JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем состояние роста к культуре малый вариант колонии Pseudomonas aeruginosa. Мы также описываем два отдельных метода обнаружения и количественной оценки экзополисахарида альгината производства P. aeruginosa с использованием традиционной уронической кислоты карбазол анализа и альгината конкретных моноклональных антител (mAb) основе ELISA.

Аннотация

Pseudomonas aeruginosa, оппортунистический грамотрицательный бактериальный патоген, может перепроизводить экзополисахарид альгината в результате чего уникальный фенотип называется слизистой оболочки. Альгинат связан с хроническими легочными инфекциями, что приводит к плохому прогнозу у пациентов с муковисцидозом (КФ). Понимание путей, которые регулируют производство альгината может помочь в разработке новых терапевтических стратегий, направленных на альгинат формирования. Другим фенотипом, связанным с болезнью, является небольшой вариант колонии (SCV). SCV объясняется медленным ростом бактерий и часто связан с повышенной устойчивостью к противомикробным препаратам. В этой работе мы сначала показываем метод культивирования генетически определенной формы P. aeruginosa SCV из-за мутаций биосинтеза пиримидина. Дополнение азотных оснований, урацила или цитозина, возвращает нормальный рост этим мутантам, демонстрируя наличие спасительного пути, который высвобожяет свободные базы от окружающей среды. Далее мы обсудим два метода измерения бактериального альгината. Первый метод опирается на гидролиз полисахарида к его мономеру уроновой кислоты с последующим производным с хромогенным реагентом, карбазолом, в то время как второй метод использует ELISA на основе коммерчески доступного, альгината специфического mAb. Оба метода требуют стандартной кривой для количественной оценки. Мы также показываем, что иммунологический метод специфичен для алгинатной количественной оценки и может быть использован для измерения альгината в клинических образцах.

Введение

Хронические инфекции легких с Pseudomonas aeruginosa являются основной причиной заболеваемости и смертности у пациентов с муковисцидозом (CF). В раннем детстве пациенты колонизируются несколькими бактериальными патогенами, включая немукоидные изоляты P. aeruginosa1,2. Появление небольшого варианта колонии (SCV) изолятов, а также изоляты слизистой оболочки является маркером для начала хронических инфекций. SCV изоляты высоко лекарственно устойчивы3 из-за их медленных темпов роста4, что делает их тяжелым сдерживающим фактором в лечении полков и других хронических инфекций5 P. aeruginosa. Работа Al Ahmar et al.6 показала связь между SCV и слизистой оболочкой, связанную биосинтезом de novo pyrimidine. Пиримидиновые голодания, из-за мутаций в генах, связанных с производством пиримидина, привели к phenotype SCV в немукоидном референс-напряга е PAO1 и слизистой производной, PAO581 (PAO1mucA25).

Хотя альгинат перепроизводства является важным маркером заболевания для хронических инфекций легких в CF, не ясно, есть ли прямая корреляция между количеством альгината и легочной патологии, и неясно, если альгинат может быть использован в качестве маркера прогноза для лечения7. Производство алгината в основном регулируется двумя оперонами, регулятивным опероном(algUmucABCD)8,9 и биосинтетическим опероном(algD operon)10,11. Производство alginate плотно регулируется фактором сигмы AlgU9,12 (также известный как AlgT) и деградации анти-сигма фактор MucA13. Способность контролировать выработку альгината на месте из образцов моспы пациентов может помочь в разработке новых терапевтических вариантов.

Здесь мы описываем состояние роста, которое обнаруживает наличие SCV, вызванного мутантами, которые не могут синтезировать пиримидин де Ново. Дополнение урацила и/или цитозина, азотного основания пиримидного нуклеотида, к среде активизирует спасительный путь, тем самым восстанавливая нормальный рост мутантов. Этот метод роста для этих конкретных мутантов SCV может быть использован в качестве метода скрининга для выявления пиримидиновых мутаций в образцах пациентов. Кроме того, мы обсуждаем два метода обнаружения и измерения альгината, произведенного и выделяемого P. aeruginosa. Первый метод14,15,16 деградации полисахарида с использованием высокой концентрации кислоты, а затем добавить колориметрический индикатор для количественной концентрации в образце. Второй метод, разработанный в нашей лаборатории, использует фермент-связанных иммуносорбента Ассей (ELISA) с использованием анти-альгината моноклональных антител (mAb), разработанных Зед Biosciences. Метод ELISA оказывается более конкретным и чувствительным, чем ассс ы уроническая кислота, и позволяет более безопасно использовать сяризне из-за избежания высококонцентрированной серной кислоты. С возможностью ELISA быть использованы непосредственно на образцы эмпухи пациента для измерения альгината, он может быть разработан в качестве мониторинга диагностический инструмент, чтобы следить за количество альгината присутствует в легких в разные периоды инфекции.

протокол

1. Условия роста SCV и физиологическая активация пути спасения

  1. Обнаружение SCV.
    1. Полоса P. aeruginosa штаммов PAO1, PAO1 йpyrD, PAO581, и PAO581й pyrD на предварительно разогретых Pseudomonas изоляции агар (PIA) пластин и расти при 37 кС для 48 ч. На пластине роста определить одну колонию изолировать, который имеет фенотип SCV (размер колонии 1'3 мм в отличие от нормального размера колонии 3'5 мм).
    2. Повторите шаг 1.1.1 для получения чистого изолята SCV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рост может потребовать до 72 ч из-за медленного темпа роста колоний SCV.
  2. Физиологическая активация спасительного пути.
    1. Используя стерильную петлю прививки, выберите колонию SCV из пластины PIA и проликна на предварительно разогретом PIA, дополненном 0,1 мМ урацила. Выращивайте тарелку при 37 градусах по Цельсию при 24-48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все пластины PIA, используемые в этом протоколе, содержат 20 мл/л глицерола, добавленного в смесь перед автоклавированием. После автоклавирования и после смешивания температура ниже 55 градусов по Цельсию добавить 11,21 мг/л uracil (0,1 мм) в жидкие носители перед заливкой пластин. Этот метод поможет определить пиримидин мутации, которые вызывают фенотип SCV в P. aeruginosa. Если фенотип SCV является результатом указанной мутации, то нормальный рост колонии и размер (3-5 мм) будет наблюдаться на урацил дополненных пластинPI. Если штаммы имели возможность производить альгинат, то фенотип слизистой оболочки также вернется после uracil добавок.

2. Уроновая кислота карбазола Ассей

  1. Из чистой культуры желаемого штамма, который необходимо проверить, определить одну колонию. Используя стерильную зубочистку, выберите колонию и поместите зубочистку в пробирку культуры, содержащую 5 мл бульона изоляции Pseudomonas (PIB). Выращивайте в шейкере-инкубаторе при 37 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие штаммы PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB, и PAO581pyrD были выращены на пластинах PIA или пластины PIA дополнены 0,1 мМ uracil для сбора алгината для измерения.
  2. На предварительно разогретую пластину PIA добавить 150 л культивированного бульона PIB (для 15 мм х 100 мм пластин) или 450 л бульона (для 15 мм х 150 мм пластин). Используя стерильный распределитель клеток, распределите бульон по тарелке. Выращивайте тарелку при 37 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирируйте любую лишнюю жидкость, если таковые имеется, из пластины с помощью трубки, опрокидывая пластину в одну сторону. Оба PIB и PIA пластины, используемые в протоколе содержат 20 мл / л глицерола для использования клетками в качестве источника углерода для оказания помощи в альгинатной продукции.
  3. Используя контроллер пипетки и стерильный 50 мл пипетки, добавить 0,85% NaCl на газон выросли и собирать образец, слом пластины с помощью распределителя клеток. Приготовьте образец, используя свежий трубку 50 мл в трубку для сбора 50 мл. Vortex образец на высоком, чтобы смешать и поместить образцы на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавленных 0,85% NaCl варьируется в зависимости от размера пластины. Для 15 мм х 100 мм пластин, использовать 10-30 мл, а для 15 мм х 150 мм пластин, использовать 20-50 мл.
  4. Измерьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600) образцов, добавив 1 мл образца в одноразовый квет и считывая ОД с помощью спектрофотометра. Повторите этот шаг 2x, чтобы получить тройной считывания для каждого образца.
  5. Добавьте 3 мл раствора серной кислоты/бората в культурные трубки и дайте сидеть на льду. Добавьте 350 л собранного образца SLOWLY в кислотную смесь в пробирках и вихре на низком кратковременном.
    1. Приготовьте бульон боратом, добавив 10,099 г порошка гидроксида калия (KOH) до 45 мл воды. Добавьте 24,74 г борной кислоты (H3BO3)в смесь и доведите объем до 100 мл.
    2. Поместите 1 л бутылки в раковину со льдом и заполните бутылку 500 мл концентрированной серной кислоты. SLOWLY добавить 15 мл подготовленного бульона борате. Дайте бутылке остыть.
    3. Добавьте еще 10 мл бульона бората на общую сумму 25 мл. После охлаждения бутылки доведите объем до 1 л.
      ПРЕДЕКТО: Этот метод опирается на использование высококонцентрированной серной кислоты. Надлежащее индивидуальное защитное оборудование должно использоваться для обеспечения безопасности и надлежащего протокола удаления образца должны соблюдаться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для положительного контроля известная концентрация D-маннуриновой кислоты и/или известных бактериальных альгината образцов, собранных и очищенных через альгинат, производящие штаммы P. aeruginosa (например: PAO581-PAO1mucA25). Для отрицательного контроля используйте 0,85% раствор NaCl и/илиPAO1'algD (в кадре удаление гена algD, что делает бактерии полностью не способными производить альгинат). Несколько труб может быть сделано из каждой выборки, чтобы увеличить количество технических повторов, чтобы помочь в статистическом анализе. Подготовьте 3-5 трубок каждого образца.
  6. Добавьте 100 л карбазала в раствор этанола в кислотно-образную смесь. Крышка трубки и вихря на средней настройки в течение 5 с. Поместите в сухую ванну при 55 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  7. После инкубации, удалить трубки и вихрь кратко на высоком и дать остыть в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет, который будет рассматриваться будет оттенок фиолетового. Цвет останется стабильным для измерения в течение 1 х 2 ч.
  8. Прочитайте OD530 каждой трубки, добавив 1 мл смеси в чистый кювет и считывая OD образцов на 530 нм на спектрофотометре. Используйте трубку с 0,85% NaCl в качестве пробела для спектрофотометра.
  9. Подготовьте стандартную кривую путем измерения OD530 серийных разбавлений известных концентраций D-Маннуроновой кислоты (1024 мкг/мл, 512 мкг/мл, 256 мкг/мл, 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл и 8 м/мл). Повторите 2x. Извлеките линейное уравнение из этих показаний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая должна быть сделана только один раз. Линейное уравнение, извлеченное из него, может быть использовано для последующего тестирования.
    1. Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце, используя стандартную кривую, и разделите концентрацию альгината от линейного уравнения на OD600, чтобы получить общее количество альгината за OD600.

3. ELISA для кальгинатной квантитации

  1. Повторите шаги 2.1'2.4 для получения образцов для измерения альгината.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы, используемые были PAO1,PAO1'algD, и PAO1 проведения pHERD20T-algU.
  2. Используя микропипетт добавить 50 зл и л собранного образца в необработанную 96-колодую пластину. Добавьте в скважины 50 йл буфера покрытия (карбонат/бикарбонатный буфер pH 9.6). Инкубировать тарелку при 37 градусах по Цельсию на 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для положительного контроля можно использовать известную концентрацию D-маннуроновой кислоты и/или известного стабильного штамма, производящего альгинат (например, PAO581-PAO1mucA25). Для отрицательного контроля используйте 0,85% раствор NaCl и/илиPAO1'algD (в кадре удаление гена algD делает бактерии полностью неспособными производить альгинат). Из каждой выборки можно сделать несколько скважин, с тем чтобы увеличить число технических повторов для оказания помощи в статистическом анализе. Подготовьте 3х5 скважин каждого образца.
  3. Используя бутылку шприца, мыть пластины скважин 2x с 1x фосфат буфера солей (PBS) с 0,05% Tween 20 (PBS-T) путем заполнения скважин, а затем слива их, перевернув пластины.
  4. Используя микропипетт добавить 200 л блокирующего буфера (10% обезжиренного молока в PBS-T) в скважинах. Инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оберните пластины в парафина пленки или уменьшить обертку, чтобы помочь избежать любого испарения в холодильнике.
  5. Использование шприц бутылку мыть пластины скважины 2x с PBS-T, заполнив скважины, а затем слива их листать пластины.
  6. Используя микропипетт добавить 100 qL разбавленного первичного антитела (мышь анти-альгинат моноклональных антител) в колодцы и инкубировать при 37 градусов по Цельсию для 1'2 h.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные антитела (мышь анти-альгинат моноклональных антител) была предоставлена в концентрации 0,5 мкг/мл (разбавление 1:2,000 1 мг/мл бульона) в разбавительных антителах раствор (1% обезжиренного молока в 1x PBS).
  7. Использование шприц бутылку мыть пластины скважин3x с PBS-T, заполнив скважины, а затем слива их листать пластины.
  8. Используя микропипетт добавить 100 л разбавленных вторичных антител в скважины и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 1х2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела, используемые был проколоть козла анти-мышь поли-HRP антитела до концентрации 0,25 мкг/мл (разбавление 1:2,000 0,5 мг/мл запасов) в антитела разбавлятельного раствора.
  9. Использование шприц бутылку мыть пластины скважин3x с PBS-T, заполнив скважины, а затем слива их листать пластины.
  10. Используя микропипетт, добавьте 100 л раствора TMB-ELISA(Таблица материалов)и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет положительной реакции будет оттенок синего цвета.
  11. Используя микропипетт, добавьте 100 л стоп-раствора (2 N серной кислоты).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет превратится из синего в желтый, когда будет добавлен стоп-решение. Цвет стабилен до 30 мин после того, как реакция остановлена.
  12. Используя считыватель пластин, прочитайте OD на 450 nm.
  13. Производить стандартную кривую путем измерения OD450 серийных разбавлений известных концентраций D-Маннуроновой кислоты (1024 мкг/мл, 512 мкг/мл, 256 мкг/мл, 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл, и 8 м/мл). Повторите 2x. Из этих показаний извлекаем линейное уравнение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая должна быть выполнена только один раз. Линейное уравнение, извлеченное из него, может быть использовано для последующего тестирования.
    1. Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце, используя стандартную кривую, и разделите концентрацию альгината от линейного уравнения на OD600, чтобы получить общее количество альгината за OD600.

4. Статистический анализ алгината

  1. В графическом программном листе установите столбец с линейным уравнением, полученным из стандартной кривой. Установите результаты y-оси как концентрация альгината и x-оси результаты как OD530 для анализа уроновой кислоты и OD450 для ELISA для того чтобы получить альгинат концентрации в каждом образце.
  2. Чтобы нормализовать количество альгината в каждой выборке на сумму 5,5 x108 CFU/mL (1 OD600),разделить концентрацию каждой выборки, полученной выше, по его соответствующей стоимости OD600. Если для каждой выборки было измерено несколько OD600, разделите на средний OD600.
  3. Проведение статистического анализа с использованием предпочтительного статистического программного обеспечения (например, GraphPad Prism 7.02).
  4. Откройте программное обеспечение. Выберите колонку под новой таблицей и графиком и выберите односторонний набор данных ANOVA.
  5. Назовите каждый столбец проверенным штаммом и добавьте под ним альгинатные концентрации.
  6. После ввода всех данных нажмите на Анализ в верхнем меню. Это откроет окно параметров анализа. Выберите подходящие параметры для тестирования и укажите, нужно ли проводить несколько сравнений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После анализа набор данных будет содержать p-значение, которое поможет определить статистическую значимость данных. Данные будут считаться статистически значимыми, если значение p-значение меньше установленного значения (обычно значение устанавливается для p slt; 0.01).
  7. Под вкладкой графика выберите тип Бар Граф. Это автоматически наметит данные с указанным заголовком из листа входных данных. Укажите статистическую значимость данных по мере необходимости, показывая символ q над соединительными линиями между барами интереса.

Результаты

На рисунке 1 показаны пластины PAO1 и PAO581 с или без удаления в кадре гена пирд (ген в пути биосинтеза пиримидина), что приводит к SCV6. Пао1 SCV мутант был восстановлен в нормальном росте в ответ на урацил добавок(Рисунок 1A,B...

Обсуждение

Оба SCV и альгинат являются важными маркерами болезни, причастных к нескольким хроническим инфекциям. Таким образом, способность расти SCV, а также изучить регулирование и производство альгината P. aeruginosa является неотъемлемой частью открытия новых методов лечения этих хронических з?...

Раскрытие информации

Автор Hongwei D. Yu является главным научным сотрудником и соучредителем Progenesis Technologies, LLC.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты R44GM113545 и P20GM103434.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Step Ultra TMB-ELISAThermo Scientific34028via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)Fisher ScientificBP2818-4Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry BathLabnetNC0205808via Fisher Scientific
Assay Plates 96-wellCoStar2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2Scientific IndustriesG560
Boric AcidResearch Products International Corp.10043-35-3
Cabinet IncubatorVWR1540
CarbazoleSigmaC-5132
Carbonate-Bicarbonate BufferSigmaC3041
Centrifuge Tubes (50 mL)Fisher Scientific05-539-13via Fisher Scientific
Culture Test TubesFisher Scientific14-956-6Dvia Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 mL)Fisher Scientific14955127via Fisher Scientific
CytosineAcros Organics71-30-7
Diposable Inoculation LoopsFisher Scientific22-363-597
D-Mannuronic Acid SodiumSigma AldrichSMB00280
FMC AlginateFMC2133
GlycerolFisher ScientificBP906-5For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal AntibodyQED BiosciencesN/ALot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)SigmaP3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP AntibodyThermo Scientific32230via Fisher Scientific
Potassium HydroxideFisher Scientific1310-58-3via Fisher Scientific
Prism 7GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)Difco292710via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB)Alpha BiosciencesP16-115via Fisher Scientific
Round ToothpicksDiamondAny brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133)FMC Corporation
Skim MilkDifco232100via Fisher Scientific
SmartSpec Plus SpectrophotometerBioRad170-2525or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl)SigmaS-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate ReaderMolecular Devicesi3xor preferred vendor
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875713via Fisher Scientific
Sulfuric AcidFisher ScientificA298-212Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)R&D SystemsDY994
Tween 20SigmaP2287
UracilAcros Organics66-22-8

Ссылки

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
  2. Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
  3. Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
  4. Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
  5. Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
  6. Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
  7. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
  8. Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
  9. Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
  10. Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
  11. Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
  12. Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
  13. Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
  14. Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
  15. Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
  16. Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156Pseudomonas aeruginosaCFSCVmAbELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены