伪多蒙多尼亚小殖民地文化及其藻酸盐的定量

摘要

在这里，我们描述了一个生长条件，以培养伪多蒙多尼亚小殖民地变种。我们还描述了使用传统的尿酸卡巴佐尔测定法和基于藻酸盐的单克隆抗体（mAb）的ELISA检测和定量由P.aeruginosa产生的外糖藻酸盐的两种独立方法。

摘要

假单组动物，一种机会性革兰氏阴性细菌病原体，可以过度产生外多糖藻酸盐，从而产生一种称为粘凝的独特表型。藻酸盐与慢性肺部感染有关，导致囊性纤维化 （CF） 患者预后不佳。了解调节藻酸盐生产的途径有助于制定针对藻酸盐形成的新型治疗策略。另一种与疾病相关的表型是小菌群变异（SCV）。SCV 是由于细菌生长缓慢，并且经常与抗菌素耐药性增加有关。在本文中，我们首先展示了一种由于苯丙胺生物合成突变而具有遗传定义的P.aeruginosa SCV的培养方法。补充氮碱，尿素或细胞氨酸，返回这些突变体的正常生长，表明存在一个拯救途径，从环境中清除自由碱。接下来，我们将讨论两种测量细菌藻酸盐的方法。第一种方法依靠多糖的水解到其尿酸单体，然后衍生与色原试剂，卡巴佐尔，而第二种方法使用ELISA基于市售的，藻酸盐特异性mAb。两种方法都需要一个标准曲线进行定量。研究还表明，该免疫法是藻酸盐定量的特异性，可用于临床标本的藻酸盐测量。

引言

慢性肺部感染与伪单多尼亚龙是囊性纤维化 （CF） 患者发病率和死亡率的主要原因。在幼儿期，患者被多种细菌病原体殖民，包括P.aeruginosa^1，2的非粘胶分离物。小菌群变异（SCV）分离物的出现以及粘水井分离物是慢性感染发病的标志。SCV分离物具有很强的抗药性^3，因为它们的生长速度缓慢^4，这使得他们在治疗团和其他慢性感染⁵由P.aeruginosa严重威慑。Al Ahmar等人⁶号的工作表明，SCV与通过新丙胺生物合成所联系的粘体之间存在联系。由于与苯丙胺生产有关的基因突变，苯丙胺饥饿导致非粘凝参考菌株PAO1和粘尿衍生物PAO581（PAO1mucA25）中的SCV表型。

尽管藻酸盐过度生产是CF慢性肺部感染的重要疾病标志物，但尚不清楚藻酸盐量与肺病理学之间是否存在直接相关性，也不清楚藻酸盐能否用作治疗⁷的预后标志物。藻酸盐生产主要由两个操作器调节，一个调节操作体（algUmucABCD）8，9和生物合成操作子（阿尔格Doperon）10，11。藻酸盐生产受到西格玛因子AlgU^9、12（也称为AlgT）和反西格玛因子MucA¹³的降解的严格调节。从患者的痰样原位监测藻酸盐的产生的能力有助于开发新的治疗方案。

在这里，我们描述了一个生长条件，它检测由不能合成新热胺的突变体引起的SCV的存在。补充尿素和/或细胞氨酸，苯丙胺核苷核苷酸的氮碱，到介质激活抢救途径，从而恢复突变体的正常生长。这种针对这些特定SCV突变体的生长方法可用作筛选方法，以识别患者样本中的丙酰胺突变。此外，我们还讨论了两种检测和测量由P.aeruginosa产生和分泌的藻酸盐的方法。第一种是使用高浓度酸降解多糖的传统方法14、15、16，然后添加一个色度指标来定量样品中的浓度。第二种方法，在我们的实验室开发，利用酶链接免疫吸附测定（ELISA）使用QED生物科学开发的抗藻酸盐单克隆抗体（mAb）。ELISA 方法证明比尿酸测定更具体、更敏感，由于避免了高浓度硫酸，因此可以更安全地使用。ELISA 能够直接用于患者痰样测量藻酸盐，因此可以开发为监测诊断工具，以跟踪感染不同时期肺部存在的藻酸盐量。

研究方案

1. SCV 生长条件及打捞路径的生理激活

1. SCV 检测。
   1. 在预热的伪单一酶（PIA）板上，在37°C生长48小时，在预加热的伪单子分离琼脂（PIA）板上，将P.aeruginosa菌株PAO1、PAO1+pyrD、PAO581和PAO581_pyrD分发。在生长板上识别具有 SCV 表型的单一菌落隔离物（菌群大小为 1⁄3 mm，而不是正常的 3⁄5 mm 菌落大小）。
   2. 重复步骤 1.1.1 以获得 SCV 的纯隔离。
      注:由于SCV菌落的生长速度缓慢，生长可能需要长达72小时。
2. 打捞途径的生理活化。
   1. 使用无菌接种回路，从 PIA 板中选取 SCV 菌落，并在预加热的 PIA 上条纹，辅以 0.1 mM 的 uracil。在 37°C 下生长板 24~48 小时。
      注:本议定书中使用的所有PIA板均含有高压灭菌前添加到混合物中的20 mL/L甘油。高压灭菌后和混合物温度低于55°C后，在浇注板前向液体介质中加入11.21mg/L的尿素（0.1 mM）。这种方法将有助于识别导致P.aeruginosa中引起SCV表型的苯丙氨酸突变。如果 SCV 表型是上述突变的结果，则在 uracil 补充的 PIA 板上观察到正常的菌群生长和大小 （3⁄5 mm）。如果菌株有能力产生藻酸盐，那么粘液表型也将返回尿酸补充。

2. 尿酸卡巴佐尔测定

1. 从需要测试的纯培养物中，识别单个菌落。使用无菌牙签，拾取菌落，并将牙签放入含有 5 mL的伪单抗隔离汤 （PIB） 的培养试管中。在37°C的摇床培养箱中生长24小时。
   注:以下菌株PAO581（PAO1mucA25）、PAO581CarA、PAO581车B和PAO581pyrD生长在PIA板或PIA板上，辅以0.1 mM uracil，以收获藻酸盐进行测量。
2. 在预热的 PIA 板上添加 150 μL 的培养 PIB 肉汤（对于 15 mm x 100 mm 板）或 450 μL 的肉汤（对于 15 mm x 150 mm 板）。使用无菌细胞扩张器，将肉汤铺在盘子上。在 37°C 下生长板 24 小时。
   注:使用移液器从板中吸出任何多余的液体（如果有），将板倒入一侧。协议中使用的PIB和PIA板均含有20 mL/L的甘油，由细胞用作碳源，以帮助生产藻酸盐。
3. 使用移液器控制器和无菌 50 mL 移液器，在种植的草坪上添加 0.85% NaCl，并使用细胞扩张器刮板收集样品。使用新鲜的 50 mL 移液器将样品吸入 50 mL 收集管中。将样品涡旋到高处，将样品混合并放在冰上。
   注: 添加的 0.85% NaCl 的体积因板的大小而异。对于 15 mm x 100 mm 板，使用 10⁄30 mL;对于 15 mm x 150 mm 板，使用 20~50 mL。
4. 通过将样品的 1 mL 添加到一次性比色皿中并使用分光光度计读取 OD，测量样品 600 nm （OD_600）的光学密度。重复此步骤 2x 可获取每个示例的三重读取。
5. 将3 mL的硫酸/硼酸盐溶液加入培养管中，放在冰上。将收集的样品的350 μL缓慢地加入试管中的酸混合物中，并在低涡中短暂地加入涡旋。
   1. 在 45 mL 的水中加入 10.099 克氢氧化钾 （KOH） 粉末，制备硼酸盐。在混合物中加入24.74克硼酸（H₃BO_3），使体积至100 mL。
   2. 将 1 L 瓶放入装有冰的水槽中，并装满 500 mL 的浓缩硫酸。缓慢添加 15 mL 的准备硼酸盐股票。让瓶子冷却。
   3. 再添加 10 mL 的硼酸盐库存，总计 25 mL。一旦瓶子冷却，将体积达到1升。
      注意:此方法依赖于使用高浓度硫酸。应使用适当的个人防护设备确保样品的安全和适当的处置协议。
      注:对于正对照，已知浓度为D-锰酸和/或已知的细菌藻酸盐样品，通过藻酸盐生产P.aeruginosa菌株（例如:PAO581-PAO1MucA25）进行收获和纯化。对于负控制，请使用 0.85% NaCl 溶液和/或 PAO1+algD（在帧内删除algD基因，使细菌完全无法产生藻酸盐）。可以从每个样品中制成多个管，以增加技术重复次数，以帮助进行统计分析。准备每个样品的3⁄5管。
6. 在乙醇溶液中加入100 μL 0.1%的卡巴佐尔，加入酸/样品混合物中。将管子和涡旋盖在中等设置上5秒，在55°C的干浴中放置30分钟。
7. 孵育后，在高上短暂取出管和涡流，冷却5分钟。
   注:要看到的颜色将是紫色的阴影。颜色将保持稳定，测量1⁄2小时。
8. 将 1 mL 的混合物添加到干净的比色皿中，并在分光光度计上读取 530 nm 样品的 OD，读取每个管的 OD_530。使用带有 0.85% NaCl 的管子作为分光光度计的空白。
9. 通过测量已知浓度D-锰酸（1，024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL 和 8 μg/mL）的已知浓度的 OD₅₃₀系列稀释，准备标准曲线。重复 2 次。从这些读数中提取线性方程。
   注:标准曲线只需执行一次。从中提取的线性方程可用于以后的测试。
   1. 使用标准曲线计算每个样本中的藻酸盐浓度，并将藻酸盐浓度从线性方程除以_{OD 600，}以获得每OD₆₀₀的藻酸盐总量。

3. 藻酸盐定量ELISA

1. 重复步骤 2.1_2.4 以获得藻酸盐测量样本。
   注:使用的菌株为PAO1、PAO1+algD和PAO1携带pHERD20T-algU。
2. 使用微移液器将采集的样品的50μL添加到未经处理的96孔板中。向井中加入 50 μL 涂层缓冲液（碳酸盐/碳酸氢缓冲液 pH 9.6）。在37°C下孵育板2小时。
   注:对于阳性控制，可以使用已知浓度为D-锰酸和/或已知稳定藻酸盐产生菌株（例如:PAO581-PAO1mucA25）。对于负控制使用 0.85% NaCl 溶液和/或 PAO1+algD（在帧内删除algD基因使细菌完全无法产生任何藻酸盐）。可以从每个样品中制造多个井，以增加技术重复次数，以帮助进行统计分析。准备3~5口样品。
3. 使用喷瓶，用1倍磷酸盐缓冲盐（PBS）清洗板孔2倍，用0.05%补间20（PBS-T）填充井，然后翻转板来排空。
4. 使用微移液器向井中加入 200 μL 的阻塞缓冲液（PBS-T 中的 10% 脱脂牛奶）。在4°C孵育过夜。
   注:将板包裹在石蜡薄膜或收缩包装中，以帮助避免冰箱中出现任何蒸发。
5. 使用喷瓶将板孔用PBS-T清洗2倍，填充井，然后翻转板来排空。
6. 使用微移液器向井中加入100μL的稀释原抗体（小鼠抗藻酸盐单克隆抗体），并在37°C下孵育1⁄2小时。
   注:在抗体稀释溶液（1x PBS中1%脱脂牛奶）中的原抗体（小鼠抗藻酸单克隆抗体）在浓度为0.5μg/mL（稀释1:2，000的1mg/mL） 中提供。
7. 使用喷瓶清洗板井3倍与PBS-T填充井，然后通过翻转板排干。
8. 使用微移液器向井中加入100μL的稀释二级抗体，并在37°C下孵育1⁄2小时。
   注:二级抗体使用的是穿刺山羊抗小鼠多HRP抗体，浓度为0.25微克/mL（稀释1:2，000 0.5mg/mL库存）的抗体稀释溶液。
9. 使用喷瓶清洗板井3倍与PBS-T填充井，然后通过翻转板排干。
10. 使用微移液器，加入100μL的TMB-ELISA溶液（材料表），在黑暗中在室温下孵育30分钟。
    注:正面反应的颜色为蓝色阴影。
11. 使用微移液器，加入100 μL的停止溶液（2 N硫酸）。
    注: 添加停止溶液时，颜色将从蓝色变为黄色。停止反应后，颜色稳定长达 30 分钟。
12. 使用板读取器，读取 450 nm 处的 OD。
13. 通过测量已知浓度D-锰酸（1，024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL 和 8 μg/mL）的已知浓度的 OD₄₅₀连续稀释，生成标准曲线。重复 2 次。从这些读数中提取一个线性方程。
    注: 标准曲线只需执行一次。从中提取的线性方程可用于以后的测试。
    1. 使用标准曲线计算每个样本中的藻酸盐浓度，并将藻酸盐浓度从线性方程除以_{OD 600，}以获得每OD₆₀₀的藻酸盐总量。

4. 藻酸盐测量的统计分析

1. 在图形软件工作表中，使用从标准曲线派生的线性方程设置列。将 y 轴结果设置为藻酸盐浓度，将 x 轴结果设置为尿酸测定的 OD_530，为 ELISA 设置 OD_450，以获得每个样品中的藻酸盐浓度。
2. 要将每个样品中的藻酸盐量标准化为每5.5 x10⁸ CFU/mL（1 OD_600）的量，将上述每个样品的浓度除以其各自的OD₆₀₀值。如果为每个样本测量多个 OD_600，则除以平均 OD₆₀₀。
3. 使用首选统计软件（例如，图形板棱镜 7.02）执行统计分析。
4. 打开软件。在"新建表和图形"下选择"列"并选择单向方差分析数据集。
5. 用测试的应变来命名每列，并在下面添加藻酸盐浓度。
6. 输入所有数据后，单击顶部菜单中的"分析"。这将打开一个分析设置窗口。选择适当的测试参数，并指示是否需要运行任何多个比较。
   注: 分析后，数据集将包含一个 p 值，可帮助确定数据的统计显著性。如果 p 值小于设置的 + 值（通常为 p < 0.01 设置值），则数据将被视为具有统计显著性。
7. 在图形选项卡下选择条形图类型。这将自动绘制输入数据表中指示的标题的数据图表。通过显示感兴趣条之间的连接线上方的 @ 符号，根据需要指示数据的统计显著性。

结果

图1显示了PAO1和PAO581的板，在pyrD基因（pyrimidine生物合成通路的一个基因）中，无论是否在帧内删除，导致SCV^6。PAO1 SCV突变体在响应尿液补充时恢复正常生长（图1A，B）。此外，PAO581®pyrD SCV突变体通过相同的尿素处理返回到粘液，因为母菌株PAO581具有额外的MucA25突变（...

讨论

SCV 和藻酸盐都是与多种慢性感染相关的重要疾病标志物。因此，能够生长SCV以及研究由P.aeruginosa调节和生产的藻酸盐是发现这些慢性疾病的新疗法不可或缺的。

SCV菌株是出了名的难以生长，由于其缓慢的生长速度⁴相比，其他P.aeruginosa菌株，这有助于他们的抗微生物药物耐药性^3。我们的工作确定了一种特定形式的P.aeruginosa<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028	via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Assay Plates 96-well	CoStar	2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2	Scientific Industries	G560
Boric Acid	Research Products International Corp.	10043-35-3
Cabinet Incubator	VWR	1540
Carbazole	Sigma	C-5132
Carbonate-Bicarbonate Buffer	Sigma	C3041
Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	05-539-13	via Fisher Scientific
Culture Test Tubes	Fisher Scientific	14-956-6D	via Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 mL)	Fisher Scientific	14955127	via Fisher Scientific
Cytosine	Acros Organics	71-30-7
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
D-Mannuronic Acid Sodium	Sigma Aldrich	SMB00280
FMC Alginate	FMC	2133
Glycerol	Fisher Scientific	BP906-5	For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody	QED Biosciences	N/A	Lot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)	Sigma	P3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody	Thermo Scientific	32230	via Fisher Scientific
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	1310-58-3	via Fisher Scientific
Prism 7	GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)	Difco	292710	via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB)	Alpha Biosciences	P16-115	via Fisher Scientific
Round Toothpicks	Diamond		Any brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133)	FMC Corporation
Skim Milk	Difco	232100	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	BioRad	170-2525	or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma	S-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader	Molecular Devices	i3x	or preferred vendor
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	via Fisher Scientific
Sulfuric Acid	Fisher Scientific	A298-212	Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)	R&D Systems	DY994
Tween 20	Sigma	P2287
Uracil	Acros Organics	66-22-8