Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، ونحن نصف شرط النمو لثقافة البديل مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa. كما وصفنا طريقتين منفصلتين للكشف عن الجينات الثيوبولية الهاريادية المنتَجة التي تنتجها P. aeruginosa وكمية الجينات التي تنتجها P. aeruginosa باستخدام مقادير حمض البوليازول التقليدي ة وجسم مضاد أحادي النسيلة (mAb) قائم على ELISA.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa، وهو عامل ممرض البكتيرية سلبية الغرام الانتهازية ، يمكن أن تنتج الإفراط في الجينات exopolysaccharide مما أدى إلى نمط ظاهري فريد يسمى المخاطية. يرتبط Alginate بالتهابات الرئة المزمنة مما يؤدي إلى سوء التكهن في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF). يمكن أن يساعد فهم المسارات التي تنظم إنتاج الجينات في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة تستهدف تكوين الجينات. نمط ظاهري آخر مرتبط بالمرض هو متغير المستعمرة الصغيرة (SCV). SCV يرجع ذلك إلى بطء نمو البكتيريا وغالبا ما يرتبط مع زيادة المقاومة لمضادات الميكروبات. في هذه الورقة، نظهر أولا طريقة لزراعة شكل محدد وراثيا من P. aeruginosa SCV بسبب الطفرات البيريميدين الحيوي. مكملات من القواعد النيتروجينية، أوراسيل أو السيتوزين، يعيد النمو الطبيعي لهذه المسوخ، مما يدل على وجود مسار الإنقاذ الذي يمسح القواعد الحرة من البيئة. بعد ذلك ، نناقش طريقتين لقياس الجينات البكتيري. وتعتمد الطريقة الأولى على التحلل المائي للسكاريد المتعدد السكاريد إلى مونومر حمض البولينيك متبوعاً بالاشتقاق باستخدام كاشف لوني، وهو الركلازول، في حين تستخدم الطريقة الثانية مادة ELISA على أساس mAb المتاحة تجارياً والمحددة بالجينات. تتطلب كلتا الطريقتين منحنى قياسي للكمية. كما نُظهر أن الطريقة المناعية محددة للقياس الكمي للجينات ويمكن استخدامها لقياس الجينات في العينات السريرية.

Introduction

التهابات الرئة المزمنة مع Pseudomonas aeruginosa هي سبب رئيسي للمراضة والوفيات في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF). خلال مرحلة الطفولة المبكرة ، يتم استعمار المرضى من قبل مسببات الأمراض البكتيرية المتعددة بما في ذلك عزل nonmucoid P. aeruginosa1،2. ظهور البديل مستعمرة صغيرة (SCV) يعزل وكذلك عزل المخاطية هو علامة لبداية للالتهابات المزمنة. عزلات SCV هي مقاومة للأدوية عالية3 بسبب معدلات نموها البطيء4، مما يجعلها رادعا شديدا في أفواج العلاج وغيرها من الالتهابات المزمنة5 من قبل P. aeruginosa. وأظهر العمل الذي قام به الأحمر وآخرون6 وجود صلة بين SCV والفيويدي الذي يربطه التمثيل الحيوي دي نوفو بيريميدين. البيريميدين المجاعة، بسبب الطفرات في الجينات المشاركة في إنتاج البيريميدين، أدى إلى النمط الظاهري SCV في سلالة المرجع nonmucoid PAO1 ومشتق مخاطي، PAO581 (PAO1mucA25).

على الرغم من أن الإفراط في إنتاج الجينات هو علامة مرض مهمة لالتهابات الرئة المزمنة في CF ، إلا أنه ليس من الواضح ما إذا كان هناك ارتباط مباشر بين كمية الجينات وأمراض الرئة ، ومن غير الواضح ما إذا كان يمكن استخدام الجينات كعلامة تشخيص للعلاج7. وينظم أساسا إنتاج الجينات من قبل اثنين من operons، وoperon التنظيمية(algumucABCD)8،9 وoperon الاصطناعية الحيوية(algD operon)10،11. وينظم بإحكام إنتاج الجينات من قبل عامل سيغما AlgU9،12 (المعروف أيضا باسم AlgT) وتدهور عامل مكافحة سيغما MucA13. القدرة على رصد إنتاج الجينات في الموقع من عينات البلغم المرضى يمكن أن تساعد في تطوير خيارات علاجية جديدة.

