bir şekilde ölçülmesine olanak sağlamak için akış sitometrisinin yüksek üretim ve çoklama yeteneklerinden yararlanan bir protokol sintometri sitometrisi sitometrisi sitometrisini silyon ile karşılıyoruz. Bu yaklaşımı, hücre verimi, canlılık ve bileşim açısından iki doku homojenizasyon yöntemi arasındaki kritik farklılıkları vurgulamak için uyguluyoruz. Bu, kullanıcıya ilgi çeken hücre türüne ve belirli uygulamaya bağlı olarak en iyi yöntemi seçmesini sağlayabilir. Doku tek hücreli süspansiyon oluşturmak için homojenize olduğundan bu yöntem, anatomik dağılımın analizi için uygun değildir. Ancak, canlı hücrelerle çalışmaya olanak sağlar ve hücre ayrıştırma ile kombine edilebilir, saf hücre popülasyonlarından elde edilen birincil kültürlerin kurulmasından, gen ekspresyonu analizleri ve biyokimyasal veya fonksiyonel analizler nörodejeneratif hastalıklar bağlamında iyi tanımlanmış hücre alt tipleri, üzerine farmakolojik tedavi veya gen tedavisi bağlamında değişen, nörobilimcinin elinde araçların repertuarını genişletebilecek çeşitli uygulamaların önünü açar.

Giriş

Gen ve ilaç dağıtım teknolojileri (viral vektörler ve nano tanecikleri gibi) nörodejeneratif hastalıklarda değiştirilmiş belirli moleküler yollar hakkında daha iyi anlayışlar elde etmek ve yenilikçi terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için uygulanabilir güçlü bir araç haline gelmiştir1,2,3. Bu araçların optimizasyonu, aşağıdakilerin nicelleştirilmesine dayanır: (1) CNS'deki penetrasyonun farklı yönetim yolları üzerindeki nüfuz derecesi ve (2) belirli hücre popülasyonlarının hedeflenmesi. Histolojik analizler genellikle floresan muhabir genleri veya floresan etiketli nano tanecikleri farklı CNS alanlarda ve farklı hücre tipleri arasında görselleştirmek için uygulanır, belirli hücre belirteçleri için immünboyama ile tanımlanan4,5. Bu yaklaşım, uygulanan genin veya ilaç dağıtım araçlarının biyodağıtımı hakkında değerli bilgiler sağlasa da, teknik zaman alıcı ve emek açısından yoğun olabilir: (1) doku fiksasyonu, kriyopreservation veya parafin katıştırma ve dilimleme; (2) bazen antijen alımı gerektiren belirli hücresel belirteçler için boyama; (3) floresan mikroskobu ile edinimi, genellikle aynı deney içinde farklı belirteçleri sınırlı sayıda analizi sağlar; (4) görüntü işleme ilgi sinyalinin doğru niceliksel izin vermek.

Akış sitometrisi, hücre süspansiyonlarında farklı hücre fenotiplerinin sadece yüzey veya hücre içi antijenlerin ekspresyonuna dayalı olarak hızlı bir nicel değerlendirmesine değil, aynı zamanda fonksiyonel ölçümlere (örn. apoptoz oranı, çoğalma, hücre döngüsü analizi vb.) olanak sağlamak için çok özel floresan belirteçlerden yararlanan yaygın olarak kullanılan bir teknik haline gelmiştir. Floresan aktif hücre ayrıştırma yoluyla hücrelerin fiziksel izolasyonu da mümkündür, daha fazla aşağı akım uygulamaları (örneğin, hücre kültürü, RNAseq, biyokimyasal analizler vb) izin 6,7,8.

Doku homojenizasyonu güvenilir ve tekrarlanabilir aşağı akım sitometrik değerlendirmeler sağlamak için tek bir hücre süspansiyon elde etmek için gerekli kritik bir adımdır. Farklı yöntemler yetişkin beyin dokusu homojenizasyonu için tarif edilmiştir, özellikle mikroglia hücreleri izole etmek amacıyla9,10,11; genel olarak iki ana kategoride sınıflandırılabilirler: (1) hücreleri nişlerinden ayırmak ve nispeten homojenleştirilmiş tek hücresüspansiyonu oluşturmak için bir Don homogenizer (DH) ile taşlama veya kesme kuvveti kullanan mekanik ayrışma, ve (2) enzimositsel sindirim, hangi 37 °C'de kin doku parçalarının kuluçka dayanır proteolitik enzimlerin varlığında, tripsin veya papain gibi, oldukça homojenleştirilmiş hücre süspansiyon oluşturmak için ekstrasellüler matris bozulması lehine12.

