Cultura della piccola colonia Variante di Pseudomonas aeruginosa e Quantitazione del suo Alginato

Riepilogo

Qui, descriviamo una condizione di crescita alla cultura la piccola variante colonia di Pseudomonas aeruginosa. Descriviamo anche due metodi distinti per il rilevamento e la quantificazione dell'algerino exopolysaccharide prodotto da P. aeruginosa utilizzando un tradizionale saggio di carbazole di acido uronico e un anticorpo monoclonale specifico algerino (mAb) a base di ELISA.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa, un patogeno batterico Gram-negativo opportunistico, può sovraprodurre un algiato esopolisaccare risultante in un fenotipo unico chiamato mucoidy. L'alginato è collegato a infezioni polmonari croniche con conseguente prognosi infagnata in pazienti con fibrosi cistica (CF). Comprendere i percorsi che regolano la produzione di alginato può aiutare nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate alla formazione altata. Un altro fenotipo correlato alla malattia è la variante della piccola colonia (SCV). SCV è dovuto alla lenta crescita di batteri e spesso associato ad una maggiore resistenza agli antimicrobici. In questo articolo, mostriamo per la prima volta un metodo per coltivare una forma geneticamente definita di P. aeruginosa SCV a causa di mutazioni della biosintesi pirimofina. Il completamento di basi azotate, uracil o citosina, restituisce la normale crescita a questi mutanti, dimostrando la presenza di un percorso di recupero che sbircia basi libere dall'ambiente. Successivamente, discutiamo due metodi per la misurazione dell'alginato batterico. Il primo metodo si basa sull'idrolisi del polisaccharide al suo monomero acido uronico seguito dalla derivazione con un reagente cromogenico, il carbazole, mentre il secondo metodo utilizza un ELISA basato su un mAb commercialmente disponibile, specifico per algerino. Entrambi i metodi richiedono una curva standard per la quantificazione. Dimostriamo anche che il metodo immunologico è specifico per la quantificazione alginata e può essere utilizzato per la misurazione dell'alginato nei campioni clinici.

Introduzione

Le infezioni polmonari croniche con Pseudomonas aeruginosa sono una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti con fibrosi cistica (CF). Durante la prima infanzia, i pazienti sono colonizzati da più patogeni batterici tra cui isolati non mucoidi di P. aeruginosa^1,2. L'emergere della variante della piccola colonia (SCV) isola così come gli isolati mucoidi è un marcatore per l'insorgenza delle infezioni croniche. Gli isolati di SCV sono altamente resistenti ai farmaci³ a causa dei loro lenti tassi di crescita⁴, il che li rende un grave deterrente nei reggimenti di trattamento e altre infezioni croniche⁵ da P. aeruginosa. Il lavoro di Al Ahmar et al.⁶ ha mostrato un legame tra SCV e mucoidy collegato dalla biosintesi della pirimofina de novo. La fame di pirimidine, a causa di mutazioni nei geni coinvolti nella produzione di pirimidine, ha portato al fenotipo SCV nel ceppo di riferimento non mucoide PAO1 e alla derivata mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).

Anche se la sovrapproduzione algerata è un importante marcatore di malattia per le infezioni polmonari croniche nella CF, non è chiaro se esista una correlazione diretta tra la quantità di patologia alginata e polmonare, e non è chiaro se l'alginato possa essere utilizzato come marcatore di prognosi per il trattamento⁷. La produzione di alginati è regolata principalmente da due operoni, un operone normativo (algUmucABCD)^8,9 e l'operone biosintetico ( operonealgD) ^10,11. La produzione di algerino è strettamente regolata dal fattore sigma AlgU^9,12 (noto anche come AlgT) e dalla degradazione del fattore anti-sigma MucA¹³. La capacità di monitorare la produzione di algerino in situ dai campioni di espettorato dei pazienti può aiutare nello sviluppo di nuove opzioni terapeutiche.

Qui, descriviamo una condizione di crescita che rileva la presenza di SCV causata da mutanti che non possono sintetizzare la pirimidine de novo. Il completamento dell'uracile e/o della citosina, la base azotata del nucleotide pirimidine, a medio attiva il percorso di recupero, ripristinando così la normale crescita nei mutanti. Questo metodo di crescita per questi specifici mutanti SCV può essere utilizzato come metodo di screening per identificare le mutazioni della pirimofina nei campioni di pazienti. Inoltre, discutiamo due metodi per il rilevamento e la misurazione di alginato prodotto e secreto da P. aeruginosa. Il primo è il metodo tradizionale^14,15,16 di degradare il polisaccaluro utilizzando un'alta concentrazione di acido e quindi l'aggiunta di un indicatore colorimetrico per quantificare la concentrazione nel campione. Il secondo metodo, sviluppato nel nostro laboratorio, utilizza l'ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) utilizzando un anticorpo monoclonale anti-alginato (mAb) sviluppato da QED Biosciences. Il metodo ELISA si dimostra più specifico e sensibile rispetto all'acido uronico e consente un uso più sicuro a causa dell'evitamento dell'acido solforico altamente concentrato. Con la capacità dell'ELISA di essere utilizzato direttamente su campioni di espettorato del paziente per misurare l'alginato, può essere sviluppato come strumento diagnostico di monitoraggio per seguire la quantità di alginato presente nei polmoni in diversi periodi dell'infezione.

Protocollo

1. Condizioni di crescita SCV e attivazione fisiologica del percorso di salvataggio

1. Rilevamento di SCV.
   1. Streak il P. aeruginosa ceppi PAO1, PAO1pyrD, PAO581, e PAO581pira su preriscaldato Pseudomonas agar (PIA) e crescere a 37 gradi centigradi per 48 h. Sulla piastra di crescita identificare un singolo isolato colonia che ha il fenotipo SCV (dimensione della colonia di 1,3 mm in contrapposizione alla dimensione normale della colonia 3-5 mm).
   2. Ripetere il passaggio 1.1.1 per ottenere un isolamento puro dell'SCV.
      NOTA: La crescita può richiedere fino a 72 h a causa del lento tasso di crescita delle colonie SCV.
2. Attivazione fisiologica del percorso di recupero.
   1. Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, scegliere la colonia SCV dalla piastra PIA e striscia su un PIA preriscaldato integrato con 0,1 mM di uracil. Coltivare la piastra a 37 gradi centigradi per 24-48 h.
      NOTA: Tutte le piastre PIA utilizzate in questo protocollo contengono 20 mL/L di glicerolo aggiunto alla miscela prima dell'autoclaving. Dopo l'autoclaving e dopo la temperatura della miscela è inferiore a 55 gradi centigradi aggiungere 11,21 mg/L di uracil (0,1 mM) al supporto liquido prima di versare le piastre. Questo metodo aiuterebbe a identificare le mutazioni della pirimine che causano il fenotipo SCV in P. aeruginosa. Se il fenotipo SCV è il risultato di tale mutazione, allora la crescita e le dimensioni normali della colonia (3-5 mm) sarebbero osservate sulle placche PIA integrate in uracil. Se i ceppi hanno avuto la capacità di produrre alginato, allora il fenotipo mucoide tornerà anche al completamento dell'uracile.

2. Acido uronico Carbazole Assay

1. Da una cultura pura di ceppo desiderato da testare, identificare una singola colonia. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, raccogliere la colonia, e posizionare lo stuzzicadenti in una provetta di coltura contenente 5 mL di brodo di isolamento Pseudomonas (PIB). Coltivare in un'incubatrice di agitatori a 37 gradi centigradi per 24 ore.
   NOTA: I ceppi seguenti PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carBe PAO581pyrD sono stati coltivati su piastre PIastre PIgrecola o piastre PIA integrate con 0,1 mm di uracil per raccogliere l'onninata per la misurazione.
2. Su una piastra PIA preriscaldata aggiungere 150 l of brodo PIB coltivato (per piastre da 15 mm x 100 mm) o 450 L di brodo (per piastre da 15 mm x 150 mm). Utilizzando uno spalmatore a cellule sterili, stendere il brodo sulla piastra. Far crescere la piastra a 37 gradi centigradi per 24 ore.
   NOTA: Aspirare qualsiasi liquido in eccesso, se presente, dalla piastra utilizzando un tubo, ribaltando la piastra da un lato. Sia piastre PIB che PIA utilizzate nel protocollo contengono 20 mL/L di glicerolo da utilizzare nelle cellule come fonte di carbonio per aiutare nella produzione di alginato.
3. Utilizzando un controller pipetta e una pipetta sterile da 50 mL, aggiungere lo 0,85% NaCl al prato coltivato e raccogliere il campione rottamando la piastra utilizzando uno spalmatore cellulare. Aspirare il campione utilizzando un tubo fresco da 50 mL in un tubo di raccolta da 50 mL. Vortice il campione in alto per mescolare e posizionare i campioni sul ghiaccio.
   NOTA: Il volume di aggiunta 0.85% NaCl varia a seconda delle dimensioni della piastra. Per piastre da 15 mm x 100 mm, usate 10 x 30 mL e per piastre da 15 mm x 150 mm, usate 20-50 mL.
4. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) dei campioni aggiungendo 1 mL del campione a una cuvette usa e getta e leggendo l'OD utilizzando uno spettrofotometro. Ripetere questo passaggio 2x per ottenere un triplice di letture per ogni campione.
5. Aggiungere 3 mL della soluzione acido solforico/borate in tubi di coltura e lasciare slearvi sul ghiaccio. Aggiungere brevemente 350 l del campione raccolto SLOWLY alla miscela di acido nelle provette e nel vortice.
   1. Preparare lo stock di borate aggiungendo 10.099 g di polvere di idrossido di potassio (KOH) a 45 mL di acqua. Aggiungere 24,74 g di acido borico (H₃BO₃) alla miscela e portare il volume a 100 mL.
   2. Mettere 1 bottiglia l in un lavandino con ghiaccio e riempire la bottiglia con 500 mL di acido solforico concentrato. SLOWLY aggiungere 15 mL del brodo di borate preparato. Lasciar raffreddare la bottiglia.
   3. Aggiungere altri 10 mL di brodo di bollatura per un totale di 25 mL. Una volta raffreddata la bottiglia, portare il volume a 1 L.
      AMMONIMento: Questo metodo si basa sull'uso di acido solforico altamente concentrato. Devono essere utilizzati dispositivi di protezione personale adeguati per garantire la sicurezza e il corretto protocollo di smaltimento del campione.
      NOTA: Per un controllo positivo una concentrazione nota di acido -mannuronico notoe/o un noto campione di algerato batterico raccolto e purificato attraverso ceppi altonati che producono P. aeruginosa (ad esempio: PAO581-PAO1mucA25). Per un controllo negativo utilizzare 0.85% soluzione NaCl e/oPAO1 algD (In-frame deletion del gene algD che rende i batteri completamente in grado di produrre algerino). Da ogni campione possono essere realizzati più tubi per aumentare il numero di ripetizioni tecniche per facilitare l'analisi statistica. Preparare 3/5 tubi di ogni campione.
6. Aggiungere 100 l di 0,1% di carbazolo in soluzione di etanolo al mix acido/campione. Far fronteal tubo e vortice su un'impostazione media per 5 s. Mettere in un bagno asciutto a 55 gradi centigradi per 30 min.
7. Dopo l'incubazione, rimuovere i tubi e il vortice brevemente in alto e lasciare raffreddare per 5 min.
   NOTA: Il colore da vedere sarebbe una tonalità di viola. Il colore rimarrà stabile per la misurazione per 1/2 h.
8. Leggere l'OD₅₃₀ di ogni tubo aggiungendo 1 mL della miscela a una cuvette pulita e leggendo l'OD dei campioni a 530 nm su uno spettrometro. Utilizzare il tubo con 0.85% NaCl come uno spettrobianco bianco per lo spettrofotometro.
9. Preparare una curva standard misurando l'OD₅₃₀ di diluizioni seriali di concentrazioni note di acido D-Mannuronico (1.024 g/mL, 512 g/mL, 256 g/mL, 128 g/mL, 64 g/mL, 32 g/mL, 16 g/mL, 16 g/mL e 8 g/mL). Ripetere 2x. Estrarre un'equazione lineare da queste letture.
   NOTA: la curva standard deve essere eseguita una sola volta. L'equazione lineare estratta da essa può essere utilizzata per test successivi.
   1. Calcolare la concentrazione dell'alginato in ogni campione utilizzando la curva standard e dividere la concentrazione algerata dall'equazione lineare per OD₆₀₀ per ottenere la quantità totale di alginato per OD₆₀₀.

