Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato

Resumen

Aquí, describimos una condición de crecimiento para cultivar la pequeña variante de colonia de Pseudomonas aeruginosa. También describimos dos métodos separados para la detección y cuantificación del alginato de exopolisacárido producido por P. aeruginosa utilizando un ensayo tradicional de ácido urónico carbazol y un anticuerpo monoclonal específico de alginato (mAb) basado en ELISA.

Resumen

Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista, puede producir en exceso un alginato de exopolisacárido, lo que resulta en un fenotipo único llamado mucoidy. El alginato está relacionado con infecciones pulmonares crónicas que provocan un mal pronóstico en pacientes con fibrosis quística (CF). Comprender las vías que regulan la producción de alginato puede ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la formación de alginato. Otro fenotipo relacionado con la enfermedad es la variante de la pequeña colonia (SCV). El SCV se debe al lento crecimiento de bacterias y a menudo se asocia con una mayor resistencia a los antimicrobianos. En este artículo, primero mostramos un método de cultivo de una forma definida genéticamente de P. aeruginosa SCV debido a mutaciones en la biosíntesis de pirimidina. La suplementación de bases nitrogenadas, uracilo o citosina, devuelve el crecimiento normal a estos mutantes, demostrando la presencia de una vía de salvamento que barre las bases libres del medio ambiente. A continuación, analizamos dos métodos para la medición del alginato bacteriano. El primer método se basa en la hidrólisis del polisacárido a su monómero de ácido urónico seguido de derivatización con un reactivo cromogénico, el carbazol, mientras que el segundo método utiliza un ELISA basado en un mAb específico del alginato disponible comercialmente. Ambos métodos requieren una curva estándar para la cuantificación. También demostramos que el método inmunológico es específico para la cuantificación de alginato y puede utilizarse para la medición del alginato en las muestras clínicas.

Introducción

Las infecciones pulmonares crónicas con Pseudomonas aeruginosa son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística (CF). Durante la primera infancia, los pacientes son colonizados por múltiples patógenos bacterianos, incluyendo aislados no mucoides de P. aeruginosa^1,2. La aparición de los aislados de la variante de la pequeña colonia (SCV), así como los aislados mucoides, es un marcador para el inicio de infecciones crónicas. Los aislados de SCV son altamente resistentes a los medicamentos³ debido a sus lentas tasas de crecimiento⁴, lo que los convierte en un grave elemento disuasorio en los regimientos de tratamiento y otras infecciones crónicas⁵ por P. aeruginosa. 6^mostró un vínculo entre el SCV y la mucoimidicia vinculado por la biosíntesis de novo pirimidina. La inanidinación de pirimidina, debido a mutaciones en genes relacionados con la producción de pirimidina, dio lugar a fenotipo SCV en la cepa de referencia no mucoide PAO1 y el derivado mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).

A pesar de que la sobreproducción de alginato es un marcador de enfermedad importante para las infecciones pulmonares crónicas en la FQ, no está claro si existe una correlación directa entre la cantidad de alginato y la patología pulmonar, y no está claro si el alginato se puede utilizar como marcador de pronóstico para el tratamiento⁷. La producción de alginato está regulada principalmente por dos operons, un operon regulador (algUmucABCD)^8,9 y el operon biosintético (algD operon)^10,11. La producción de alginato está estrechamente regulada por el factor sigma AlgU^9,12 (también conocido como AlgT) y la degradación del factor anti-sigma MucA^13. La capacidad de monitorear la producción de alginato in situ a partir de las muestras de esputo de los pacientes puede ayudar en el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.

Aquí, describimos una condición de crecimiento que detecta la presencia de SCV causado por mutantes que no pueden sintetizar la pirimidina de novo. La suplementación de uracilo y/o citosina, la base nitrogenada de nucleótido de pirimidina, al medio activa la vía de salvamento, restaurando así el crecimiento normal en mutantes. Este método de crecimiento para estos mutantes específicos del SCV se puede utilizar como método de cribado para identificar mutaciones de pirimidina en muestras de pacientes. Además, discutimos dos métodos para la detección y medición de alginato producido y secretado por P. aeruginosa. El primero es el método tradicional^14,15,16 de degradar el polisacárido utilizando una alta concentración de ácido y luego añadir un indicador colorimétrico para cuantificar la concentración en la muestra. El segundo método, desarrollado en nuestro laboratorio, utiliza el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-alginato (mAb) desarrollado por QED Biosciences. El método ELISA demuestra ser más específico y sensible que el ensayo de ácido urónico y permite un uso más seguro debido a la evitación del ácido sulfúrico altamente concentrado. Con la capacidad de la ELISA para ser utilizado directamente en muestras de esputo del paciente para medir el alginato, se puede desarrollar como una herramienta de diagnóstico de monitoreo para seguir la cantidad de alginato presente en los pulmones en diferentes períodos de la infección.

Protocolo

1. Condiciones de crecimiento del SCV y activación fisiológica de la vía de salvamento

1. Detección de SCV.
   1. Las cepas p. aeruginosa PAO1, PAO1pyrD,PAO581 y PAO581en placas de agar de aislamiento Pseudomonas (PIA) precalentadas y crecen a 37oC durante 48 h. En la placa de crecimiento identificar un aislado de colonia única que tiene el fenotipo SCV (tamaño de la colonia de 1 x 3 mm en comparación con el tamaño normal de la colonia de 3 x 5 mm).
   2. Repita el paso 1.1.1 para obtener un aislado puro del SCV.
      NOTA: El crecimiento puede requerir hasta 72 h debido a la lenta tasa de crecimiento de las colonias de SCV.
2. Activación fisiológica de la vía de salvamento.
   1. Usando un bucle de inoculación estéril, escoja la colonia SCV de la placa PIA y la raya en un PIA precalentado complementado con 0,1 mM de uracilo. Cultivar la placa a 37oC durante 24 x 48 h.
      NOTA: Todas las placas PIA utilizadas en este protocolo contienen 20 ml/L de glicerol añadido a la mezcla antes del autoclave. Después de la autoclave y después de la temperatura de la mezcla es inferior a 55 oC añadir 11,21 mg/L de uracilo (0,1 mM) al medio líquido antes de verter las placas. Este método ayudaría a identificar mutaciones de pirimidina que causan fenotipo SCV en P. aeruginosa. Si el fenotipo SCV es el resultado de dicha mutación, entonces el crecimiento normal de la colonia y el tamaño (3 x 5 mm) se observarían en las placas PIA suplementadas con uracilo. Si las cepas tenían la capacidad de producir alginato, entonces el fenotipo mucoide también volverá sobre la suplementación de uracilo.

2. Ensayo de ácido urónico carbazol

1. A partir de un cultivo puro de cepa deseada para ser probado, identificar una sola colonia. Usando un palillo de dientes estéril, escoja la colonia y coloque el palillo de dientes en un tubo de ensayo de cultivo que contenga 5 ml de caldo de aislamiento Pseudomonas (PIB). Crecer en una incubadora de coctelera a 37oC durante 24 h.
   NOTA: Las siguientes cepas PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA,PAO581carBy PAO581pyrD se cultivaron en placas PIA o placas PIA complementadas con uracilo de 0,1 mM para cosechar alginato para la medición.
2. En una placa PIA precalentada añadir 150 l de caldo PIB cultivado (para placas de 15 mm x 100 mm) o 450 l de caldo (para placas de 15 mm x 150 mm). Usando un esparcidor de células estériles, esparza el caldo sobre el plato. Cultivar la placa a 37oC durante 24 h.
   NOTA: Aspirar cualquier exceso de líquido, si lo hay, de la placa usando un pipeta inclinando la placa hacia un lado. Las placas PIB y PIA utilizadas en el protocolo contienen 20 ml/L de glicerol para ser utilizados por las células como fuente de carbono para ayudar en la producción de alginato.
3. Usando un controlador de pipeta y una pipeta estéril de 50 ml, agregue 0.85% NaCl al césped cultivado y recoja la muestra desguazando la placa usando un esparcidor de células. Aspirar la muestra usando un nuevo pipeta de 50 ml en un tubo de recogida de 50 ml. Vortex la muestra en alto para mezclar y colocar las muestras en hielo.
   NOTA: El volumen de NaCl añadido 0.85% varía dependiendo del tamaño de la placa. Para placas de 15 mm x 100 mm, utilice 10 x 30 ml y, para placas de 15 mm x 150 mm, utilice 20 x 50 ml.
4. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de las muestras añadiendo 1 ml de la muestra a una cubeta desechable y leyendo el OD utilizando un espectrofotómetro. Repita este paso 2x para obtener un triplicado de lecturas para cada muestra.
5. Añadir 3 ml de la solución de ácido sulfúrico/borato en tubos de cultivo y dejar sentarse en el hielo. Añadir 350 l de la muestra recogida lentamente a la mezcla ácida en los tubos de ensayo y vórtice en baja brevemente.
   1. Prepare el stock de borato añadiendo 10.099 g de hidróxido de potasio (KOH) en polvo a 45 ml de agua. Añadir 24,74 g de ácido bórico (H₃BO₃) a la mezcla y llevar el volumen a 100 ml.
   2. Colocar 1 L de botella en un fregadero con hielo y llenar la botella con 500 ml de ácido sulfúrico concentrado. Añadir LENTAMENTE 15 ml del stock de borato preparado. Deje que la botella se enfríe.
   3. Añadir otros 10 ml de stock de borato para un total de 25 ml. Una vez enfriada la botella, lleve el volumen a 1 L.
      ADVERTENCIA: Este método se basa en el uso de ácido sulfúrico altamente concentrado. Se debe utilizar un equipo de protección personal adecuado para garantizar la seguridad y el protocolo de eliminación adecuado de la muestra.
      NOTA: Para un control positivo, una concentración conocida ded ácido -manurónico y/o muestras de alginato bacteriano conocidas cosechadas y purificadas a través de cepas productoras de alginato de P. aeruginosa (por ejemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para un control negativo utilizar 0.85% NaCl solución y / o PAO1algD (Deleción en el marco del gen algD que hace que las bacterias completamente incapaces de producir alginato). Se pueden hacer varios tubos de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare 3 x 5 tubos de cada muestra.
6. Añadir 100 l de carbazol al 0,1% de carbazol en solución de etanol a la mezcla ácido/muestra. Tapar el tubo y el vórtice en un ajuste medio durante 5 s. Colocar en un baño seco a 55oC durante 30 min.
7. Después de la incubación, retire los tubos y el vórtice brevemente en alto y deje enfriar durante 5 min.
   NOTA: El color a ver sería un tono de púrpura. El color se mantendrá estable para la medición durante 1 x 2 h.
8. Lea el OD₅₃₀ de cada tubo añadiendo 1 ml de la mezcla a una cubeta limpia y leyendo la DoDe de las muestras a 530 nm en un espectrofotómetro. Utilice el tubo con 0.85% NaCl como blanco para el espectrofotómetro.
9. Preparar una curva estándar midiendo la_{DoS 530} de las diluciones en serie de las concentraciones conocidas de ácido D-Manurónico (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml y 8 g/ml). Repita 2x. Extraiga una ecuación lineal de estas lecturas.
   NOTA: La curva estándar solo debe realizarse una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.
   1. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD₆₀₀ para obtener la cantidad total de alginato por OD₆₀₀.

3. ELISA para la cuantificación de alginatos

1. Repita los pasos 2.1 a 2.4 para obtener muestras para la medición del alginato.
   NOTA: Las cepas utilizadas fueron PAO1, PAO1algDy PAO1 que llevaban pHERD20T-algU.
2. Usando una micropipette añadir 50 l de la muestra recogida a una placa de 96 pocillos sin tratar. Añadir 50 l de tampón de recubrimiento (tamtón de carbonato/bicarbonato pH 9.6) a los pozos. Incubar la placa a 37oC durante 2 h.
   NOTA: Para un control positivo, se puede utilizar una concentración conocida de ácido D-manurónico y/o una cepa productora de alginato estable conocida (por ejemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para un uso de control negativo 0.85% NaCl solución y / o PAO1algD (deleción en el marco del gen algD hace que la bacteria completamente incapaz de producir cualquier alginato). Se pueden hacer varios pozos de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare 3 x 5 pozos de cada muestra.
3. Usando una botella de chorro, lave los pozos de la placa 2veces con 1x solución salina tampón de fosfato (PBS) con 0.05% Tween 20 (PBS-T) llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.
4. Usando una micropipette añadir 200 l de tampón de bloqueo (10% de leche descremada en PBS-T) a los pozos. Incubar a 4oC durante la noche.
   NOTA: Envuelva la placa en película de parafina o envoltorio para ayudar a evitar cualquier evaporación en el refrigerador.
5. Usando una botella de chorro lavar los pozos de la placa 2x con PBS-T llenando los pozos, y luego escurrirlos volteando la placa.
6. Usando una micropipeta añadir 100 s de anticuerpo primario diluido (anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón) a los pozos e incubar a 37 oC durante 1 x 2 h.
   NOTA: Se proporcionó anticuerpoprimario primario (anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón) a una concentración de 0,5 g/ml (dilución de 1:2.000 de 1 mg/ml) en solución diluyente de anticuerpos (1% de leche desnatada en 1x PBS).
7. Usando una botella de chorro lave los pozos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.
8. Usando una micropipeta añadir 100 s de anticuerpo secundario diluido a los pozos e incubar a 37 oC durante 1 x 2 h.
   NOTA: El anticuerpo secundario utilizado fue el anticuerpo poliratón de cabra perforado a una concentración de 0,25 g/ml (dilución de 1:2.000 de 0,5 mg/ml) en la solución diluyente de anticuerpos.
9. Usando una botella de chorro lave los pozos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.
10. Con un micropipeta, añadir 100 ml de solución de TMB-ELISA(Tabla de materiales)e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
    NOTA: El color de una reacción positiva sería un tono de azul.
11. Con una micropipeta, añadir 100 ml de solución de parada (2 N de ácido sulfúrico).
    NOTA: El color cambiará de azul a amarillo cuando se agregue la solución de parada. El color es estable hasta 30 minutos después de detener la reacción.
12. Usando un lector de placas, lea el OD a 450 nm.
13. Producir una curva estándar midiendo la DoC₄₅₀ de las diluciones en serie de las concentraciones conocidas de ácido D-Manurónico (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml y 8 g/ml). Repita 2x. De estas lecturas extraer una ecuación lineal.
    NOTA: La curva estándar solo debe realizarse una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.
    1. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD₆₀₀ para obtener la cantidad total de alginato por OD₆₀₀.

4. Análisis estadístico de la medición del alginato

1. En una hoja de software gráfica, establezca una columna con la ecuación lineal derivada de la curva estándar. Establezca los resultados del eje Y como la concentración de alginato y los resultados del eje X como el OD₅₃₀ para el ensayo de ácido urónico y oD₄₅₀ para ELISA para obtener las concentraciones de alginato en cada muestra.
2. Para normalizar la cantidad de alginato en cada muestra a la cantidad por 5,5 x 10⁸ CFU/ml (1 OD_600),divida la concentración de cada muestra obtenida anteriormente por su respectivo valor OD_600. Si se midieron varios OD₆₀₀ para cada muestra, divida por la media de₆₀₀OD .
3. Realizar análisis estadísticos utilizando el software estadístico preferido (por ejemplo, GraphPad Prism 7.02).
4. Abra el software. Elija Columna en Nueva tabla y gráfico y elija el conjunto de datos ANOVA unidireccional.
5. Asigne un nombre a cada columna con la cepa probada y agregue las concentraciones de alginato debajo.
6. Después de introducir todos los datos, haga clic en Analizar en el menú superior. Esto abrirá una ventana de configuración de análisis. Elija los parámetros adecuados para las pruebas e indique si es necesario ejecutar varias comparaciones.
   NOTA: Después del análisis, el conjunto de datos contendrá un valor p que ayudaría a determinar la significancia estadística de los datos. Los datos se considerarían estadísticamente significativos si el valor p es menor que el valor establecido (normalmente se establece el valor de valor para p < 0.01).
7. En la pestaña de gráfico, elija el tipo Degráfico de barras. Esto trazará automáticamente los datos con el título indicado de la hoja de datos de entrada. Indique la significancia estadística de los datos según sea necesario mostrando el símbolo * sobre las líneas conectivas entre las barras de interés.

Resultados

La Figura 1 muestra las placas de PAO1 y PAO581 con o sin deleción en el marco en el gen de la pirretrosa (un gen en la vía de biosíntesis de pirimidina) que da como resultado el SCV⁶. El mutante PAO1 SCV fue restaurado al crecimiento normal en respuesta a la suplementación con uracilo(Figura 1A,B). Además, el mutante PAO581pyrDSCV fue devuelto a la mucoide con el mi...

Discusión

Tanto el SCV como el alginato son marcadores importantes de la enfermedad implicados en varias infecciones crónicas. Por lo tanto, la capacidad de aumentar el SCV, así como estudiar la regulación y producción de alginato por P. aeruginosa es parte integral del descubrimiento de nuevos tratamientos para estas enfermedades crónicas.

Las cepas de SCV son notoriamente difíciles de cultivar debido a su tasa de crecimiento lento⁴ en comparación con otras cepas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028	via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Assay Plates 96-well	CoStar	2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2	Scientific Industries	G560
Boric Acid	Research Products International Corp.	10043-35-3
Cabinet Incubator	VWR	1540
Carbazole	Sigma	C-5132
Carbonate-Bicarbonate Buffer	Sigma	C3041
Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	05-539-13	via Fisher Scientific
Culture Test Tubes	Fisher Scientific	14-956-6D	via Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 mL)	Fisher Scientific	14955127	via Fisher Scientific
Cytosine	Acros Organics	71-30-7
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
D-Mannuronic Acid Sodium	Sigma Aldrich	SMB00280
FMC Alginate	FMC	2133
Glycerol	Fisher Scientific	BP906-5	For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody	QED Biosciences	N/A	Lot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)	Sigma	P3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody	Thermo Scientific	32230	via Fisher Scientific
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	1310-58-3	via Fisher Scientific
Prism 7	GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)	Difco	292710	via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB)	Alpha Biosciences	P16-115	via Fisher Scientific
Round Toothpicks	Diamond		Any brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133)	FMC Corporation
Skim Milk	Difco	232100	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	BioRad	170-2525	or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma	S-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader	Molecular Devices	i3x	or preferred vendor
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	via Fisher Scientific
Sulfuric Acid	Fisher Scientific	A298-212	Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)	R&D Systems	DY994
Tween 20	Sigma	P2287
Uracil	Acros Organics	66-22-8