Hangi yöntemden ne olursa olsun, doku homojenizasyonundan sonra bir yoğunluk gradyan üzerinde santrifüj yoluyla miyelin ilerlediği veya manyetik seçimle 9,12, aşağı akım uygulamalarına geçmeden önce bir arınma adımı önerilir.

Burada, papain sindirimine dayalı bir doku işleme yöntemini (PH) ve ardından, fare beyninden veya omurilikten zamana duyarlı ve akış sitometrisine uygun olarak uygulanabilir heterojen hücre süspansiyonları elde etmek için optimize edilmiş bir yoğunluk gradyan üzerinde saflaştırmayı tanımlıyoruz. Ayrıca, 9 renkli akış sitometri paneli ve farklı CNS popülasyonları, canlı / ölü hücreler veya pozitiflik floresan muhabirler için yeşil floresan protein veya rhodamine boya gibi eşzamanlı ayrımcılık sağlamak için laboratuvarda kabul edilen gating stratejisi açıklar. Bu akış sitometrik analizini uygulayarak, hücresel canlılığın korunması ve farklı hücre tiplerinin verimleri açısından doku işleme yöntemlerini, yani PH ile DH'yi karşılaştırabiliriz.

Burada sağladığımız ayrıntılar, homojenizasyon protokolü ve akış sitometri panelinde kullanılacak antikor kombinasyonu hakkında, belirli hücre tipi(ler) ve akış analizlerine (örn. ısıya duyarlı) dayanarak karar verebilir. uygulamalar, spesifik floresan belirteçlerin takibi, in vitro kültür, fonksiyonel analizler).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Dana Farber Kanser Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 16-024).

1. Deney için gerekli çözümlerin hazırlanması

  1. 10x HBSS'yi steril suyla seyrelterek 1x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın. Çözeltiyi buz üzerinde önceden soğutun. Her numune için en az 25 mL çözelti gereklidir.
  2. 10x steril HBSS 1:10'u yoğunluk gradyan ortamla (yani Percoll) karıştırarak İzotonik Percoll çözeltisini (IPS) hazırlayın. Buzda önceden soğutun.
    NOT: IPS 4 °C'de 30 güne kadar saklanabilir.
  3. Akış sitometrisi (FACS) bloke edici (BL) çözeltisi (%1 sığır serum albumini [BSA], fosfat tamponlu salinde %5 fetal sığır serumu [FBS]' hazırlayın. Buzda önceden soğutun.

2. İntrakardiyak perfüzyon ve doku diseksiyonu ile hayvan ötanazisi

NOT: Deneylerde sekiz haftalık C57BL/6J fareler, her iki cinste de kullanıldı. Doku sindirimine geçmeden önce, organlardan kan kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için PBS solüsyonu ile perfüzyon yapılır.

  1. Ketamin/ksilazin karışımı (90−200 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazine) kullanarak fareyi anestezi edin. Fareyi sırtına yerleştirin ve her uzvunu desteğe bantlayın. Çekilme refleksini kontrol ederek yeterli anestezi derinliğini doğrulayın.
  2. Sternum maruz torasik giriş düzeyinde bir orta hat deri kesi olun. Göğüs kafesinin ucunu kavramak için forceps kullanın, sonra göğüs kafesinin her iki tarafında bir 1 cm kesi yapmak. Son olarak diyaframı kesin ve göğüs kafesini kalbi görselleştirecek kadar geniş bir şekilde açın.
  3. Kalbi sağ ventrikülden yavaşça kavramak ve orta hatta ve göğüsten hafifçe çıkarmak için forseps kullanın.
  4. Sol ventrikülucu ucuna 23 G kelebek iğnesi takın, aort doğru ve sıkıca tutun.
  5. Perfüzyonu 1x PBS ile başlatın. Delmek sağ auricle kullanarak makas kullanarak perfusate dolaşım çıkmak için izin vermek. PBS'nin akış hızını 3 mL/dk olarak ayarlayın.
    NOT: Karaciğer ve mezenterik kan damarlarının beyazlatma iyi perfüzyon belirtileri vardır. Gerekirse, prefüzyon hacmi kalp çıkan sıvı kan temiz, bu noktada floş hattı durdurulabilir kadar artabilir.
  6. Perfüzyon sonra, omurilik beyin kesmek ve makas ve forceps ile kafatasından beyin kaldırın. Diseksiyon sırasında görünürlüğü ve kontrolü artırmak ve saç kirleticileri üzerinde taşımaktan kaçınmak için kürkü çıkarın. PBS ile dolu 3 mL şırınga kullanarak omuriliği kolonunun dışına atın.
  7. Her dokuyu 2 mL buz gibi 1x HBSS ile önceden doldurulmuş 6 kuyuluk çok kuyulu bir tabakta aktarın ve sindirime kadar buzda tutun.
  8. Beyni ve omuriliği uzunlamasına çizgi boyunca ikiye bölün.
    NOT: Her dokunun yarısı homojenize edilerek akış sitometrik analizleri yapılır; diğer yarısı alternatif analizler için farklı işleme atanabilir (örneğin, histoloji için paraformaldehit fiksatif çözeltiye batırılmış).

3. Beyin ve omurilik enzimatik sindirim

NOT: Bu bölümde açıklanan hacimler yarım beyin veya omuriliğin sindirimi için yeterlidir.

  1. 1−2 mm kalınlığında parçalar halinde dokuları kıyma kmak bir çift kullanın.
  2. Doku parçalarının toplanması için yeterince büyük yapmak için makasla 1000 μL pipet ucu kesin. Pipet ucunu 1x HBSS ile önceden durula. Daha sonra kıyma dokusunu içeren 2 mL HBSS çözeltisini 15 mL konik tüpe aktarmak için pipetkullanın.
    NOT: Pipet ucunun önceden durulanması, ucun içindeki doku parçalarının yapışmasını önlemek için önemlidir.
  3. Kuyuyu ilave 2 mL buz gibi 1x HBSS ile yıkayın ve çözeltiyi doku parçalarını içeren ilgili 15 mL konik tüpe aktarın.
  4. 4 °C'de 250 x g'de 5 dk için her numuneyi santrifüj edin.
  5. Nöral doku dissosiyasyon kitinin enzim karışımını hazırlayın (NTDK; Malzeme Tablosu) 50 μL enzimP ile numune başına 1900 μL tampon X karıştırılarak. Sıcak enzim karışımı 1 37 °C bir su banyosunda. İnkübasyon enzimi, enzimin tam aktivasyonuna izin vermek için kullanmadan önce en az 10 dakika boyunca 37 °C'de 1'i karıştırın.
  6. 15 mL konik tüpten süpernatant aspire ve her numuneye 1,95 mL enzim karışımı ekleyin. Peletin yeniden askıya alınmasını sağlamak için yavaşça girdap.
  7. Numuneleri 37 °C'de 15 dakika boyunca bir tekerlek veya çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.
  8. Bu arada, 10 μL'lik A enzimini numune başına 20°L tampon Y ile karıştırarak NTDK'nın 2 enzim karışımını hazırlayın; çözeltiyi 37 °C'de bir su banyosunda ısıtın.
  9. Enzim karışımı 1 ile kuluçka sonunda, her numuneye 30 μL enzim karışımı 2 ekleyin.
  10. 1x HBSS ile önceden durulanmış 1000 μL pipet ucu ile yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak numuneleri hafifçe karıştırın.
  11. Numuneyi 37 °C'de 15 dakika boyunca bir tekerlek veya çalkalayıcı üzerine kuluçkaya yatırın.
  12. Kuluçkadan sonra, enzim karışımı 1 ve enzim karışımı 2 inaktive etmek için her tüpe 10 mL buz gibi 1x HBSS ekleyin.
  13. Her numuneyi 4 °C'de 320 x g'de 10 dk santrifüj edin.
  14. Supernatant atın; her tüpe 7 mL'lik son bir hacme kadar buz gibi 1x HBSS ekleyin ve girdap yaparak peleti yavaşça yeniden askıya alın.
  15. Enkaz kaldırma için bölüm 5 devam edin.

4. Beyin ve omuriliğin mekanik homojenizasyonu

NOT: Bu bölümde açıklanan hacimler, bir-yarım beyin veya omuriliğin homojenizasyonu için yeterlidir. Bu bölümde açıklanan protokol, aşağıda açıklandığı gibi kullanıcı ihtiyacına bağlı olarak bölüm 3'te açıklananyöntem alternatifi olarak kullanılabilir.

  1. Önceden dounce doku öğütücü cam harç soğutun(Tablo Malzemeler) buz üzerine ayarlanmış.
  2. Harcın üzerine 3 mL önceden soğutulmuş 1x HBSS ekleyin.
  3. 6 kuyulu plakanın kuyularından 1x HBSS'ye batırılır ve harcın altına oturur emin olmak için dokuyu (beyin veya omurilik) cam harç içine aktarın.
  4. 10 vuruşla dokuyu a tam 10 vuruşla hafifçe parçalayın ve ardından 10 vuruş la havaneli B. Homojenize karışımı yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın.
  5. 4 °C'de 320 x g'de 10 dk önceden soğutulmuş 1x HBSS ve santrifüj kullanarak tüpü 10 mL'lik son bir hacme doldurun.
  6. Supernatant aspirate ve 7 mL son bir hacme kadar her tüp buz gibi 1x HBSS ekleyin ve yavaşça girdap tarafından pelet askıya.
  7. Enkaz kaldırma için bölüm 5 devam edin.

5. Enkaz kaldırma

NOT: Çoğunlukla sindirilmemiş doku ve miyelin kılıflarından oluşan enkazların çıkarılması, sonraki akış sitometrik analizleri için homojen dokunun verimli bir şekilde boyanmasını sağlamak için kritik bir adımdır.

  1. Sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için her numuneyi 70 μm'lik bir hücre süzgecine süzün. Bu örnekler daha sonraki adımları etkileyebilecek sindirilmemiş sinir parçaları veya menenjler içerme olasılığı daha yüksek olduğundan bu adım özellikle omurilik dokuları ile çalışırken önemlidir.
  2. Her numune tüpünde son hacmin 7 mL olduğundan emin olun. Aksi takdirde, 7 mL'ye kadar buz gibi 1x HBSS ile doldurun.
  3. %30 son konsantrasyonda yoğunluk gradyan ortam içeren bir çözeltinin 10 mL'lik son hacmini yapmak için her numuneye 3 mL önceden soğutulmuş IPS ekleyin. Homojen bir şekilde karıştırıldığından emin olmak için numuneleri yavaşça girdaplayın.
  4. 18 °C'de 700 x g'da 15 dk'lık santrifüj numuneleri, santrifüjün ivmesini 7'ye, frenin ise 0'a ayarladığından emin olun.
    NOT: Santrifüj yaklaşık 30 dakika sürmelidir.
  5. Numuneleri santrifüjden hassas bir şekilde çıkarın.
    NOT: Enkaz ve miyelinden oluşan beyazımsı bir disk çözeltinin yüzeyinde görünür olmalıdır. Bir pelet (ilgi hücreleri içeren) tüpün alt kısmında görünür olmalıdır.
  6. Dikkatlice enkaz tüm beyazımsı disk aspire ve sonra supernatant geri kalanı pelet yerinden değil emin olun. Yanlışlıkla çıkarma riskini önlemek için hücre peletinin üzerine yaklaşık 100 μL çözelti bırakın.
  7. 1 mL FACS BL ekleyin, 1000 μL pipet ucu ile yukarı ve aşağı borular ile pelet yeniden askıya ve 1,5 mL tüpler için örnekleri aktarın.
  8. Oda sıcaklığında 450 x g 5 dakika santrifüj (RT).
  9. Süpernatant'ı yavaşça aspire edin ve peleti akış aşağı analizleriyle uyumlu uygun arabellekte yeniden askıya alın (birden fazla hücre tipinin akış sitometrik değerlendirilmesi için kullanılan protokol için bölüm 6'ya bakın).

6. Birden fazla hücre tiplerinin akış sitometrik değerlendirilmesi için boyama

  1. Adım 5.9'da elde edilen pele'yi 350 μL FACS BL ile yeniden askıya alın.
    NOT: Güvenilir analizlere izin verecek kadar hücre nin işlendiğinden emin olmak için bir boyama için numunenin en az 100 μL'si kullanılmalıdır.
  2. Boyama işlemine geçmeden önce numuneyi 4 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
  3. Tablo 1'egöre antikor karışımı hazırlayın.
  4. Her tüpe antikor karışımı, 5 s'lik girdap ekleyin ve numuneleri karanlıkta 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. RT'de 450 x g'da 5 dk'lık her tüp, girdap ve santrifüjiçin 1 mL PBS ekleyin.
  6. Bu arada Tablo 1göre streptavidin karışımı hazırlamak .
  7. Supernatant atın ve adım 6.6 hazırlanan streptavidin karışımı pelet resuspend. Her numune için, 6.4 adımda boyama için kullanılan hacimle aynı hacmi kullanın.
  8. 5 s için girdap ve karanlıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca örnekleri inkübetmek.
  9. RT'de 450 x g'da 5 dk'lık her tüp, girdap ve santrifüjiçin 1 mL PBS ekleyin.
  10. Supernatant atın ve FACS BL pelet resuspend. Lekeli numune her 100 μL için 300 μL FACS BL kullanın.
  11. Her numuneye 7-amino-aktilosisin D (7-AAD) çözeltisi ekleyin. Adım 6.10'da hazırlanan her 300 μL numune için 5 μL 7-AAD kullanın.
  12. Örnekleri 4 °C'de sitoflorimetrik analize kadar karanlıkta saklayın. Analizin numune hazırlanmasından 16 saat içinde ,%gt;%60 hücre canlılığını garanti etmek için gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Fare beynine ve omuriliğe uygulanan iki farklı homojenizasyon yöntemini (DH karşı PD) karşılaştırdık ve downstream uygulamalarına uygun farklı canlı hücre tiplerinin alınmasında verimliliği test ettik. Bunu yapmak için, aynı örnekte, mikroglia, lenfositler, nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve endotel dahil olmak üzere farklı CNS hücre tiplerini karakterize etmek için tasarlanmış 9 renkli akış sitometri panelinden yararlandık.

Beyin ve omurilik dokuları fa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada fare beyni ve omurilikten en alakalı CNS hücrelerinin eş saflaştırma ve eşzamanlı akış sitometrik analizi için bir protokol açıklıyoruz. Geleneksel olarak, histolojik analizler nano tanecikleri dağılımı veya CNS viral vektörlerin transdüksiyon verimliliği tanımlamak için uygulanmıştır5,13, veya bir patoloji sırasında veya farmakolojik tedavi üzerine belirli hücre tiplerinde meydana gelen morfolojik ve moleküler değişiklikler...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Boston Çocuk Hastanesi start-up fonları a.b., ALSA hibe nr tarafından finanse edilmiştir. 17-IIP-343 M.P., ve Ödül No altında Aminotrofik Lateral Skleroz Araştırma Programı ile Sağlık İşleri Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi. W81XWH-17-1-0036'dan M.P.'ye. Teknik destek için DFCI Flow Cytometry Core'u kabul ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)Gibco14185-052
70 mm Cell StrainerCorning431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibodyMiltenyi Biotec130-117-535APC conjugated
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibodyInvitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibodyBD Bioscience562939BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibodyBiolegend103138Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibodyBiolegend202518PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibodyBiolegend1005325PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)CellTreat229411
Conical Tubes (50 mL)CellTreat229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibodyBD Pharmingen553142
Fetal Bovine SerumBenchmark100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibodyMiltenyi Biotec130-095-895Biotin conjugated
PercollGE Healthcare10266569sold as not sterile reagent
PercollSigma65455529sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01reagent containing very low traces of endotoxin
StreptavidinInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 conjugated

Referanslar

  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371(2019).
  3. Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67(2019).
  4. Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272(2016).
  5. Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
  6. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  7. Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
  8. Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
  9. Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
  10. Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
  11. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635(2012).
  12. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
  13. Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
  14. Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
  15. Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
  16. Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
  17. Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 153ak sitometrisifare beynifare omurili idoku homojenizasyonumikrogliaastrositleroligodendrositlerendoteln ronlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır