JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, pseudomonas aeruginosaküçük koloni varyantı kültüre bir büyüme durumu açıklar. Ayrıca p. aeruginosa tarafından üretilen eksopolisakkarit aljinatının saptanması ve nicelliği için geleneksel üronik asit karbazol testi ve aljinatspesifik monoklonal antikor (mAb) bazlı ELISA kullanılarak iki ayrı yöntem tanımlanmıştır.

Özet

Pseudomonas aeruginosa, fırsatçı gram-negatif bakteriyel patojen, mucoidy denilen benzersiz bir fenotip sonuçlanan bir eksopolisakkarit aljinat aşırı üretebilir. Aljinat kistik fibrozis (CF) olan hastalarda kötü prognoz ile sonuçlanan kronik akciğer enfeksiyonları ile bağlantılıdır. Aljinat üretimini düzenleyen yolların anlaşılması, aljinat oluşumunu hedefleyen yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Hastalığa bağlı bir diğer fenotip ise küçük koloni varyantıdır (SCV). SCV bakterilerin yavaş büyüme nedeniyle ve genellikle antimikrobiyallere karşı artan direnç ile ilişkilidir. Bu yazıda ilk olarak pimimidin biyosentez mutasyonlarına bağlı olarak genetik olarak tanımlanmış p. aeruginosa SCV formunu niçin bir yöntem gösterdik. Azotlu bazların takviyesi, urasil veya sitozin, bu mutantlar için normal büyüme döner, çevreden serbest üsleri temizler bir kurtarma yolu varlığını gösteren. Daha sonra, bakteriyel aljinat ölçümü için iki yöntem tartışmak. İlk yöntem, polisakkaritin hidrolizine, üronik asit monomerine dayanır ve ardından kromojenik reaktif, karbazol ile türevleştirme yapılır, ikinci yöntem ise ticari olarak kullanılabilir, aljinat özgü mAb'ye dayalı bir ELISA kullanır. Her iki yöntem de nicellik için standart bir eğri gerektirir. Ayrıca immünolojik yöntemin aljinat ölçümü için spesifik olduğunu ve klinik örneklerde aljinat ölçümü için kullanılabileceğini de göstermektedir.

Giriş

Pseudomonas aeruginosa ile kronik akciğer enfeksiyonları kistik fibrozis (CF) olan hastalarda morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Erken çocukluk döneminde, hastalar P. aeruginosanonmucoid izole dahil olmak üzere birden fazla bakteriyel patojenler tarafından kolonize edilir1,2. Küçük koloni varyantının (SCV) ortaya çıkması izole yanı sıra mukoid izole kronik enfeksiyonlara başlangıç için bir belirteçtir. SCV izole son derece ilaca dirençli3 yavaş büyüme oranlarınedeniyle 4, hangi onları tedavi alayları ve diğer kronik enfeksiyonlar da ciddi bir caydırıcı hale getirir5 P. aeruginosatarafından . Al Ahmar ve ark.6'nın çalışmaları, de novo pirimidin biyosentezi ile bağlantılı SCV ve mucoidy arasında bir bağlantı olduğunu gösterdi. Pirimidin açlık, pirimidin üretimi ile ilgili genlerde mutasyonlar nedeniyle, nonmucoid referans zorlanma PAO1 ve mukoid türevi SCV fenotip sonuçlandı, PAO581 (PAO1mucA25).

Aljinat overproduction CF kronik akciğer enfeksiyonları için önemli bir hastalık belirteci olmasına rağmen, aljinat ve akciğer patolojisi miktarı arasında doğrudan bir korelasyon olup olmadığı açık değildir, ve aljinat tedavi için bir prognoz belirteci olarak kullanılabilir olup olmadığı belirsizdir7. Aljinat üretimi esas olarak iki operon, düzenleyici operon(algUmucABCD)8,9 ve biyosentetik operon(algD operon)10,11tarafından düzenlenir. Aljinat üretimi sıkıca sigma faktörü AlgU9tarafından düzenlenir9 ,12 (ayrıca AlgT olarak da bilinir) ve anti-sigma faktörü MucA13bozulması . Hastaların balgam örneklerinden aljinat in in in üretimini izleyebilme yeteneği yeni tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Burada, pirimidin de novo sentezleyemeyen mutantların neden olduğu SCV varlığını tespit eden bir büyüme durumunu tanımlıyoruz. Urasil ve/veya sitozin takviyesi, pirimidin nükleotitinin azotlu tabanı, kurtarma yolunu aktive eder, böylece mutantlarda normal büyümeyi geri sağlar. Bu spesifik SCV mutantları için bu büyüme yöntemi, hasta örneklerinde pirimidin mutasyonlarını belirlemek için bir tarama yöntemi olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, p. aeruginosatarafından üretilen ve salgılanan aljinat tespiti ve ölçümü için iki yöntem tartışmak. İlk geleneksel yöntem14,15,16 asit yüksek konsantrasyon kullanarak polisakkarit aşağılayıcı ve daha sonra örnek konsantrasyonu quantitate için bir kolorimetrik gösterge ekleyerek. Laboratuvarımızda geliştirilen ikinci yöntem, QED Biosciences tarafından geliştirilen anti-aljinat monoklonal antikor (mAb) kullanarak Enzime Bağlı İmmünosorbent Assay (ELISA) kullanılmaktadır. ELISA yöntemi üronik asit tizinden daha spesifik ve hassas olduğunu kanıtlar ve yüksek konsantrasyonlu sülfürik asitten kaçınma nedeniyle daha güvenli kullanım sağlar. ELISA'nın aljinat ölçmek için doğrudan hasta balgam örneklerinde kullanılabilme özelliği ile, enfeksiyonun farklı dönemlerinde akciğerlerde bulunan aljinat miktarını takip etmek için bir izleme tanı aracı olarak geliştirilebilir.

Protokol

1. SCV Büyüme Koşulları ve Kurtarma Yolu Fizyolojik Aktivasyonu

  1. SCV tespiti.
    1. P. aeruginosa suşları PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581 ve PAO581ΔpyrD önceden ısıtılmış Pseudomonas izolasyon agar (PIA) plakaları üzerinde çizgi ve 48 saat için 37 °C'de büyür. Büyüme plakası üzerinde SCV fenotip (normal 3−5 mm koloni boyutu aksine 1−3 mm koloni boyutu) olan tek bir koloni izole tanımlayın.
    2. SCV'nin saf bir yalıtımını elde etmek için adım 1.1.1'i tekrarlayın.
      NOT: SCV kolonilerinin yavaş büyüme hızı nedeniyle büyüme 72 saate kadar sürebilir.
  2. Kurtarma yolunun fizyolojik aktivasyonu.
    1. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, PIA plakasından SCV kolonisini seçin ve 0,1 mM urasil ile takviye edilmiş önceden ısınmış bir PIA üzerinde çizgi. 24−48 saat boyunca 37 °C'de plaka yetiştirin.
      NOT: Bu protokolde kullanılan tüm PIA plakaları otoklavlamadan önce karışıma eklenen 20 mL/L gliserol içerir. Otoklavlama dan sonra ve karışım sıcaklığı 55 °C'nin altında olduktan sonra plakaları dökmeden önce sıvı ortama 11.21 mg/L urasil (0.1 mM) ekleyin. Bu yöntem P. aeruginosaSCV fenotip neden pirimidin mutasyonları belirlenmesine yardımcı olacaktır. SCV fenotip mutasyonun bir sonucu ise, o zaman normal koloni büyüme ve boyutu (3−5 mm) urasil takviyeLI PIA plakaları üzerinde gözlenir. Suşları aljinat üretmek için yeteneği olsaydı, o zaman mukoid fenotip de urasil takviyesi üzerine dönecektir.

2. Üronik Asit Karbazol Asa

  1. Test edilmesi istenen suş saf bir kültürden, tek bir koloni belirlemek. Steril bir kürdan kullanarak, koloniyi seçin ve kürdanı 5 mL Pseudomonas izolasyon suyu (PIB) içeren bir kültür test tüpüne yerleştirin. 37 °C'de 24 saat boyunca bir çalkalayıcı kuluçka makinesinde büyüyün.
    NOT: Aşağıdaki suşları PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581karb, ve PAO581pyrD PIA plakaları veya PIA plakaları 0.1 mM urasil ile takviye ölçü için aljinat hasat yetiştirilen edildi.
  2. Önceden ısınmış bir PIA plakasının üzerine 150 μL kültürlü PIB suyu (15 mm x 100 mm plakalar için) veya 450 μL et suyu (15 mm x 150 mm plakalar için) ekleyin. Steril bir hücre dağıtıcıkullanarak, tabağın üzerine et suyu yayıldı. Plakayı 37 °C'de 24 saat uzlayın.
    NOT: Plakayı bir tarafa devirerek bir pipet kullanarak plakadan herhangi bir fazla sıvıyı aspire edin. Protokolde kullanılan PIB ve PIA plakaları, aljinat üretimine yardımcı olmak için hücreler tarafından karbon kaynağı olarak kullanılmak üzere 20 mL/L gliserol içerir.
  3. Bir pipet denetleyicisi ve steril 50 mL pipet kullanarak, yetiştirilen çim% 0.85 NaCl ekleyin ve bir hücre dağıtıcı kullanarak plaka hurdaya örnek toplamak. Numuneyi 50 mL'lik bir toplama borusuna taze 50 mL pipet kullanarak aspire edin. Karışımı ve buz üzerinde yer için yüksek üzerinde örnek Girdap.
    NOT: Eklenen %0,85 NaCl'nin hacmi plakanın boyutuna bağlı olarak değişir. 15 mm x 100 mm plakalar için 10−30 mL, 15 mm x 150 mm plakalar için 20−50 mL kullanın.
  4. Numunelerin 600 nm 'deki (OD600)optik yoğunluğunu tek kullanımlık bir cuvette numuneye 1 mL ekleyerek ve spektrofotometre kullanarak OD'yi okuyarak ölçün. Her örnek için okuma bir triplicate elde etmek için bu adımı 2x tekrarlayın.
  5. Kültür tüpleri içine sülfürik asit / borat çözeltisi 3 mL ekleyin ve buz üzerinde oturup sağlar. Toplanan numunenin 350 μL'sini test tüplerinde asit karışımına YAVAŞ çaekleyin ve kısa bir süre için girdap yapın.
    1. 45 mL suya 10.099 g potasyum hidroksit (KOH) tozu ekleyerek borat stokunu hazırlayın. Karışıma 24,74 g borik asit (H3BO3)ekleyin ve hacmi 100 mL'ye getirin.
    2. Buz ile bir lavaboya 1 L şişe yerleştirin ve konsantre sülfürik asit 500 mL ile şişe doldurun. YAVAŞ YAVAŞ hazırlanan borat stokunun 15 mL ekleyin. Şişenin soğumasını bekleyin.
    3. Toplam 25 mL için 10 mL daha borat stoğu ekleyin. Şişe soğuduktan sonra, hacmi 1 L'ye getirin.
      DİkKAT: Bu yöntem yüksek konsantrasyonda sülfürik asit kullanımına dayanır. Numunenin emniyetini sağlamak için uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır ve numunenin uygun bertaraf protokolüne uyulmalıdır.
      NOT: Pozitif kontrol için bilinen bir D-mannuronik asit konsantrasyonu ve/veya bilinen bakteriyel aljinat örnekleri p. aeruginosa suşları üreten aljinat yoluyla hasat ve saflaştırılmış (örneğin: PAO581-PAO1mucA25). Negatif kontrol için %0.85 NaCl çözeltisi ve/veya PAO1ΔalgD (bakterileri tamamen aljinat üretemeyen algD geninin çerçeve içi silinmesi) kullanın. İstatistiksel analize yardımcı olmak için teknik tekrar sayısını artırmak için her örnekten birden fazla tüp yapılabilir. Her numuneden 3−5 tüp hazırlayın.
  6. Asit/numune karışımına etanol çözeltisine 100 μL %0,1 karbazol ekleyin. 5 s. 55 °C'de 30 dk kuru bir banyoda yer için orta ayarda tüp ve girdap kaplayın.
  7. Kuluçkadan sonra tüpleri ve girdabı kısa bir süre yüksekten çıkarın ve 5 dk soğumaya bırakın.
    NOT: Görülecek renk mor bir gölge olacaktır. Renk 1−2 saat ölçüm için sabit kalır.
  8. Her tüpün OD530'unu temiz bir cuvette karışımı1 mL ekleyerek ve numunelerin OD'sini 530 nm'de spektrofotometrede okuyarak okuyun. Tüpü %0,85 NaCl ile spektrofotometreye boş olarak kullanın.
  9. D-Mannuronik asit (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL ve 8 g/mL) seri seyreltmelerinin OD530'u ölçerek standart bir eğri hazırlayın. Tekrar 2x. Bu okumalardan doğrusal bir denklem çıkar.
    NOT: Standart eğrinin yalnızca bir kez yapılması gerekir. Ondan çıkarılan doğrusal denklem daha sonra sınanması için kullanılabilir.
    1. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD 600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu doğrusal denklemden OD600 ilebölün.

3. Aljinat Quantitation için ELISA

  1. Aljinat ölçümü için numune almak için 2.1−2.4 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Kullanılan suşlar PAO1, PAO1ΔalgDve PAO1 pHERD20T taşıyan-algU.
  2. Mikropipet kullanarak, toplanan numunenin 50 μL'sini işlenmemiş 96 kuyuluk bir tabağa ekleyin. Kuyulara 50 μL kaplama tamponu (karbonat/bikarbonat tampon pH 9.6) ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Pozitif kontrol için bilinen bir D-Mannuronik asit konsantrasyonu ve/veya bilinen stabil aljinat üreten suşu (örneğin: PAO581-PAO1mucA25)kullanılabilir. Negatif kontrol için %0.85 NaCl çözeltisi ve/veya PAO1ΔalgD (algD geninin çerçeve içi silinmesi bakterileri herhangi bir aljinat üretemez hale getirir). İstatistiksel analize yardımcı olmak için teknik tekrar sayısını artırmak için her örnekten birden fazla kuyu yapılabilir. Her numuneden 3−5 kuyu hazırlayın.
  3. Fışkırtma şişesi kullanarak, kuyuları doldurarak %0,05 Ara 20 (PBS-T) ile 1x fosfat tamponsal salin (PBS) ile 2x plakayı yıkayın ve sonra tabağı ters çevirerek boşaltın.
  4. Mikropipet kullanarak kuyulara 200 μL bloke tamponu (PBS-T'de %10 yağsız süt) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Buzdolabında buharlaşmayı önlemek için plakayı parafin filmine sarın veya küçültün.
  5. Bir fışkırtma şişesi kullanarak kuyuları doldurarak pbs-T ile plaka kuyuları 2x yıkayın ve daha sonra plaka üzerinde çevirerek onları drenaj.
  6. Mikropipet kullanarak kuyulara 100 μL seyreltilmiş primer antikor (fare anti-aljinalmonodal antikor) ekleyin ve 37 °C'de 1−2 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    NOT: Primer antikor (fare anti-aljinat monoklonal antikor) 0.5 g/mL konsantrasyonunda (1 mg/mL stokun 1:2.000 seyreltilmesi) antikor dilüent çözeltisinde (1x PBS'de %1 yağsız süt) sağlandı.
  7. Bir fışkırtma şişesi kullanarak kuyuları doldurarak pbs-T ile 3x plaka kuyuları yıkayın ve daha sonra plaka üzerinde çevirerek onları drenaj.
  8. Mikropipet kullanarak kuyulara 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve 37 °C'de 1−2 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    NOT: Kullanılan sekonder antikor, antikor dilüent çözeltisinde 0.25 μg/mL konsantrasyonuna (0.5 mg/mL stokun 1:2.000 seyreltilmesi) delen keçi anti-fare poli-HRP antikoruydu.
  9. Bir fışkırtma şişesi kullanarak kuyuları doldurarak pbs-T ile 3x plaka kuyuları yıkayın ve daha sonra plaka üzerinde çevirerek onları drenaj.
  10. Mikropipet kullanarak, 100 μL TMB-ELISA çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    NOT: Olumlu bir tepkinin rengi mavinin tonu olacaktır.
  11. Bir mikropipet kullanarak, 100 μL stop çözeltisi (2 N sülfürik asit) ekleyin.
    NOT: Durdurma çözeltisi eklendiğinde renk maviden sarıya döner. Reaksiyon durdurulduktan sonra renk 30 dakikaya kadar sabittir.
  12. Bir plaka okuyucu kullanarak, 450 nm de OD okuyun.
  13. D-Mannuronik asit (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL ve 8 g/mL) bilinen seri seyreltmelerin OD450'sini ölçerek standart bir eğri üretin. Tekrar 2x. Bu okumalardan doğrusal bir denklem çıkar.
    NOT: Standart eğrinin yalnızca bir kez yapılması gerekir. Ondan çıkarılan doğrusal denklem daha sonra sınanması için kullanılabilir.
    1. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD 600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu doğrusal denklemden OD600 ilebölün.

4. Aljinat Ölçümünün İstatistiksel Analizi

  1. Grafik yazılım sayfasında, standart eğriden türetilen doğrusal denklemi içeren bir sütun ayarlayın. Her numunede aljinat konsantrasyonu elde etmek için elisa için üronik asit tahsini için od530 ve ELISA için OD450 olarak aljinat konsantrasyonu ve x-eksensonuçları olarak y-ekseni sonuçlarını ayarlayın.
  2. Her numunedeki aljinat miktarını 5,5 x108 CFU/mL (1 OD600)başına göre normalleştirmek için, yukarıda elde edilen her numunenin konsantrasyonunu ilgili OD600 değerine bölün. Her örnek için birden fazla OD600 ölçüldüyse, ortalama OD600'ebölün.
  3. Tercih edilen istatistiksel yazılımları kullanarak istatistiksel analiz yapın (örneğin, GraphPad Prism 7.02).
  4. Yazılımı açın. Yeni Tablo & Grafik altında Sütun'u seçin ve tek yönlü ANOVA veri kümesini seçin.
  5. Zorlanma test ile her sütun adı ve altında aljinat konsantrasyonları ekleyin.
  6. Tüm verileri girerek üst menüdeki Analyze'a tıklayın. Bu, bir çözümleme ayarları penceresi açar. Sınama için uygun parametreleri seçin ve birden çok karşılaştırmanın çalıştırılması gerekip gerekmediğini belirtin.
    NOT: Analizden sonra veri kümesi, verilerin istatistiksel önemini belirlemeye yardımcı olacak bir p değeri içerecektir. P değeri α değerinden daha azsa veriler istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir (normalde α değeri p < 0.01 için ayarlanır).
  7. Grafik sekmesinin altında Çubuk Grafiği türünü seçin. Bu, giriş veri sayfasından belirtilen başlıkla verileri otomatik olarak grafikle çizecektir. İlgi çubukları arasındaki bağlantı çizgilerinin üzerindeki * simgesini göstererek verilerin gerektiği gibi istatistiksel önemini belirtin.

Sonuçlar

Şekil 1 PID geninde (pirimidin biyosentez yolunda ki bir gen) çerçeve içi deletion olan veya olmayan PAO1 ve PAO581 plakalarını gösterir ve bu plakalar SCV6ile sonuçlanır. PAO1 SCV mutanturasil takviyesi yanıt olarak normal büyüme geri yüklendi (Şekil 1A,B). Ayrıca, PAO581ΔpyrDSCV mutant aynı urasil tedavi ile mucoidy döndü, ebeveyn suşu PAO581 ek bir ...

Tartışmalar

Hem SCV hem de aljinat çeşitli kronik enfeksiyonlarda bulunan önemli hastalık belirteçleridir. Bu nedenle, SCV büyümek ve P. aeruginosa tarafından aljinat düzenleme ve üretim çalışma yeteneği bu kronik hastalıklar için yeni tedavilerin keşfi ayrılmaz bir parçasıdır.

SCV suşları diğer P. aeruginosa suşları ile karşılaştırıldığında onların yavaş büyüme hızı4 nedeniyle büyümek için kötü üne sahiptir, onların ...

Açıklamalar

Yazar Hongwei D. Yu Baş Bilim Görevlisi ve Progenesis Technologies, LLC kurucularından biridir.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir R44GM113545 ve P20GM103434 hibe.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Step Ultra TMB-ELISAThermo Scientific34028via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)Fisher ScientificBP2818-4Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry BathLabnetNC0205808via Fisher Scientific
Assay Plates 96-wellCoStar2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2Scientific IndustriesG560
Boric AcidResearch Products International Corp.10043-35-3
Cabinet IncubatorVWR1540
CarbazoleSigmaC-5132
Carbonate-Bicarbonate BufferSigmaC3041
Centrifuge Tubes (50 mL)Fisher Scientific05-539-13via Fisher Scientific
Culture Test TubesFisher Scientific14-956-6Dvia Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 mL)Fisher Scientific14955127via Fisher Scientific
CytosineAcros Organics71-30-7
Diposable Inoculation LoopsFisher Scientific22-363-597
D-Mannuronic Acid SodiumSigma AldrichSMB00280
FMC AlginateFMC2133
GlycerolFisher ScientificBP906-5For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal AntibodyQED BiosciencesN/ALot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)SigmaP3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP AntibodyThermo Scientific32230via Fisher Scientific
Potassium HydroxideFisher Scientific1310-58-3via Fisher Scientific
Prism 7GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)Difco292710via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB)Alpha BiosciencesP16-115via Fisher Scientific
Round ToothpicksDiamondAny brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133)FMC Corporation
Skim MilkDifco232100via Fisher Scientific
SmartSpec Plus SpectrophotometerBioRad170-2525or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl)SigmaS-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate ReaderMolecular Devicesi3xor preferred vendor
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875713via Fisher Scientific
Sulfuric AcidFisher ScientificA298-212Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)R&D SystemsDY994
Tween 20SigmaP2287
UracilAcros Organics66-22-8

Referanslar

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
  2. Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
  3. Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
  4. Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
  5. Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
  6. Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
  7. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
  8. Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
  9. Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
  10. Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
  11. Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
  12. Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
  13. Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
  14. Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
  15. Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
  16. Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 156Pseudomonas aeruginosakistik fibrozis CFk k koloni varyant SCVpirimidin biyosentezib y mem coidyaljinatronik asit karbazol analizialjinat spesifik mAbELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır