Culture de la petite colonie Variante de Pseudomonas aeruginosa et Quantitation de son Alginate

Résumé

Ici, nous décrivons une condition de croissance à la culture de la variante petite colonie de Pseudomonas aeruginosa. Nous décrivons également deux méthodes séparées pour la détection et la quantitation de l’alginate d’exopolysaccharide produit par P. aeruginosa utilisant un test traditionnel de carbazole d’acide uronique et un anticorps monoclonal alginate-spécifique (mAb) basé ELISA.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène bactérien gram-négatif opportuniste, peut surproduire un alginate exopolysaccharide résultant en un phénotype unique appelé mucoidy. L’alginate est lié aux infections pulmonaires chroniques ayant pour résultat le pronostic pauvre dans les patients présentant la mucoviscidose (CF). Comprendre les voies qui régulent la production d’alginate peut aider à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la formation d’alginate. Un autre phénotype lié à la maladie est la variante de la petite colonie (CVC). Le VCS est dû à la croissance lente des bactéries et souvent associé à une résistance accrue aux antimicrobiens. Dans cet article, nous montrons d’abord une méthode de culture d’une forme génétiquement définie de P. aeruginosa SCV due aux mutations de biosynthèse de pyrimidine. La supplémentation des bases azotales, uracil ou cytosine, retourne la croissance normale à ces mutants, démontrant la présence d’une voie de récupération qui récupère les bases libres de l’environnement. Ensuite, nous discutons deux méthodes pour la mesure de l’alginate bactérien. La première méthode repose sur l’hydrolyse du polysaccharide à son monomère d’acide uronique suivie d’une dérivation avec un réactif chromogénique, le carbazole, tandis que la seconde méthode utilise un ELISA basé sur un mAb disponible dans le commerce, spécifique à l’alginate. Les deux méthodes nécessitent une courbe standard pour la quantitation. Nous montrons également que la méthode immunologique est spécifique pour la quantification d’alginate et peut être employée pour la mesure de l’alginate dans les spécimens cliniques.

Introduction

Les infections pulmonaires chroniques avec Pseudomonas aeruginosa sont une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de fibrose kystique (FK). Pendant la petite enfance, les patients sont colonisés par de multiples agents pathogènes bactériens, y compris des isolats nonmucoïdes de P. aeruginosa^1,2. L’émergence des isolats de la petite colonie (SCV) ainsi que des isolats mucoïdes est un marqueur pour l’apparition d’infections chroniques. Les isolats SCV sont très résistants aux médicaments³ en raison de leur faible taux de croissance⁴, ce qui les rend un moyen de dissuasion sévère dans les régiments de traitement et d’autres infections chroniques⁵ par P. aeruginosa. Les travaux d’Al Ahmar et coll.⁶ ont montré un lien entre le VHC et la mucoidy lié par la biosynthèse de novo pyrimidine. La famine de pyrimidine, due aux mutations dans les gènes impliqués dans la production de pyrimidine, a eu comme conséquence le phénotype de SCV dans la souche de référence nonmucoid PAO1 et le dérivé mucoid, PAO581 (PAO1mucA25).

Même si la surproduction d’alginate est un marqueur important de la maladie pour les infections pulmonaires chroniques dans les fc, il n’est pas clair s’il existe une corrélation directe entre la quantité d’alginate et la pathologie pulmonaire, et il n’est pas clair si l’alginate peut être utilisé comme marqueur de pronostic pour le traitement⁷. La production d’alginate est principalement réglementée par deux opopons, un opperon réglementaire (algUmucABCD)^8,9 et l’opéron biosynthétique(algd opéron)^10,11. La production d’alginate est étroitement réglementée par le facteur sigma AlgU^9,12 (également connu sous le nom AlgT) et la dégradation du facteur anti-sigma MucA¹³. La capacité de surveiller la production d’alginate in situ à partir des échantillons d’écrachats des patients peut aider au développement de nouvelles options thérapeutiques.

Ici, nous décrivons une condition de croissance qui détecte la présence de VCS causée par des mutants qui ne peuvent pas synthétiser la pyrimidine de novo. La supplémentation de l’uracil et/ou de la cytosine, la base azotée du nucléotide de pyrimidine, au milieu active la voie de récupération, rétablissant ainsi la croissance normale chez les mutants. Cette méthode de croissance pour ces mutants spécifiques de SCV peut être employée comme méthode de criblage pour identifier des mutations de pyrimidine dans des échantillons patients. En outre, nous discutons deux méthodes pour la détection et la mesure de l’alginate produit et sécrété par P. aeruginosa. La première est la méthode traditionnelle^14,15,16 de dégrader le polysaccharide en utilisant une forte concentration d’acide, puis en ajoutant un indicateur colorimétrique pour quantifier la concentration dans l’échantillon. La deuxième méthode, développée en laboratoire, utilise l’Analyse immunosorbent enzymatique (ELISA) à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-alginate (mAb) développé par QED Biosciences. La méthode ELISA s’avère plus spécifique et plus sensible que l’indice d’acide uronique et permet une utilisation plus sûre en raison de l’évitement de l’acide sulfurique très concentré. Avec la capacité de l’ELISA d’être utilisé directement sur les échantillons d’émoi du patient pour mesurer l’alginate, il peut être développé comme un outil de diagnostic de surveillance pour suivre la quantité d’alginate présente dans les poumons à différentes périodes de l’infection.

Protocole

1. Conditions de croissance du CVS et activation physiologique de la voie de sauvetage

1. Détection du VCS.
   1. Streak le P. aeruginosa souches PAO1, PAO1-pyrD, PAO581, et PAO581-pyrD sur préwarmed Pseudomonas isolation agar plaques (PIA) plaques et de croître à 37 oC pendant 48 h. Sur la plaque de croissance, identifier un seul isolat de colonie qui a le phénotype SCV (taille de la colonie de 1 à 3 mm par opposition à la taille normale de la colonie de 3 à 5 mm).
   2. Répétez l’étape 1.1.1 pour obtenir un isolat pur du VCS.
      REMARQUE : La croissance peut nécessiter jusqu’à 72 h en raison du taux de croissance lent des colonies de VCS.
2. Activation physiologique de la voie de récupération.
   1. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, choisissez la colonie de VCS dans la plaque PIA et faites une stries sur une ÉPL préchauffée complétée par 0,1 mm d’uracil. Faire pousser la plaque à 37 oC pour 24 à 48 h.
      REMARQUE : Toutes les plaques PIA utilisées dans ce protocole contiennent 20 ml/L de glycérol ajouté au mélange avant l’autoclage. Après l’autoclage et après que la température du mélange soit inférieure à 55 oC, ajouter 11,21 mg/L d’uracil (0,1 mm) au support liquide avant de verser les plaques. Cette méthode aiderait à identifier les mutations de pyrimidine qui causent le phénotype de SCV dans P. aeruginosa. Si le phénotype SCV est le résultat de ladite mutation, alors la croissance et la taille normales de la colonie (3 à 5 mm) seraient observées sur les plaques D’ÉFVP complétées par l’uracil. Si les souches avaient la capacité de produire de l’alginate, alors le phénotype mucoid sera également de retour sur la supplémentation uracil.

2. Test de carbazole d’acide uronique

1. À partir d’une culture pure de souche désirée à tester, identifiez une seule colonie. À l’aide d’un cure-dent stérile, choisissez la colonie et placez le cure-dent dans un tube à essai de culture contenant 5 ml de bouillon d’isolement Pseudomonas (PIB). Cultivez dans un incubateur shaker à 37 oC pendant 24 h.
   REMARQUE : Les souches suivantes PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB, et PAO581pyrD ont été cultivées sur des plaques PIA ou des plaques PIA complétées par 0,1 mM d’uracil pour récolter l’alginate pour la mesure.
2. Sur une assiette PIA préchauffée, ajoutez 150 l de bouillon DE PIB cultivé (pour 15 mm x 100 mm plaques) ou 450 'L de bouillon (pour les plaques de 15 mm x 150 mm). À l’aide d’un épandeur de cellules stériles, étendre le bouillon sur l’assiette. Faire pousser la plaque à 37 oC pendant 24 h.
   REMARQUE : Aspirez tout excès de liquide, le cas échéant, de la plaque à l’aide d’un tuyau en faisant basculer la plaque d’un côté. Les plaques DE PI et PIA utilisées dans le protocole contiennent 20 ml/L de glycérol à utiliser par les cellules comme source de carbone pour faciliter la production d’alginate.
3. À l’aide d’un contrôleur de pipette et d’une pipette stérile de 50 ml, ajouter 0,85 % de NaCl à la pelouse cultivée et recueillir l’échantillon en ferraillant la plaque à l’aide d’un épandeur de cellules. Aspirez l’échantillon à l’aide d’une tuyauterie fraîche de 50 ml dans un tube de collecte de 50 ml. Vortex l’échantillon à haute pour mélanger et placer les échantillons sur la glace.
   REMARQUE: Le volume de NaCl ajouté 0,85% varie en fonction de la taille de la plaque. Pour les plaques de 15 mm x 100 mm, utilisez 10 à 30 ml et pour les plaques de 15 mm x 150 mm, utilisez 20 à 50 ml.
4. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) des échantillons en ajoutant 1 ml de l’échantillon à une cuvette jetable et en lisant l’OD à l’aide d’un spectrophotomètre. Répétez cette étape 2x pour obtenir un triplement des lectures pour chaque échantillon.
5. Ajouter 3 ml de la solution d’acide sulfurique/borate dans des tubes de culture et laisser s’asseoir sur la glace. Ajouter 350 L de l’échantillon recueilli SLOWLY au mélange d’acide dans les tubes à essai et vortex à basse pression.
   1. Préparer le stock de borate en ajoutant 10,099 g de poudre d’hydroxyde de potassium (KOH) à 45 ml d’eau. Ajouter 24,74 g d’acide borique (H₃BO₃) au mélange et porter le volume à 100 ml.
   2. Placer 1 bouteille de L dans un évier avec de la glace et remplir la bouteille de 500 ml d’acide sulfurique concentré. SLOWLY ajouter 15 ml du bouillon de borate préparé. Laisser refroidir la bouteille.
   3. Ajouter 10 ml de stock de borate pour un total de 25 ml. Une fois la bouteille refroidie, porter le volume à 1 L.
      CAUTION: Cette méthode repose sur l’utilisation d’acide sulfurique très concentré. Un équipement de protection individuelle approprié devrait être utilisé pour assurer le protocole de sécurité et d’élimination approprié de l’échantillon.
      REMARQUE : Pour un contrôle positif, une concentration connue d’acide d’acide mannuronique D et/ou d’échantillons d’alginate bactériens connus récoltés et purifiés par des souches d’alginate produisant de P. aeruginosa (p. ex. : PAO581-PAO1mucA25). Pour une utilisation négative de contrôle 0,85% solution NaCl et / ou PAO1AlgD (suppression dans le cadre du gène algD qui rend la bactérie complètement incapable de produire de l’alginate). Plusieurs tubes peuvent être fabriqués à partir de chaque échantillon pour augmenter le nombre de répétitions techniques pour faciliter l’analyse statistique. Préparer les tubes de 3 à 5 de chaque échantillon.
6. Ajouter 100 'L de 0,1% de carbazole dans la solution d’éthanol au mélange acide/échantillon. Cap le tube et le vortex sur un réglage moyen pendant 5 s. Placer dans un bain sec à 55 oC pendant 30 min.
7. Après l’incubation, retirer brièvement les tubes et le vortex à hauteur et laisser refroidir pendant 5 min.
   REMARQUE: La couleur à voir serait une nuance de violet. La couleur restera stable pour la mesure pendant 1/2 h.
8. Lisez l’OD₅₃₀ de chaque tube en ajoutant 1 ml du mélange à une cuvette propre et en lisant l’OD des échantillons à 530 nm sur un spectrophotomètre. Utilisez le tube avec 0,85% NaCl comme un blanc au spectrophotomètre.
9. Préparer une courbe standard en mesurant l’OD₅₃₀ des dilutions en série des concentrations connues d’acide D-Mannuronique (1 024 g/mL, 512 g/mL, 256 g/mL, 128 'g/mL, 64 'g/mL, 32 'g/mL, 16 'g/mL, et 8 'g/mL). Répéter 2x. Extraire une équation linéaire de ces lectures.
   REMARQUE : La courbe standard n’a besoin d’être faite qu’une seule fois. L’équation linéaire extraite peut être utilisée pour des tests ultérieurs.
   1. Calculer la concentration de l’alginate dans chaque échantillon en utilisant la courbe standard et diviser la concentration d’alginate de l’équation linéaire par OD₆₀₀ pour obtenir la quantité totale d’alginate par OD₆₀₀.

3. ELISA pour Alginate Quantitation

1. Répétez les étapes 2.1-2.4 pour obtenir des échantillons pour la mesure de l’alginate.
   REMARQUE: Les souches utilisées étaient PAO1, PAO1AlgD, et PAO1 portant pHERD20T-algU.
2. À l’aide d’une micropipette, ajouter 50 ll de l’échantillon prélevé à une plaque non traitée de 96 puits. Ajouter 50 l de tampon de revêtement (carbonate/bicarbonate tampon pH 9,6) aux puits. Incuber la plaque à 37 oC pendant 2 h.
   REMARQUE : Pour un contrôle positif, une concentration connue d’acide D-Mannuronique et/ou une souche stable connue produisant de l’alginate (p. ex. : PAO581-PAO1mucA25)peut être utilisée. Pour une utilisation négative de contrôle 0,85% solution NaCl et / ouAlgD PAO1 (suppression dans le cadre du gène algD rend la bactérie complètement incapable de produire de l’alginate). Plusieurs puits peuvent être fabriqués à partir de chaque échantillon pour augmenter le nombre de répétitions techniques pour faciliter l’analyse statistique. Préparer les 3 à 5 puits de chaque échantillon.
3. À l’aide d’une bouteille d’éclaboussure, laver les puits d’assiette 2x avec 1x tampon tampon de phosphate (PBS) avec 0,05% Tween 20 (PBS-T) en remplissant les puits, puis les égoutter en renversant la plaque.
4. À l’aide d’une micropipette, ajouter 200 l de tampon de blocage (10 % de lait écrémé en PBS-T) aux puits. Incuber à 4 oC pendant la nuit.
   REMARQUE : Enveloppez l’assiette dans un film de paraffine ou réduisez l’enveloppe pour éviter toute évaporation dans le réfrigérateur.
5. À l’aide d’une bouteille d’éclaboussure laver les puits d’assiette 2x avec PBS-T en remplissant les puits, puis les égoutter en renversant la plaque.
6. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 oL d’anticorps primaires dilués (anticorps monoclonaux anti-alginates de souris) aux puits et incuber à 37 oC pendant 1 h et demi.
   REMARQUE : L’anticorps primaire (anticorps monoclonal anti-alginate de souris) a été fourni à une concentration de 0,5 g/mL (dilution de 1:2 000 de 1 mg/mL) dans la solution diluante d’anticorps (1 % de lait écrémé dans 1 x PBS).
7. À l’aide d’une bouteille d’éclaboussure laver les puits d’assiette 3x avec PBS-T en remplissant les puits, puis les égoutter en renversant la plaque.
8. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 l d’anticorps secondaires dilués aux puits et incuber à 37 oC pendant 1 h et demi.
   REMARQUE : L’anticorps secondaire utilisé était l’anticorps poly-HRP anti-souris perçant de chèvre à une concentration de 0,25 g/mL (dilution de 1:2,000 de 0,5 mg/mL) dans la solution de diluant d’anticorps.
9. À l’aide d’une bouteille d’éclaboussure laver les puits d’assiette 3x avec PBS-T en remplissant les puits, puis les égoutter en renversant la plaque.
10. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 l de solution TMB-ELISA(Tableau des matériaux)et incuber à température ambiante pendant 30 min dans l’obscurité.
    REMARQUE: La couleur d’une réaction positive serait une nuance de bleu.
11. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 l de solution d’arrêt (2 N d’acide sulfurique).
    REMARQUE : La couleur passera du bleu au jaune lorsque la solution d’arrêt sera ajoutée. La couleur est stable jusqu’à 30 min après l’arrêt de la réaction.
12. À l’aide d’un lecteur de plaques, lisez l’OD à 450 nm.
13. Produire une courbe standard en mesurant l’OD₄₅₀ des dilutions en série des concentrations connues d’acide D-Mannuronique (1 024 g/mL, 512 g/mL, 256 g/mL, 128 'g/mL, 64 'g/mL, 32 'g/mL, 16 'g/mL, et 8 'g/mL). Répéter 2x. De ces lectures extraient une équation linéaire.
    REMARQUE : La courbe standard ne doit être effectuée qu’une seule fois. L’équation linéaire extraite peut être utilisée pour des tests ultérieurs.
    1. Calculer la concentration de l’alginate dans chaque échantillon en utilisant la courbe standard et diviser la concentration d’alginate de l’équation linéaire par OD₆₀₀ pour obtenir la quantité totale d’alginate par OD₆₀₀.

4. Analyse statistique de la mesure de l’alginate

1. Dans une fiche logicielle graphique, définir une colonne avec l’équation linéaire dérivée de la courbe standard. Définir les résultats de l’axe y comme la concentration d’alginate et les résultats de l’axe X comme l’OD₅₃₀ pour l’analyse de l’acide uronique et OD₄₅₀ pour ELISA pour obtenir les concentrations d’alginate dans chaque échantillon.
2. Pour normaliser la quantité d’alginate dans chaque échantillon à la quantité par 5,5 x10⁸ CFU/mL (1 OD_600),divisez la concentration de chaque échantillon obtenu ci-dessus par sa valeur OD₆₀₀ respective. Si plusieurs OD₆₀₀ ont été mesurés pour chaque échantillon, divisez par l’OD₆₀₀moyen.
3. Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un logiciel statistique préféré (p. ex., GraphPad Prism 7.02).
4. Ouvrez le logiciel. Choisissez Colonne sous nouveau tableau et graphique et choisissez l’ensemble de données ANOVA à sens unique.
5. Nommez chaque colonne avec la souche testée et ajoutez les concentrations d’alginate en dessous.
6. Après avoir mis toutes les données cliquez sur Analyze dans le menu supérieur. Cela ouvrira une fenêtre de paramètres d’analyse. Choisissez les paramètres appropriés pour les tests et indiquez si plusieurs comparaisons doivent être exécutés.
   REMARQUE : Après analyse, l’ensemble de données contiendra une valeur p qui aiderait à déterminer la signification statistique des données. Les données seraient considérées comme statistiquement significatives si la valeur p est inférieure à la valeur de l’ensemble (normalement, la valeur de l’étiquette est fixée pour p 'lt; 0,01).
7. Sous l’onglet graphique, choisissez le type De graphique à barres. Cela permettra de cartographier automatiquement les données avec le titre indiqué à partir de la feuille de données d’entrée. Indiquer l’importance statistique des données au besoin en montrant le symbole ci-dessus au-dessus des lignes de connexion entre les barres d’intérêt.

Résultats

La figure 1 montre des plaques de PAO1 et PAO581 avec ou sans suppression dans le cadre dans le gène pyrD (un gène dans la voie de biosynthèse de la pyrimidine) qui a comme conséquence SCV⁶. Le mutant PAO1 SCV a été rétabli à la croissance normale en réponse à la supplémentation d’uracil (figure 1A,B). En outre, le mutant PAO581pyrDSCV a été retourné à la...

Discussion

Le VCS et l’alginate sont des marqueurs de maladie importants impliqués dans plusieurs infections chroniques. Par conséquent, la capacité de cultiver le VHC ainsi que d’étudier la régulation et la production d’alginate par P. aeruginosa fait partie intégrante de la découverte de nouveaux traitements pour ces maladies chroniques.

Les souches de VCS sont notoirement difficiles à cultiver en raison de leur taux de croissance lent⁴ par rapport à d’...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028	via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Assay Plates 96-well	CoStar	2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2	Scientific Industries	G560
Boric Acid	Research Products International Corp.	10043-35-3
Cabinet Incubator	VWR	1540
Carbazole	Sigma	C-5132
Carbonate-Bicarbonate Buffer	Sigma	C3041
Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	05-539-13	via Fisher Scientific
Culture Test Tubes	Fisher Scientific	14-956-6D	via Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 mL)	Fisher Scientific	14955127	via Fisher Scientific
Cytosine	Acros Organics	71-30-7
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
D-Mannuronic Acid Sodium	Sigma Aldrich	SMB00280
FMC Alginate	FMC	2133
Glycerol	Fisher Scientific	BP906-5	For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody	QED Biosciences	N/A	Lot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)	Sigma	P3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody	Thermo Scientific	32230	via Fisher Scientific
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	1310-58-3	via Fisher Scientific
Prism 7	GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)	Difco	292710	via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB)	Alpha Biosciences	P16-115	via Fisher Scientific
Round Toothpicks	Diamond		Any brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133)	FMC Corporation
Skim Milk	Difco	232100	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	BioRad	170-2525	or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma	S-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader	Molecular Devices	i3x	or preferred vendor
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	via Fisher Scientific
Sulfuric Acid	Fisher Scientific	A298-212	Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)	R&D Systems	DY994
Tween 20	Sigma	P2287
Uracil	Acros Organics	66-22-8