هنا، ونحن نصف حالة النمو الذي يكشف عن وجود SCV الناجمة عن المسوخ التي لا يمكن توليف البيريميدين دي نوفو. مكملات الأوراسيل و / أو السيتوزين ، قاعدة النيتروجين من النيوكليوتيد البيريميدين ، إلى المتوسط ينشط مسار الإنقاذ ، وبالتالي استعادة النمو الطبيعي في المسوخ. ويمكن استخدام طريقة النمو هذه لمسوخ SCV محددة هذه كوسيلة فحص لتحديد الطفرات البيريميدين في عينات المرضى. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش طريقتين للكشف عن وقياس الجينات التي تنتجها ويفرزها P. aeruginosa. الأول هو الطريقة التقليدية14،15،16 من تحلل السكريات باستخدام تركيز عال من الحمض ثم إضافة مؤشر قياس الألوان إلى كمية التركيز في العينة. الطريقة الثانية، التي تم تطويرها في مختبرنا، تستخدم الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة (mAb) تم تطويره بواسطة QED Biosciences. تثبت طريقة ELISA أنها أكثر تحديدًا وحساسية من مُقازحمض البوليتيك وتسمح باستخدام أكثر أمانًا بسبب تجنب حمض الكبريتيك عالي التركيز. مع قدرة ELISA لاستخدامها مباشرة على عينات البلغم المريض لقياس الجينات، يمكن تطويره كأداة تشخيصية رصد لمتابعة كمية الجينات الموجودة في الرئتين في فترات مختلفة من العدوى.

Protocol

1. SCV ظروف النمو والتنشيط الفسيولوجي لمسار الإنقاذ

  1. الكشف عن SCV.
    1. المتتالية P. aeruginosa سلالات PAO1, PAO1ΟpyrD,PAO581, وPAO581ΟpyrD على لوحات العزل ة الزائفة prewarmed (PIA) وتنمو في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. على لوحة النمو حدد عزل مستعمرة واحدة يحتوي على النمط الظاهري SCV (حجم المستعمرة من 1-3 مم بدلاً من حجم المستعمرة العادي 3-5 مم).
    2. كرر الخطوة 1.1.1 للحصول على عزل نقي من SCV.
      ملاحظة: قد يتطلب النمو ما يصل إلى 72 ساعة بسبب بطء معدل النمو في مستعمرات SCV.
  2. التنشيط الفسيولوجي لمسار الإنقاذ.
    1. باستخدام حلقة تلقيح معقمة، اختر مستعمرة SCV من لوحة PIA وسلسلة على PIA مُدفأة مُكمّلة بـ 0.1 م. م. م. أوراسيل. تنمو لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
      ملاحظة: تحتوي جميع لوحات PIA المستخدمة في هذا البروتوكول على 20 مل/لتر من الجلسرين المضافة إلى الخليط قبل التعقيم. بعد التعقيم وبعد درجة حرارة الخليط أقل من 55 درجة مئوية إضافة 11.21 ملغ / لتر من uracil (0.1 mm) إلى وسائل الإعلام السائلة قبل صب لوحات. من شأن هذه الطريقة أن تساعد في تحديد الطفرات البيريميدين التي تسبب النمط الظاهري SCV في P. aeruginosa. إذا كان النمط الظاهري SCV هو نتيجة للطفرة المذكورة، ثم نمو المستعمرة الطبيعية وحجمها (3-5 ملم) لوحظ على لوحات PIA مكملة uracil. إذا كان للسلالات القدرة على إنتاج الجينات ، فإن النمط الظاهري المخاطي سيعود أيضًا عند مكملات الأوراسيل.

2. حمض أورونيتش أسياكول

  1. من ثقافة نقية من سلالة المطلوب أن يتم اختبارها، وتحديد مستعمرة واحدة. باستخدام مسواك معقمة، واختيار مستعمرة، ووضع المسواك في أنبوب اختبار الثقافة التي تحتوي على 5 مل من مرق العزل Pseudomonas (PIB). تنمو في حاضنة شاكر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: نمت السلالات التالية PAO581 (PAO1mucA25)،PAO581carA،PAO581carB،وPAO581pyrD على لوحات PIA أو لوحات PIA المكملة مع 0.1 m uracil لحصاد الجينات للقياس.
  2. على لوحة PIA الدامدة إضافة 150 ميكرولتر من مرق PIB المستزرع (للوحات 15 ملم × 100 مم) أو 450 ميكرولتر من مرق (للوحات 15 ملم × 150 ملم). باستخدام موزع خلية معقمة، ونشر مرق على لوحة. تنمو لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: يستنشق أي سائل زائد، إن وجد، من اللوحة باستخدام أنبوب عن طريق ترجيح اللوحة إلى جانب واحد. تحتوي كل من لوحات PIB و PIA المستخدمة في البروتوكول على 20 مل/لتر من الجلسرين لاستخدامها من قبل الخلايا كمصدر للكربون للمساعدة في إنتاج الجينات.
  3. باستخدام وحدة تحكم ماصة و50 مل معقمة ماصة، إضافة 0.85٪ NaCl إلى الحديقة نمت وجمع عينة عن طريق تخريد لوحة باستخدام موزع الخلية. اسشق العينة باستخدام أنبوب جديد 50 مل في أنبوب جمع 50 مل. دوامة العينة على ارتفاع لخلط ووضع العينات على الجليد.
    ملاحظة: يختلف حجم NCl المضافة 0.85% حسب حجم اللوحة. بالنسبة للألواح مقاس 15 مم × 100 مم، استخدم 10−30 مل، وبالنسبة للوحات 15 مم × 150 مم، استخدم 20−50 مل.
  4. قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600)من العينات عن طريق إضافة 1 مل من العينة إلى كوفيت المتاح وقراءة OD باستخدام مطياف. كرر هذه الخطوة 2x للحصول على ثلاثية من يقرأ لكل عينة.
  5. إضافة 3 مل من حمض الكبريتيك / محلول بورات في أنابيب الثقافة والسماح للالجلوس على الجليد. إضافة 350 ميكرولتر من العينة التي تم جمعها ببطء إلى مزيج حمض في أنابيب الاختبار والدوامة على انخفاض لفترة وجيزة.
    1. إعداد مخزون البورات عن طريق إضافة 10.099 غرام من مسحوق هيدروكسيد البوتاسيوم (كوه) إلى 45 مل من الماء. إضافة 24.74 غرام من حمض البوريك (H3BO3)إلى الخليط وجلب حجم إلى 100 مل.
    2. مكان زجاجة 1 لتر في بالوعة مع الجليد وزجاجة ملء مع 500 مل من حمض الكبريتيك المركزة. إضافة ببطء 15 مل من الأسهم بورات المعدة. السماح زجاجة لتبرد.
    3. إضافة 10 مل أخرى من مخزون بورات لما مجموعه 25 مل. مرة واحدة يتم تبريد زجاجة، وبذلك حجم إلى 1 لتر.
      تنبيه: تعتمد هذه الطريقة على استخدام حمض الكبريتيك عالي التركيز. وينبغي استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة لضمان السلامة وينبغي اتباع بروتوكول التخلص السليم من العينة.
      ملاحظة: للسيطرة الإيجابية تركيز معروف من حمض D-mannuronic و / أو عينات الجينات البكتيرية المعروفة حصادها وتنقيتها من خلال الجينات إنتاج سلالات P. aeruginosa (على سبيل المثال: PAO581-PAO1mucA25). للتحكم السلبي استخدام 0.85% حل NaCl و/أو PAO1ΟalgD (حذف في إطار الجين algD الذي يجعل البكتيريا غير قادرة تماما على إنتاج alginate). يمكن إجراء أنابيب متعددة من كل عينة لزيادة عدد التكرارات التقنية للمساعدة في التحليل الإحصائي. إعداد 3-5 أنابيب من كل عينة.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من 0.1٪ carbazole في محلول الإيثانول إلى مزيج حمض / عينة. كاب الأنبوب والدوامة على الإعداد المتوسط لمدة 5 s. ضع في حمام جاف في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  7. بعد الحضانة، وإزالة الأنابيب والدوامة لفترة وجيزة على ارتفاع والسماح لتبرد لمدة 5 دقيقة.
    ملاحظة: اللون الذي يجب رؤيته سيكون ظلاً أرجوانياً. سيبقى اللون مستقراً للقياس لـ 1−2 ساعة.
  8. قراءة OD530 من كل أنبوب عن طريق إضافة 1 مل من الخليط إلى كوفيت نظيفة وقراءة OD من العينات في 530 نانومتر على مطياف. استخدام أنبوب مع 0.85٪ NaCl كفارغة إلى الطيف الضوئي.
  9. إعداد منحنى قياسي عن طريق قياس OD530 من التخفيفات التسلسلية للتركيزات المعروفة لحمض D-Mannuronic (1,024 ميكروغرام/مل، 512 ميكروغرام/مل، 256 ميكروغرام/مل، 128 ميكروغرام/مل، 64 ميكروغرام/مل، 32 ميكروغرام/مل، 16 ميكروغرام/مل، و8 ميكروغرام/مل. كرر 2x. استخراج معادلة خطية من هذه القراءات.
    ملاحظة: يجب أن يتم المنحنى القياسي مرة واحدة فقط. ويمكن استخدام المعادلة الخطية المستخرجة منه للاختبار في وقت لاحق.
    1. حساب تركيز الجينات في كل عينة باستخدام منحنى قياسي وتقسيم تركيز الجينات من المعادلة الخطية من قبلOD 600 للحصول على المبلغ الإجمالي للألجينات لكل OD600.

3. ELISA لكمية الجينات

  1. كرر الخطوات 2.1−2.4 للحصول على عينات لقياس الجينات.
    ملاحظة: كانت سلالات المستخدمة PAO1، PAO1ΟalgD،وPAO1 تحمل pHERD20T-algU.
  2. باستخدام ميكروبيبيت إضافة 50 ميكرولتر من العينة التي تم جمعها إلى لوحة 96-جيدا غير المعالجة. أضف 50 ميكرولتر من حاجز الطلاء (كربونات/بيكربونات درجة الحموضة العازلة 9.6) إلى الآبار. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: للتحكم الإيجابي، يمكن استخدام تركيز معروف لحمض D-Mannuronic و/أو سلالة حمض الجينات المستقرة المعروفة (على سبيل المثال: PAO581-PAO1mucA25). لاستخدام التحكم السلبي 0.85٪ حل NaCl و / أو PAO1ΟalgD (الحذف في الإطار من الجين algD يجعل البكتيريا غير قادرة تماما على إنتاج أي الجينات). ويمكن صنع آبار متعددة من كل عينة لزيادة عدد التكرارات التقنية للمساعدة في التحليل الإحصائي. إعداد 3-5 آبار من كل عينة.
  3. باستخدام زجاجة بخ، وغسل الآبار لوحة 2x مع 1x الفوسفات الحاجز المالحة (PBS) مع 0.05٪ Tween 20 (PBS-T) عن طريق ملء الآبار، ومن ثم استنزاف لهم عن طريق التقليب أكثر من لوحة.
  4. باستخدام micropipette إضافة 200 ميكرولتر من كتلة عازلة (10٪ الحليب الخالي من الدسم في PBS-T) إلى الآبار. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: التفاف لوحة في فيلم البارافين أو يتقلص التفاف للمساعدة في تجنب أي تبخر في الثلاجة.
  5. باستخدام زجاجة بخ غسل الآبار لوحة 2x مع PBS-T عن طريق ملء الآبار، ومن ثم استنزاف لهم عن طريق التقليب أكثر من لوحة.
  6. باستخدام ميكروبيبيت إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة (الماوس المضادة للألجينات الأجسام المضادة أحادية النسيلة) إلى الآبار واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
    ملاحظة: تم توفير الأجسام المضادة الأولية (الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للفأرة المضادة للجينات) بتركيز 0.5 ميكروغرام/مل (تخفيف 1:2000 من 1 ملغم/مل من المخزون) في محلول الأجسام المضادة المخففة (1٪ من الحليب الخالي من الدسم في 1x PBS).
  7. باستخدام زجاجة بخ غسل الآبار لوحة 3x مع PBS-T عن طريق ملء الآبار، ومن ثم استنزاف لهم عن طريق التقليب أكثر من لوحة.
  8. باستخدام ميكروبيبيت إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى الآبار واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة كانت بيرس الماعز المضادة للفأرة بولي HRP إلى تركيز 0.25 ميكروغرام/مل (تخفيف 1:2000 من 0.5 ملغم/مل الأسهم) في محلول الأجسام المضادة المخفف.
  9. باستخدام زجاجة بخ غسل الآبار لوحة 3x مع PBS-T عن طريق ملء الآبار، ومن ثم استنزاف لهم عن طريق التقليب أكثر من لوحة.
  10. باستخدام ميكروبيبيت، إضافة 100 ميكرولتر من محلول TMB-ELISA(جدول المواد)واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    ملاحظة: لون رد فعل إيجابي سيكون ظل الأزرق.
  11. باستخدام ميكروبيبيت، إضافة 100 ميكرولتر من محلول التوقف (2 حمض الكبريتيك N).
    ملاحظة: سيتحول اللون من الأزرق إلى الأصفر عند إضافة حل الإيقاف. اللون مستقر لمدة تصل إلى 30 دقيقة بعد إيقاف التفاعل.
  12. باستخدام قارئ لوحة، وقراءة OD في 450 نانومتر.
  13. إنتاج منحنى قياسي عن طريق قياس OD450 من التخفيفات التسلسلية للتركيزات المعروفة لحمض D-Mannuronic (1,024 ميكروغرام/مل، 512 ميكروغرام/مل، 256 ميكروغرام/مل، 128 ميكروغرام/مل، 64 ميكروغرام/مل، 32 ميكروغرام/مل، 16 ميكروغرام/مل، و8 ميكروغرام/مل. كرر 2x. من هذه القراءات استخراج معادلة خطية.
    ملاحظة: يجب أن يتم المنحنى القياسي مرة واحدة فقط. ويمكن استخدام المعادلة الخطية المستخرجة منه للاختبار في وقت لاحق.
    1. حساب تركيز الجينات في كل عينة باستخدام منحنى قياسي وتقسيم تركيز الجينات من المعادلة الخطية من قبلOD 600 للحصول على المبلغ الإجمالي للألجينات لكل OD600.

4- التحليل الإحصائي لقياس الجينات

  1. في ورقة برامج رسومية، قم بتعيين عمود مع المعادلة الخطية المشتقة من المنحنى القياسي. تعيين نتائج المحور ص كتركيز الجينات ونتائج المحور س كـ OD530 لحمض البوليتيكو450 لELISA للحصول على تركيزات الجينات في كل عينة.
  2. لتطبيع كمية الجينات في كل عينة إلى المبلغ لكل 5.5 × 108 CFU /mL (1 OD600)،قم بتقسيم تركيز كل عينة تم الحصول عليها أعلاه حسب قيمة OD600 الخاصة بها. إذا تم قياس OD600 متعددة لكل عينة، قسمة على متوسط OD600.
  3. إجراء تحليل إحصائي باستخدام البرامج الإحصائية المفضلة (على سبيل المثال، GraphPad Prism 7.02).
  4. افتح البرنامج. اختر العمود تحت الجدول الجديد والرسم البياني واختر مجموعة بيانات ANOVA أحادية الاتجاه.
  5. اسم كل عمود مع سلالة اختباروإضافة تركيزات الجينات تحت.
  6. بعد إدخال جميع البيانات انقر على تحليل في القائمة العلوية. سيؤدي ذلك إلى فتح إطار إعدادات التحليل. اختر المعلمات المناسبة للاختبار والإشارة إلى ما إذا كانت هناك حاجة إلى إجراء أية مقارنات متعددة.
    ملاحظة: بعد التحليل ستحتوي مجموعة البيانات على قيمة p التي من شأنها أن تساعد في تحديد الأهمية الإحصائية للبيانات. تعتبر البيانات ذات دلالة إحصائية إذا كانت قيمة p أقل من قيمة α المجموعة (عادة يتم تعيين قيمة α لـ p < 0.01).
  7. ضمن علامة التبويب الرسم البياني اختر نوع الرسم البياني الشريطي. سيؤدي ذلك إلى تخطيط البيانات تلقائيًا باستخدام العنوان المشار له من ورقة بيانات الإدخال. الإشارة إلى الأهمية الإحصائية للبيانات حسب الحاجة من خلال إظهار الرمز * فوق الخطوط الضامة بين أشرطة الاهتمام.

