Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, um die kleine Kolonievariante von Pseudomonas aeruginosazu kulturen. Wir beschreiben auch zwei separate Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung des von P. aeruginosa hergestellten Exopolysaccharidalginats mit einem traditionellen Uronsäure-Carbazol-Assay und einem alginatspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) basierenden ELISA.

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa, ein opportunistischer gramnegativer bakterieller Erreger, kann ein Exopolysaccharidalginat überproduzieren, was zu einem einzigartigen Phänotyp namens Schleimhaut führt. Alginat ist mit chronischen Lungeninfektionen verbunden, was zu einer schlechten Prognose bei Patienten mit Mukoviszidose (CF) führt. Das Verständnis der Wege, die die Produktion von Alginat regulieren, kann bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien helfen, die auf die Alginatbildung abzielen. Ein weiterer krankheitsbedingter Phänotyp ist die kleine Kolonievariante (SCV). SCV ist auf das langsame Wachstum von Bakterien zurückzuführen und oft mit einer erhöhten Resistenz gegen antimikrobielle Mittel verbunden. In diesem Beitrag zeigen wir zunächst eine Methode zur Kultivierung einer genetisch definierten Form von P. aeruginosa SCV aufgrund von Pyrimidin-Biosynthesemutationen. Ergänzung der stickstoffhaltigen Basen, Uracil oder Cytosin, gibt das normale Wachstum zu diesen Mutanten, zeigt das Vorhandensein eines Bergungsweges, der freie Basen aus der Umwelt auffängt. Als nächstes diskutieren wir zwei Methoden zur Messung von bakteriellem Alginat. Das erste Verfahren beruht auf der Hydrolyse des Polysaccharids auf sein Uronsäuremonomer, gefolgt von der Derivatisierung mit einem chromogenen Reagenz, Carbazol, während das zweite Verfahren einen ELISA verwendet, der auf einem kommerziell erhältlichen, alginatspezifischen mAb basiert. Beide Methoden erfordern eine Standardkurve für die Quantifizierung. Wir zeigen auch, dass die immunologische Methode spezifisch für die Alginatquantifizierung ist und für die Messung von Alginat in den klinischen Proben verwendet werden kann.

Einleitung

Chronische Lungeninfektionen mit Pseudomonas aeruginosa sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit Mukoviszidose (CF). In der frühen Kindheit werden die Patienten von mehreren bakteriellen Krankheitserregern besiedelt, einschließlich nichtmucoiden Isolaten von P. aeruginosa^1,2. Die Entstehung der kleinen Kolonievariante (SCV) Isolate sowie Schleimhautisolate ist ein Marker für den Beginn chronischer Infektionen. SCV-Isolate sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsraten^{hochresistent3} , was sie zu einer schweren Abschreckung in den Behandlungsregimentern und anderen chronischen Infektionen⁵ von P. aeruginosamacht. Arbeiten von Al Ahmar et al.⁶ zeigten einen Zusammenhang zwischen SCV und Schleimhaut, der durch de novo pyrimidin Biosynthese verbunden ist. Pyrimidin-Hunger aufgrund von Mutationen in Genen, die an der Pyrimidinproduktion beteiligt waren, führte zu Einem SCV-Phänotyp im Nichtmucoid-Referenzstamm PAO1 und dem Schleimhautderivat PAO581 (PAO1mucA25).

Obwohl Alginat-Überproduktion ein wichtiger Krankheitsmarker für chronische Lungeninfektionen bei CF ist, ist es nicht klar, ob es einen direkten Zusammenhang zwischen der Menge an Alginat und Lungenpathologie gibt, und es ist unklar, ob Alginat als Prognosemarker für^dieBehandlung 7 verwendet werden kann. Die Alginatproduktion wird hauptsächlich durch zwei Operonen reguliert, einen regulatorischen Operon (algUmucABCD)^8,9 und den biosynthetischen Operon (algD operon)^10,11. Die Alginatproduktion wird durch den Sigma-Faktor AlgU^9,12 (auch bekannt als AlgT) und den Abbau des Anti-Sigma-Faktors MucA¹³streng reguliert. Die Fähigkeit, die Produktion von Alginat vor Ort aus den Sputumproben der Patienten zu überwachen, kann bei der Entwicklung neuer therapeutischer Optionen helfen.

Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, der das Vorhandensein von SCV erkennt, das durch Mutanten verursacht wird, die pyrimidin de novo nicht synthetisieren können. Die Ergänzung von Uracil und/oder Cytosin, der stickstoffhaltigen Basis von Pyrimidinnukleotid, zum Medium aktiviert den Bergungsweg und stellt so das normale Wachstum von Mutanten wieder her. Diese Wachstumsmethode für diese spezifischen SCV-Mutationen kann als Screening-Methode zur Identifizierung von Pyrimidin-Mutationen in Patientenproben verwendet werden. Darüber hinaus diskutieren wir zwei Methoden zum Nachweis und zur Messung von Alginat, das von P. aeruginosahergestellt und abgesondert wurde. Die erste ist die traditionelle Methode^14,15,16 der Abbau des Polysaccharids mit einer hohen Konzentration von Säure und dann Hinzufügen eines kolorimetrischen Indikators, um die Konzentration in der Probe zu quantitieren. Die zweite Methode, die in unserem Labor entwickelt wurde, nutzt den Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) mit einem von QED Biosciences entwickelten monoklonalen Antialginat-Antikörper (mAb). Die ELISA-Methode erweist sich als spezifischer und empfindlicher als der Uronsäure-Assay und ermöglicht eine sicherere Anwendung durch die Vermeidung der hochkonzentrierten Schwefelsäure. Mit der Fähigkeit des ELISA, direkt auf Patientensputumproben verwendet zu werden, um Alginat zu messen, kann es als Überwachungs-Diagnose-Tool entwickelt werden, um die Menge an Alginat in der Lunge in verschiedenen Perioden der Infektion zu verfolgen.

Protokoll

1. SCV-Wachstumsbedingungen und physiologische Aktivierung des Bergungsweges

1. Erkennung von SCV.
   1. Streichen Sie die P. aeruginosa-Stämme PAO1,PAO1-PyrD, PAO581 und PAO581-pyrD auf vorgewärmten Pseudomonas-Isolationsagarplatten (PIA) und wachsen bei 37 °C für 48 h. Auf der Wachstumsplatte ein einzelnes Kolonieisolat mit dem SCV-Phänotyp (Koloniegröße von 1 x 3 mm im Gegensatz zur normalen Koloniegröße von 3 x 5 mm) zu identifizieren.
   2. Wiederholen Sie Schritt 1.1.1, um ein reines Isolat des SCV zu erhalten.
      HINWEIS: Das Wachstum kann aufgrund der langsamen Wachstumsrate der SCV-Kolonien bis zu 72 h erfordern.
2. Physiologische Aktivierung des Bergungsweges.
   1. Mit einer sterilen Impfschleife, pflücken Sie die SCV-Kolonie von der PIA-Platte und streifen auf einer vorgewärmten PIA mit 0,1 mM Uracil ergänzt. Anbauplatte bei 37 °C für 24 x 48 h.
      HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten PIA-Platten enthalten 20 ml/L Glycerin, die der Mischung vor dem Autoklavieren zugesetzt werden. Nach dem Autoklavieren und nach dem Mischen liegt die Temperatur unter 55 °C, bevor die Platten 11,21 mg/L Uracil (0,1 mM) in die flüssigen Medien gegossen werden. Diese Methode würde helfen, Pyrimidin-Mutationen zu identifizieren, die SCV-Phänotyp in P. aeruginosaverursachen. Wenn der SCV-Phänotyp ein Ergebnis dieser Mutation ist, dann würde ein normales Koloniewachstum und eine normale Größe (3-5 mm) auf den uracil ergänzten PIA-Platten beobachtet werden. Wenn Stämme die Fähigkeit hatten, Alginat zu produzieren, dann wird der Mukoid-Phänotyp auch nach Uracil-Supplementierung zurückkehren.

2. Uronsäure Carbazol Assay

1. Aus einer reinen Kultur der gewünschten Sorte getestet werden, identifizieren Sie eine einzelne Kolonie. Mit einem sterilen Zahnstocher, wählen Sie die Kolonie, und legen Sie den Zahnstocher in einem Kultur-Reagenzglas mit 5 ml Pseudomonas Isolationbrühe (PIB). Wachsen Sie in einem Shaker-Inkubator bei 37 °C für 24 h.
   HINWEIS: Die folgenden Stämme PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carBund PAO581pyrD wurden auf PIA-Platten oder PIA-Platten angebaut, die mit 0,1 mM Uracil ergänzt wurden, um Alginat zur Messung zu ernten.
2. Auf eine vorgewärmte PIA-Platte 150 l kultivierte PIB-Brühe (für 15 mm x 100 mm Platten) oder 450 l Brühe (für 15 mm x 150 mm Platten) geben. Mit einem sterilen Zellstreuer die Brühe über die Platte verteilen. Wachsen Sie die Platte bei 37 °C für 24 h.
   HINWEIS: Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit, falls vorhanden, von der Platte mit einer Pipette, indem Sie die Platte auf eine Seite kippen. Sowohl PIB- als auch PIA-Platten, die im Protokoll verwendet werden, enthalten 20 ml/L Glycerin, die von Zellen als Kohlenstoffquelle zur Unterstützung der Alginatproduktion verwendet werden.
3. Mit einem Pipettenregler und einer sterilen 50 ml Pipette, fügen Sie 0,85% NaCl auf den Rasen gewachsen wachsen und proben durch Verschrottung der Platte mit einem Zellstreuer zu sammeln. Die Probe mit einer frischen 50 ml Pipette in ein 50 ml Sammelrohr ansaugen. Wirbeln Sie die Probe auf hoch zu mischen und legen Sie die Proben auf Eis.
   HINWEIS: Das Volumen der hinzugefügten 0.85% NaCl variiert je nach Größe der Platte. Verwenden Sie für 15 mm x 100 mm Platten 10 x 30 ml und für 15 mm x 150 mm Platten 20 x 50 ml.
4. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) der Proben, indem Sie 1 ml der Probe zu einer Einwegküvette hinzufügen und die OD mit einem Spektralphotometer lesen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um eine Dreifache der Lesevorgänge für jedes Beispiel zu erhalten.
5. 3 ml der Schwefelsäure/Borat-Lösung in Kulturröhren geben und auf Eis sitzen lassen. Fügen Sie 350 l der gesammelten Probe SLOWLY in die Säuremischung in den Reagenzgläsern und Wirbel auf niedrig kurz.
   1. Bereiten Sie Boratbrühe vor, indem Sie 10,099 g Kaliumhydroxid (KOH)-Pulver zu 45 ml Wasser hinzufügen. 24,74 g Borsäure (H₃BO₃) in das Gemisch geben und Volumen auf 100 ml bringen.
   2. 1 L Flasche in ein Waschbecken mit Eis geben und Flasche mit 500 ml konzentrierter Schwefelsäure füllen. SLOWLY 15 ml des vorbereiteten Boratbestandes hinzufügen. Die Flasche abkühlen lassen.
   3. Fügen Sie weitere 10 ml Borat-Lager für insgesamt 25 ml hinzu. Sobald die Flasche abgekühlt ist, bringen Sie das Volumen auf 1 L.
      VORSICHT: Diese Methode beruht auf der Verwendung von hochkonzentrierter Schwefelsäure. Es sollten geeignete persönliche Schutzausrüstungen verwendet werden, um die Sicherheit zu gewährleisten, und das ordnungsgemäße Entsorgungsprotokoll der Probe sollte eingehalten werden.
      HINWEIS: Für eine Positivkontrolle eine bekannte Konzentration von D-Mannuronsäure und/oder einer bekannten bakteriellen Alginatproben, die durch Alginat produzierende Stämme von P. aeruginosa geerntet und gereinigt werden (z. B.: PAO581-PAO1mucA25). Für eine negative Kontrolle verwenden 0.85% NaCl-Lösung und/oderPAO1-algD (In-Frame-Deletion des AlgD-Gens, das die Bakterien völlig unfähig macht, Alginat zu produzieren). Aus jeder Probe können mehrere Rohre hergestellt werden, um die Anzahl der technischen Wiederholungen zu erhöhen, um die statistische Analyse zu unterstützen. Bereiten Sie 3-5 Tuben jeder Probe vor.
6. Fügen Sie 100 l 0,1% Carbazol in Ethanollösung in die Säure-/Probenmischung ein. Kappen Sie das Rohr und den Wirbel auf mittlerer Einstellung für 5 s. Legen Sie in einem trockenen Bad bei 55 °C für 30 min.
7. Nach der Inkubation die Rohre und den Wirbel kurz auf hoch entfernen und 5 min abkühlen lassen.
   HINWEIS: Farbe zu sehen wäre ein Farbton von lila. Die Farbe bleibt für die Messung für 1 x 2 h stabil.
8. Lesen Sie die OD₅₃₀ jedes Rohres, indem Sie 1 ml des Gemischs zu einer sauberen Küvette hinzufügen und die OD der Proben bei 530 nm auf einem Spektralphotometer lesen. Verwenden Sie das Rohr mit 0,85% NaCl als Leerling zum Spektralphotometer.
9. Bereiten Sie eine Standardkurve vor, indem Sie die OD₅₃₀ der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von D-Mannuronsäure (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml und 8 g/ml) messen. 2x wiederholen. Extrahieren Sie eine lineare Gleichung aus diesen Messwerten.
   HINWEIS: Die Standardkurve muss nur einmal durchgeführt werden. Die daraus extrahierte lineare Gleichung kann für spätere Tests verwendet werden.
   1. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe mit der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD₆₀₀ auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD₆₀₀zu erhalten.

3. ELISA für Alginat-Quantitation

1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.4, um Proben für die Alginatmessung zu erhalten.
   HINWEIS: Die verwendeten Stämme waren PAO1,PAO1-algDund PAO1 mit pHERD20T-algU.
2. Mit einer Mikropipette 50 l der gesammelten Probe zu einer unbehandelten 96-Well-Platte hinzufügen. Fügen Sie den Bohrbrunnen 50 l Beschichtungspuffer (Carbonat/Bicarbonatpuffer pH 9.6) hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h.
   HINWEIS: Für eine Positivkontrolle kann eine bekannte Konzentration von D-Mannuronsäure und/oder einem bekannten stabilen Alginat produzierenden Stamm (z. B.: PAO581-PAO1mucA25) verwendet werden. Für eine negative Kontrolle verwenden 0.85% NaCl-Lösung und/oderPAO1-algD (in-Frame-Deletion des AlgD-Gens macht die Bakterien völlig unfähig, alginat zu produzieren). Aus jeder Stichprobe können mehrere Bohrungen hergestellt werden, um die Anzahl der technischen Wiederholungen zu erhöhen, um die statistische Analyse zu unterstützen. Bereiten Sie 3-5 Brunnen jeder Probe vor.
3. Mit einer Spritzflasche die Plattenbrunnen 2x mit 1x Phosphatpufferkochin (PBS) mit 0,05% Tween 20 (PBS-T) waschen, indem Sie die Brunnen füllen und dann entleeren, indem Sie die Platte umdrehen.
4. Mit einer Mikropipette fügen Sie den Brunnen 200 l Blockierpuffer (10% Magermilch in PBS-T) hinzu. Bei 4 °C über Nacht inkubieren.
   HINWEIS: Wrap Platte in Paraffinfolie oder Schrumpffolie, um Verdunstung im Kühlschrank zu vermeiden.
5. Mit einer Spritzflasche waschen Sie die Plattenbrunnen 2x mit PBS-T, indem Sie die Brunnen füllen und dann durch Umklappen der Platte entleeren.
6. Mit einer Mikropipette 100 l verdünnten Primärantikörper (Mausantialginat monoklonaler Antikörper) in die Brunnen geben und bei 37 °C für 1 x 2 h brüten.
   HINWEIS: Primärer Antikörper (Maus-Anti-Alginat-Monoklonaler Antikörper) wurde in einer Konzentration von 0,5 g/ml (Verdünnung von 1:2.000 von 1 mg/ml-Lager) in einer Verdünnungsmittellösung für Antikörper (1% Magermilch in 1x PBS) bereitgestellt.
7. Mit einer Spritzflasche waschen Sie die Plattenbrunnen 3x mit PBS-T, indem Sie die Brunnen füllen und dann durch Umklappen der Platte entleeren.
8. Mit einer Mikropipette 100 l verdünnten Sekundärantikörper in die Brunnen geben und bei 37 °C für 1 x 2 h brüten.
   HINWEIS: Sekundärer Antikörper wurde verwendet, um Ziegen-Anti-Maus-Poly-HRP-Antikörper mit einer Konzentration von 0,25 g/ml (Verdünnung von 1:2.000 von 0,5 mg/ml) in einer Verdünnungslösung für Antikörper zu bohren.
9. Mit einer Spritzflasche waschen Sie die Plattenbrunnen 3x mit PBS-T, indem Sie die Brunnen füllen und dann durch Umklappen der Platte entleeren.
10. Mit einer Mikropipette 100 L TMB-ELISA-Lösung (Materialtabelle) hinzufügen und bei Raumtemperatur 30 min im Dunkeln brüten.
    HINWEIS: Die Farbe einer positiven Reaktion wäre ein Blauton.
11. Mit einer Mikropipette 100 l Stop-Lösung (2 N Schwefelsäure) hinzufügen.
    HINWEIS: Die Farbe wird von blau zu gelb, wenn die Stop-Lösung hinzugefügt wird. Die Farbe ist für bis zu 30 min stabil, nachdem die Reaktion gestoppt wurde.
12. Lesen Sie den OD mit einem Plattenleser bei 450 nm.
13. Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die OD₄₅₀ der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von D-Mannuronsäure (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml und 8 g/ml) messen. 2x wiederholen. Aus diesen Messwerten wird eine lineare Gleichung extrahiert.
    HINWEIS: Die Standardkurve muss nur einmal durchgeführt werden. Die daraus extrahierte lineare Gleichung kann für spätere Tests verwendet werden.
    1. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe mit der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD₆₀₀ auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD₆₀₀zu erhalten.

4. Statistische Analyse der Alginatmessung

1. Legen Sie in einem grafischen Softwareblatt eine Spalte mit der linearen Gleichung fest, die von der Standardkurve abgeleitet ist. Legen Sie die Y-Achsenergebnisse als Alginatkonzentration und die x-Achse als OD₅₃₀ für Uronsäure-Assay und OD₄₅₀ für ELISA fest, um die Alginatkonzentrationen in jeder Probe zu erhalten.
2. Um die Alginatmenge in jeder Probe auf die Menge pro 5,5 x10⁸ KBE/ml (1 OD₆₀₀₎zu normalisieren, dividieren Sie die Konzentration jeder oben erhaltenen Probe durch ihren jeweiligen OD_600-Wert. Wenn für jede Probe mehrere OD₆₀₀ gemessen wurden, dividieren Sie durch den mittleren OD₆₀₀.
3. Führen Sie statistische Analysen mit bevorzugter statistischer Software (z. B. GraphPad Prism 7.02) durch.
4. Öffnen Sie die Software. Wählen Sie Spalte unter Neue Tabelle & Diagramm und wählen Sie den einwegs aNOVA-Datensatz.
5. Benennen Sie jede Spalte mit der getesteten Sorte und fügen Sie die Alginatkonzentrationen darunter hinzu.
6. Nachdem Sie alle Daten ein- und eingeteilt haben, klicken Sie im oberen Menü auf Analysieren. Dadurch wird ein Analyseeinstellungsfenster geöffnet. Wählen Sie die entsprechenden Parameter für Tests aus, und geben Sie an, ob mehrere Vergleiche ausgeführt werden müssen.
   HINWEIS: Nach der Analyse enthält der Datensatz einen p-Wert, der helfen würde, die statistische Signifikanz der Daten zu bestimmen. Die Daten würden als statistisch signifikant angesehen, wenn der p-Wert kleiner als der festgelegte Wert ist (normalerweise wird der Wert für p < 0,01 festgelegt).
7. Wählen Sie unter der Registerkarte Diagramm den Bar-Graph-Typ aus. Dadurch werden die Daten mit dem angegebenen Titel aus dem Eingabedatenblatt automatisch dargestellt. Geben Sie die statistische Signifikanz der Daten nach Bedarf an, indem Sie das *-Symbol über Verbindungslinien zwischen den Balken von Interesse anzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt Platten von PAO1 und PAO581 mit oder ohne Inframe-Deletion im PyrD-Gen (ein Gen im Pyrimidin-Biosyntheseweg), das zu SCV⁶führt. Die PAO1 SCV Mutante wurde auf normales Wachstum als Reaktion auf Uracil-Supplementierung wiederhergestellt (Abbildung 1A,B). Darüber hinaus wurde die PAO581-pyrD-SCV-Mutation mit der gleichen Uracil-Behandlung in die Schleimhaut zurü...

Diskussion

Sowohl SCV als auch Alginat sind wichtige Krankheitsmarker, die an mehreren chronischen Infektionen beteiligt sind. Daher ist die Fähigkeit, SCV zu züchten sowie die Regulation und Produktion von Alginat durch P. aeruginosa zu untersuchen, ein wesentlicher Bestandteil der Entdeckung neuartiger Behandlungen für diese chronischen Krankheiten.

SCV-Stämme sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsrate⁴ im Vergleich zu anderen P. aeruginosa-Stämmen, die i...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028	via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Assay Plates 96-well	CoStar	2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2	Scientific Industries	G560
Boric Acid	Research Products International Corp.	10043-35-3
Cabinet Incubator	VWR	1540
Carbazole	Sigma	C-5132
Carbonate-Bicarbonate Buffer	Sigma	C3041
Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	05-539-13	via Fisher Scientific
Culture Test Tubes	Fisher Scientific	14-956-6D	via Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 mL)	Fisher Scientific	14955127	via Fisher Scientific
Cytosine	Acros Organics	71-30-7
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
D-Mannuronic Acid Sodium	Sigma Aldrich	SMB00280
FMC Alginate	FMC	2133
Glycerol	Fisher Scientific	BP906-5	For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody	QED Biosciences	N/A	Lot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)	Sigma	P3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody	Thermo Scientific	32230	via Fisher Scientific
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	1310-58-3	via Fisher Scientific
Prism 7	GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)	Difco	292710	via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB)	Alpha Biosciences	P16-115	via Fisher Scientific
Round Toothpicks	Diamond		Any brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133)	FMC Corporation
Skim Milk	Difco	232100	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	BioRad	170-2525	or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma	S-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader	Molecular Devices	i3x	or preferred vendor
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	via Fisher Scientific
Sulfuric Acid	Fisher Scientific	A298-212	Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)	R&D Systems	DY994
Tween 20	Sigma	P2287
Uracil	Acros Organics	66-22-8