3. ELISA per Quantitazione Alginata

1. Ripetere i passaggi di 2,1 x 2,4 per ottenere i campioni per la misurazione altnata.
   NOTA: ceppi utilizzati sono stati PAO1, PAO1algDe PAO1 che trasportano pHERD20T-algU.
2. L'utilizzo di una micropipetta aggiungerà 50 l di l del campione raccolto a una piastra di 96 pozze non trattata. Aggiungere 50 l di tampone di rivestimento (carbonato/bicarbonato tampone pH 9,6) ai pozze. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 2 h.
   NOTA: Per un controllo positivo, può essere utilizzata una concentrazione nota diacido -mannuronico e/o un ceppo stabile noto di produzione di algerati (ad esempio: PAO581-PAO1mucA25). Per un controllo negativo utilizzare 0.85% soluzione NaCl e/oPAO1 algD (delezione in-frame del gene algD rende i batteri completamente in grado di produrre qualsiasi algnato). Da ogni campione è possibile fare più pozze da ogni campione per aumentare il numero di ripetizioni tecniche per facilitare l'analisi statistica. Preparate 3/5 pozze di ogni campione.
3. Utilizzando una bottiglia di schizzo, lavare i pozzetti 2x con 1x fosfato buffer salina (PBS) con 0.05% Tween 20 (PBS-T) riempiendo i pozzetti, e poi drenandoli capovolgendo la piastra.
4. Utilizzando una micropipetta aggiungere 200 - L di tampone di blocco (10% latte scremato in PBS-T) ai pozzi. Incubare a 4 gradi centigradi.
   NOTA: Avvolgere la piastra nella pellicola di paraffina o avvolgere per evitare qualsiasi evaporazione in frigorifero.
5. Utilizzando una bottiglia di schizzo lavare i pozzetti 2x con PBS-T riempiendo i pozzetti, e poi drenandoli capovolgendo piastra sopra.
6. L'uso di una micropipetta aggiunge rà 100 l' di anticorpo primario diluito (anticorpo monoclonale anti-algerito di topo) ai pozzi e incuba a 37 gradi centigradi per 1/2 h.
   NOTA: l'anticorpo primario (anticorpo monoclonale anti-algerino del topo) è stato fornito ad una concentrazione di 0,5 g/mL (diluizione di 1:2,000 di 1 mg/mL di stock) in soluzione diluente anticorpale (1% di latte scremato in 1x PBS).
7. Utilizzando una bottiglia di schizzo lavare i pozzetti 3x con PBS-T riempiendo i pozzetti, e poi drenandoli capovolgendo piastra sopra.
8. L'uso di una micropipetta aggiungete 100 l'anticorpo secondario diluito ai pozzi e incubate a 37 gradi centigradi per 1/2 h.
   NOTA: l'anticorpo secondario utilizzato era l'anticorpo poli-HRP della capra perforata ad una concentrazione di 0,25 g/mL (diluizione di 1:2.000 di 0,5 mg/mL) in soluzione diluente anticorpale.
9. Utilizzando una bottiglia di schizzo lavare i pozzetti 3x con PBS-T riempiendo i pozzetti, e poi drenandoli capovolgendo piastra sopra.
10. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 100 -L di soluzione TMB-ELISA (Table of Materials) e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
    NOTA: Il colore di una reazione positiva sarebbe una tonalità di blu.
11. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 100 l di soluzione di arresto (2 N acido solforico).
    NOTA: il colore diventa di colore blu a giallo quando viene aggiunta la soluzione di arresto. Il colore è stabile fino a 30 min dopo l'interruzione della reazione.
12. Utilizzando un lettore di lastre, leggere l'OD a 450 nm.
13. Produrre una curva standard misurando l'OD₄₅₀ di diluizioni seriali di concentrazioni note di acido D-Mannuronico (1.024 g/mL, 512 g/mL, 256 g/mL, 128 g/mL, 64 g/mL, 32 g/mL, 16 g/mL, 16 g/mL e 8 g/mL). Ripetere 2x. Da queste letture estrae un'equazione lineare.
    NOTA: la curva standard deve essere eseguita una sola volta. L'equazione lineare estratta da essa può essere utilizzata per test successivi.
    1. Calcolare la concentrazione dell'alginato in ogni campione utilizzando la curva standard e dividere la concentrazione algerata dall'equazione lineare per OD₆₀₀ per ottenere la quantità totale di alginato per OD₆₀₀.

4. Analisi statistica della misurazione algerata

1. In un foglio software grafico, impostare una colonna con l'equazione lineare derivata dalla curva standard. Impostare i risultati dell'asse y come concentrazione algerata e i risultati dell'asse x come OD₅₃₀ per il test dell'acido uronico e l'OD₄₅₀ affinché ELISA ottenga le concentrazioni altanate in ogni campione.
2. Per normalizzare la quantità di algerino in ogni campione per la quantità per 5,5 x10⁸ CFU/mL (1 OD₆₀₀), dividere la concentrazione di ogni campione ottenuto sopra per il rispettivo valore OD_600. Se sono stati misurati più OD₆₀₀ per ogni campione, dividere per la media OD₆₀₀.
3. Eseguire analisi statistiche utilizzando il software statistico preferito (ad esempio, GraphPad Prism 7.02).
4. Aprire il software. Scegliere Colonna in Nuova tabella e grafico e scegliere il set di dati ANOVA unidirezionale.
5. Assegnare un nome a ogni colonna con il ceppo testato e aggiungere le concentrazioni altnate sottostanti.
6. Dopo aver inserimento tutti i dati clicca su Analizza nel menu in alto. Si aprirà una finestra delle impostazioni di analisi. Scegliere i parametri appropriati per il test e indicare se è necessario eseguire più confronti.
   NOTA: dopo l'analisi il set di dati conterrà un valore p che contribuirebbe a determinare la rilevanza statistica dei dati. I dati verrebbero considerati statisticamente significativi se il valore di p è minore del valore impostato di z (in genere il valore è impostato per p < 0,01).
7. Nella scheda Grafico scegliere il tipo grafico a barre. Questo graficorà automaticamente i dati con il titolo indicato dal foglio dati di input. Indicare la significatività statistica dei dati in base alle esigenze mostrando il simbolo di cancelletto sopra le linee connettive tra le barre di interesse.

Risultati

La figura 1 mostra piastre di PAO1 e PAO581 con o senza delezione in-frame nel gene pyrD (un gene nel percorso di biosintesi pirimidina) che si traduce in SCV⁶. Il mutante PAO1 SCV è stato riportato alla normale crescita in risposta al completamento dell'uracile (Figura 1A,B). Inoltre, il mutanteSCVPAO581 è stato restituito alla mucoidy con lo stesso trattamento dell'ur...

Discussione

Sia SCV che algerato sono importanti marcatori di malattia implicati in diverse infezioni croniche. Pertanto, la capacità di far crescere sCV e di studiare la regolazione e la produzione di alginato da P. aeruginosa è parte integrante della scoperta di nuovi trattamenti per queste malattie croniche.

I ceppi DiCV sono notoriamente difficili da coltivare a causa del loro tasso di crescita lento⁴ rispetto ad altri ceppi P. aeruginosa, che aiuta nella lo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028	via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Assay Plates 96-well	CoStar	2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2	Scientific Industries	G560
Boric Acid	Research Products International Corp.	10043-35-3
Cabinet Incubator	VWR	1540
Carbazole	Sigma	C-5132
Carbonate-Bicarbonate Buffer	Sigma	C3041
Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	05-539-13	via Fisher Scientific
Culture Test Tubes	Fisher Scientific	14-956-6D	via Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 mL)	Fisher Scientific	14955127	via Fisher Scientific
Cytosine	Acros Organics	71-30-7
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
D-Mannuronic Acid Sodium	Sigma Aldrich	SMB00280
FMC Alginate	FMC	2133
Glycerol	Fisher Scientific	BP906-5	For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody	QED Biosciences	N/A	Lot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)	Sigma	P3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody	Thermo Scientific	32230	via Fisher Scientific
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	1310-58-3	via Fisher Scientific
Prism 7	GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)	Difco	292710	via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB)	Alpha Biosciences	P16-115	via Fisher Scientific
Round Toothpicks	Diamond		Any brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133)	FMC Corporation
Skim Milk	Difco	232100	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	BioRad	170-2525	or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma	S-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader	Molecular Devices	i3x	or preferred vendor
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	via Fisher Scientific
Sulfuric Acid	Fisher Scientific	A298-212	Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)	R&D Systems	DY994
Tween 20	Sigma	P2287
Uracil	Acros Organics	66-22-8