النتائج

يوضح الشكل 1 لوحات PAO1 و PAO581 مع أو بدون حذف في الإطار في الجين الحراري (جين في مسار التخليق الحيوي البيريميدين) الذي ينتج عنه SCV6. تم استعادة متحولة PAO1 SCV إلى النمو الطبيعي استجابة لمكملات uracil(الشكل 1A, B). وعلاوة على ذل...

Discussion

كل من SCV وalginate هي علامات المرض الهامة المتورطة في العديد من الالتهابات المزمنة. ولذلك، فإن القدرة على زراعة SCV وكذلك دراسة تنظيم وإنتاج الجينات من قبل P. aeruginosa هو جزء لا يتجزأ من اكتشاف علاجات جديدة لهذه الأمراض المزمنة.

سلالات SCV من الصعب المعروف أن تنمو بسبب معدل نموها ا...

Disclosures

المؤلف هونغوي د. يو هو كبير موظفي العلوم والمؤسس المشارك لشركة Progenesis Technologies, LLC.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) المنح R44GM113545 وP20GM103434.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Step Ultra TMB-ELISAThermo Scientific34028via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)Fisher ScientificBP2818-4Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry BathLabnetNC0205808via Fisher Scientific
Assay Plates 96-wellCoStar2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2Scientific IndustriesG560
Boric AcidResearch Products International Corp.10043-35-3
Cabinet IncubatorVWR1540
CarbazoleSigmaC-5132
Carbonate-Bicarbonate BufferSigmaC3041
Centrifuge Tubes (50 ml)Fisher Scientific05-539-13via Fisher Scientific
Culture Test TubesFisher Scientific14-956-6Dvia Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 ml)Fisher Scientific14955127via Fisher Scientific
CytosineAcros Organics71-30-7
Diposable Inoculation LoopsFisher Scientific22-363-597
D-Mannuronic Acid SodiumSigma AldrichSMB00280
FMC AlginateFMC2133
GlycerolFisher ScientificBP906-5For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal AntibodyQED BiosciencesN/ALot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)SigmaP3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP AntibodyThermo Scientific32230via Fisher Scientific
Potassium HydroxideFisher Scientific1310-58-3via Fisher Scientific
Prism 7GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)Difco292710via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB)Alpha BiosciencesP16-115via Fisher Scientific
Round ToothpicksDiamondAny brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133)FMC Corporation
Skim MilkDifco232100via Fisher Scientific
SmartSpec Plus SpectrophotometerBioRad170-2525or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl)SigmaS-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate ReaderMolecular Devicesi3xor preferred vendor
Sterile Petri Dish 100mm x 15mmFisher ScientificFB0875713via Fisher Scientific
Sulfuric AcidFisher ScientificA298-212Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)R&D SystemsDY994
Tween 20SigmaP2287
UracilAcros Organics66-22-8

References

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
  2. Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
  3. Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
  4. Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
  5. Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
  6. Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
  7. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
  8. Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
  9. Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
  10. Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
  11. Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
  12. Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
  13. Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
  14. Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
  15. Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
  16. Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156 Pseudomonas aeruginosa CF SCV mAb alginate ELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved