Cultura de Variante de Pequena Colônia de Pseudomonas aeruginosa e Quantitação de seu Alginate

Resumo

Aqui, descrevemos uma condição de crescimento para cultivar a pequena variante colônia de Pseudomonas aeruginosa. Descrevemos também dois métodos separados para a detecção e quantitação do alginato exopolissacarídeo produzido por P. aeruginosa usando um ensaio tradicional de carbazol ácido urônico e um anticorpo monoclonal específico de alginato (mAb) baseado em ELISA.

Resumo

Pseudomonas aeruginosa, um patógeno bacteriano gram-negativo oportunista, pode produzir um alginato exopolissacarídeo resultando em um fenótipo único chamado mucoidy. Alginate está ligado a infecções pulmonares crônicas que resultam em mau prognóstico em pacientes com fibrose cística (CF). Entender os caminhos que regulam a produção de alginato pode auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas voltadas para a formação alginada. Outro fenótipo relacionado à doença é a variante da pequena colônia (CvS). O SCV deve-se ao lento crescimento das bactérias e muitas vezes associado ao aumento da resistência aos antimicrobianos. Neste artigo, mostramos pela primeira vez um método de culturing uma forma geneticamente definida de P. aeruginosa SCV devido a mutações biosíntese pirimidinas. A suplementação de bases nitrogenadas, uracil ou citosina, retorna o crescimento normal a esses mutantes, demonstrando a presença de um caminho de resgate que recolhe bases livres do meio ambiente. Em seguida, discutimos dois métodos para a medição de alginato bacteriano. O primeiro método conta com a hidrólise do polissacarídeo ao seu momero ácido urônico seguido de derivatização com um reagente cromosgênico, carbazol, enquanto o segundo método usa um ELISA baseado em um mAb comercialmente disponível, específico para alginato. Ambos os métodos requerem uma curva padrão para quantitação. Mostramos também que o método imunológico é específico para quantificação de alginato e pode ser usado para a medição de alginato nos espécimes clínicos.

Introdução

As infecções pulmonares crônicas com Pseudomonas aeruginosa são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com fibrose cística (CF). Durante a primeira infância, os pacientes são colonizados por múltiplos patógenos bacterianos, incluindo isolados não mucoides de P. aeruginosa^1,2. O surgimento da variante da pequena colônia (SCV) isola, bem como isolados mucoides é um marcador para o início das infecções crônicas. Os isolados de SCV são altamente resistentes a medicamentos³ devido às suas lentas taxas de crescimento⁴, o que lhes torna um severo impedimento nos regimentos de tratamento e outras infecções crônicas⁵ por P. aeruginosa. O trabalho de Al Ahmar et al.⁶ mostrou uma ligação entre SCV e mucoidy ligada pela biossíntese de novo pirimidina. A fome de pirimidina, devido a mutações em genes envolvidos com a produção de pirimidina, resultou em fenótipo SCV na cepa de referência não mucoide PAO1 e o derivado mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).

Embora a superprodução alginada seja um importante marcador de doença para infecções pulmonares crônicas na CF, não está claro se há uma correlação direta entre a quantidade de alginato e patologia pulmonar, e não está claro se alginato pode ser usado como um marcador de prognóstico para o tratamento⁷. A produção de alginate é regulada principalmente por dois operões, um operon regulatório (algUmucABCD)^8,9 e o operon biossintético (algD operon)^10,11. A produção de alginate é fortemente regulada pelo fator Sigma AlgU^9,12 (também conhecido como AlgT) e pela degradação do fator antissigma MucA¹³. A capacidade de monitorar a produção de alginato in situ a partir dos espécimes de sputum dos pacientes pode auxiliar no desenvolvimento de novas opções terapêuticas.

Aqui, descrevemos uma condição de crescimento que detecta a presença de SCV causada por mutantes que não podem sintetizar a pirimidina de novo. A suplementação do uracil e/ou citosina, a base nitrogenada do nucleotídeo pirimidino, ao meio ativa o caminho de salvamento, restaurando assim o crescimento normal dos mutantes. Este método de crescimento para esses mutantes SCV específicos pode ser usado como um método de triagem para identificar mutações de pirimidina em amostras de pacientes. Além disso, discutimos dois métodos de detecção e medição de alginato produzido e secretado por P. aeruginosa. O primeiro é o método tradicional^14,15,16 de degradar o polissacarídeo usando uma alta concentração de ácido e, em seguida, adicionando um indicador colorimétrico para quantitar a concentração na amostra. O segundo método, desenvolvido em nosso laboratório, utiliza o Enzima-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) usando um anticorpo monoclonal antialginato (mAb) desenvolvido pela QED Biosciences. O método ELISA se mostra mais específico e sensível do que o ensaio ácido urônico e permite um uso mais seguro devido à evitação do ácido sulfúrico altamente concentrado. Com a capacidade da ELISA de ser usada diretamente em amostras de sputum paciente para medir alginato, ele pode ser desenvolvido como uma ferramenta de diagnóstico de monitoramento para acompanhar a quantidade de alginato presente nos pulmões em diferentes períodos da infecção.

Protocolo

1. Condições de crescimento do SCV e ativação fisiológica da via de salvamento

1. Detecção de SCV.
   1. Raie as cepas p. aeruginosa PAO1, PAO1ΔpyrD,PAO581 e PAO581ΔpyrD em placas de agar de isolamento Pseudomonas pré-aquecidas (PIA) e cresça a 37 °C por 48 h. Na placa de crescimento identifique um único isolado colônia que tenha o fenótipo SCV (tamanho da colônia de 1-3 mm em oposição ao tamanho normal da colônia de 3-5 mm).
   2. Repita a etapa 1.1.1 para obter um isolado puro do SCV.
      NOTA: O crescimento pode exigir até 72 h devido à lenta taxa de crescimento das colônias de SCV.
2. Ativação fisiológica do caminho de salvamento.
   1. Usando um ciclo de inoculação estéril, escolha a colônia SCV da placa PIA e raie em uma PIA pré-aquecida complementada com 0,1 mM de uracil. Cresça placa a 37 °C por 24-48 h.
      NOTA: Todas as placas PIA utilizadas neste protocolo contêm 20 mL/L de glicerol adicionados à mistura antes de autoclaving. Após a autoclaving e após a temperatura da mistura está abaixo de 55 °C adicionar 11,21 mg/L de uracil (0,1 mM) à mídia líquida antes de derramar placas. Este método ajudaria a identificar mutações pirimidinas que causam fenótipo SCV em P. aeruginosa. Se o fenótipo SCV for resultado dessa mutação, então o crescimento e o tamanho da colônia normal (3-5 mm) seriam observados nas placas PIA suplementadas uracil. Se as cepas tivessem a capacidade de produzir alginato, então o fenótipo mucoide também retornará sobre a suplementação uracil.

2. Ensaio de Carbazole Ácido Urônico

1. De uma cultura pura de tensão desejada a ser testada, identifique uma única colônia. Usando um palito estéril, escolha a colônia e coloque o palito de dente em um tubo de teste de cultura contendo 5 mL de caldo de isolamento Pseudomonas (PIB). Cresça em uma incubadora shaker a 37 °C por 24 h.
   NOTA: As seguintes cepas PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carBe PAPIO581foram cultivadas em placas PIA ou placas PIA complementadas com uracil de 0,1 mM para colher alginato para medição.
2. Em uma placa PIA pré-aquecida adicione 150 μL de caldo PIB cultivado (para placas de 15 mm x 100 mm) ou 450 μL de caldo (para placas de 15 mm x 150 mm). Usando um espalhador de células estéreis, espalhe o caldo sobre a placa. Cresça a placa a 37 °C por 24 h.
   NOTA: Aspirar qualquer excesso de fluido, se houver, da placa usando um pipet, derrubando a placa para um lado. Tanto as placas PIB quanto PIA utilizadas no protocolo contêm 20 mL/L de glicerol a serem utilizados pelas células como fonte de carbono para auxiliar na produção de alginato.
3. Usando um controlador pipette e uma pipeta estéril de 50 mL, adicione 0,85% de NaCl ao gramado cultivado e colete a amostra, sucateando a placa usando um espalhador de células. Aspirar a amostra usando um tubo fresco de 50 mL em um tubo de coleta de 50 mL. Vórtice a amostra em alta para misturar e colocar as amostras no gelo.
   NOTA: O volume de NaCl adicionado de 0,85% varia dependendo do tamanho da placa. Para placas de 15 mm x 100 mm, use 10-30 mL e, para placas de 15 mm x 150 mm, use 20-50 mL.
4. Meça a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) das amostras adicionando 1 mL da amostra a um cuvette descartável e lendo o OD usando um espectrômetro. Repita esta etapa 2x para obter um triplicado de leituras para cada amostra.
5. Adicione 3 mL da solução ácido sulfúrico/borate em tubos de cultura e deixe sentar no gelo. Adicione 350 μL da amostra coletada LENTAMENTE à mistura de ácido nos tubos de ensaio e vórtice em baixa brevemente.
   1. Prepare o estoque de borate adicionando 10.099 g de pó de hidróxido de potássio (KOH) a 45 mL de água. Adicione 24,74 g de ácido bórico (H₃BO₃) à mistura e leve volume a 100 mL.
   2. Coloque 1 garrafa L em uma pia com gelo e encha com 500 mL de ácido sulfúrico concentrado. Adicione lentamente 15 mL do estoque de borate preparado. Deixe a garrafa esfriar.
   3. Adicione mais 10 mL de estoque de borate para um total de 25 mL. Uma vez que a garrafa é resfriada, leve o volume para 1 L.
      ATENÇÃO: Este método se baseia no uso de ácido sulfúrico altamente concentrado. Os equipamentos de proteção individual adequados devem ser utilizados para garantir que a segurança e o protocolo adequado de descarte da amostra sejam seguidos.
      NOTA: Para um controle positivo, uma concentração conhecida de ácido D-mannurônico e/ou de amostras de alginato bacteriana conhecidas colhidas e purificadas através de alginato produzindo cepas de P. aeruginosa (por exemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para um uso de controle negativo, use 0,85% de solução NaCl e/ou PAO1ΔalgD (exclusão inquadro do gene algD que torna as bactérias completamente incapazes de produzir alginato). Vários tubos podem ser feitos a partir de cada amostra para aumentar o número de repetições técnicas para auxiliar na análise estatística. Prepare 3-5 tubos de cada amostra.
6. Adicione 100 μL de 0,1% de carbazol em solução de etanol para a mistura ácido/amostral. Tampe o tubo e o vórtice no ambiente médio por 5 s. Coloque em um banho seco a 55 °C por 30 min.
7. Após a incubação, remova os tubos e o vórtice brevemente em alta e deixe esfriar por 5 min.
   NOTA: Cor a ser vista seria um tom de roxo. A cor permanecerá estável para medição de 1-2h.
8. Leia o OD₅₃₀ de cada tubo adicionando 1 mL da mistura a um cuvette limpo e lendo o OD das amostras a 530 nm em um espectrômetro. Use o tubo com 0,85% de NaCl em branco para o espectrômetro.
9. Prepare uma curva padrão medindo o OD₅₃₀ de diluições em série de concentrações conhecidas de ácido D-Mannurônico (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL, e 8 μg/mL). Repita 2x. Extrair uma equação linear dessas leituras.
   NOTA: A curva padrão só precisa ser feita uma vez. A equação linear extraída dela pode ser usada para testes posteriores.
   1. Calcule a concentração do alginato em cada amostra usando a curva padrão e divida a concentração de alginato da equação linear por OD₆₀₀ para obter a quantidade total de alginato por OD₆₀₀.

3. ELISA para Alginate Quantitação

1. Repita as etapas 2.1-2.4 para obter amostras para medição de alginato.
   NOTA: As cepas utilizadas foram PAO1, PAO1ΔalgDe PAO1 carregando pHERD20T-algU .
2. Usando uma micropipeta adicione 50 μL da amostra coletada a uma placa não tratada de 96 poços. Adicione 50 μL de tampão de revestimento (carbonato/tampão de bicarbonato pH 9.6) aos poços. Incubar a placa a 37 °C por 2 h.
   NOTA: Para um controle positivo, pode ser utilizada uma concentração conhecida de ácido D-Mannurônico e/ou uma conhecida cepa produtora de alginato estável (por exemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para um uso de controle negativo, a solução NaCl de 0,85% e/ou PAO1ΔalgD (exclusão in-frame do gene algD torna as bactérias completamente incapazes de produzir qualquer alginato). Vários poços podem ser feitos a partir de cada amostra para aumentar o número de repetições técnicas para auxiliar na análise estatística. Prepare 3-5 poços de cada amostra.
3. Usando uma garrafa de esguicho, lave os poços da placa 2x com 1x soro tampão de fosfato (PBS) com 0,05% De Tween 20 (PBS-T) enchendo os poços e, em seguida, drenando-os girando a placa.
4. Usando uma micropipette adicione 200 μL de tampão de bloqueio (10% de leite desnatado em PBS-T) aos poços. Incubar a 4 °C durante a noite.
   NOTA: Enrole placa em filme de parafina ou envoltório para ajudar a evitar qualquer evaporação na geladeira.
5. Usando uma garrafa esguicho lave os poços da placa 2x com PBS-T enchendo os poços, e depois drenando-os girando placa.
6. Usando uma micropipette adicione 100 μL de anticorpo primário diluído (anticorpo monoclonal antialginato do mouse) aos poços e incuba a 37 °C por 1-2 h.
   NOTA: O anticorpo primário (anticorpo monoclonal antialginato do rato) foi fornecido a uma concentração de 0,5 μg/mL (diluição de 1:2.000 de 1 mg/mL estoque) em solução diluente anticorpo (1% de leite desnatado em 1x PBS).
7. Usando uma garrafa esguicho lave os poços da placa 3x com PBS-T enchendo os poços, e depois drenando-os girando placa.
8. Usando uma micropipeta adicione 100 μL de anticorpo secundário diluído aos poços e incuba a 37 °C por 1-2 h.
   NOTA: O anticorpo secundário usado foi perfurar anticorpo poli-HRP de cabra para uma concentração de 0,25 μg/mL (diluição de 1:2.000 de 0,5 mg/mL estoque) em solução diluente anticorpo.
9. Usando uma garrafa esguicho lave os poços da placa 3x com PBS-T enchendo os poços, e depois drenando-os girando placa.
10. Usando uma micropipeta, adicione 100 μL de solução TMB-ELISA (Tabela de Materiais) e incuba a temperatura ambiente por 30 min no escuro.
    NOTA: A cor de uma reação positiva seria um tom de azul.
11. Usando uma micropipeta, adicione 100 μL de solução parada (2 N ácido sulfúrico).
    NOTA: A cor passará de azul para amarelo quando a solução de parada for adicionada. A cor fica estável por até 30 min depois que a reação é interrompida.
12. Usando um leitor de placa, leia o OD a 450 nm.
13. Produzir uma curva padrão medindo o OD₄₅₀ de diluições em série de concentrações conhecidas de ácido D-Mannurônico (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL, e 8 μg/mL). Repita 2x. A partir dessas leituras extrair uma equação linear.
    NOTA: A curva padrão só precisa ser feita uma vez. A equação linear extraída dela pode ser usada para testes posteriores.
    1. Calcule a concentração do alginato em cada amostra usando a curva padrão e divida a concentração de alginato da equação linear por OD₆₀₀ para obter a quantidade total de alginato por OD₆₀₀.

4. Análise Estatística da Medição de Alginato

1. Em uma folha de software gráfica, defina uma coluna com a equação linear derivada da curva padrão. Defina os resultados do eixo Y como a concentração de alginato e os resultados do eixo X como o OD₅₃₀ para ensaio ácido urônico e OD₄₅₀ para ELISA obter as concentrações de alginato em cada amostra.
2. Para normalizar a quantidade de alginato em cada amostra ao valor por 5,5 x10⁸ CFU/mL (1 OD₆₀₀), divida a concentração de cada amostra obtida acima pelo seu respectivo valor OD_600. Se vários OD₆₀₀ foram medidos para cada amostra, divida pela média OD₆₀₀.
3. Realizar análise estatística utilizando software estatístico preferido (por exemplo, GraphPad Prism 7.02).
4. Abra o software. Escolha a Coluna em Nova Tabela e Gráfico e escolha o conjunto de dados ANOVA unidirecional.
5. Nomeie cada coluna com a cepa testada e adicione as concentrações de alginato por baixo.
6. Depois de inserir todos os dados clique em Analisar no menu superior. Isso abrirá uma janela de configurações de análise. Escolha os parâmetros apropriados para testes e indique se alguma comparação múltipla precisa ser executada.
   NOTA: Após a análise, o conjunto de dados conterá um valor p que ajudaria a determinar a significância estatística dos dados. Os dados seriam considerados estatisticamente significativos se o valor p for menor do que o valor α definido (normalmente o valor α é definido para p < 0,01).
7. a guia do gráfico escolha o tipo Gráfico de Barras. Isso irá mapear automaticamente os dados com o título indicado da folha de dados de entrada. Indicar significância estatística dos dados conforme necessário, mostrando o * símbolo acima das linhas conjuntivas entre as barras de interesse.

Resultados

A Figura 1 mostra placas de PAO1 e PAO581 com ou sem exclusão no gene pirad (um gene na via de biosíntese pirimidina) que resulta em SCV⁶. O mutante PAO1 SCV foi restaurado ao crescimento normal em resposta à suplementação uracil (Figura 1A,B). Além disso, o mutante PAO581ΔpyrDSCV foi devolvido à mucoidy com o mesmo tratamento uracil, pois a cepa dos pais PAO581 t...

Discussão

Tanto o SCV quanto o alginato são importantes marcadores de doençaimplicados em várias infecções crônicas. Portanto, a capacidade de cultivar SCV, bem como estudar a regulação e produção de alginato por P. aeruginosa é parte integrante da descoberta de novos tratamentos para essas doenças crônicas.

As cepas de SCV são notoriamente difíceis de crescer devido à sua lenta taxa de crescimento⁴ em comparação com outras cepas p. aeruginosa,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028	via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Assay Plates 96-well	CoStar	2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2	Scientific Industries	G560
Boric Acid	Research Products International Corp.	10043-35-3
Cabinet Incubator	VWR	1540
Carbazole	Sigma	C-5132
Carbonate-Bicarbonate Buffer	Sigma	C3041
Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	05-539-13	via Fisher Scientific
Culture Test Tubes	Fisher Scientific	14-956-6D	via Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 mL)	Fisher Scientific	14955127	via Fisher Scientific
Cytosine	Acros Organics	71-30-7
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
D-Mannuronic Acid Sodium	Sigma Aldrich	SMB00280
FMC Alginate	FMC	2133
Glycerol	Fisher Scientific	BP906-5	For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody	QED Biosciences	N/A	Lot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS)	Sigma	P3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody	Thermo Scientific	32230	via Fisher Scientific
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	1310-58-3	via Fisher Scientific
Prism 7	GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA)	Difco	292710	via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB)	Alpha Biosciences	P16-115	via Fisher Scientific
Round Toothpicks	Diamond		Any brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133)	FMC Corporation
Skim Milk	Difco	232100	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	BioRad	170-2525	or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma	S-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader	Molecular Devices	i3x	or preferred vendor
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	via Fisher Scientific
Sulfuric Acid	Fisher Scientific	A298-212	Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution)	R&D Systems	DY994
Tween 20	Sigma	P2287
Uracil	Acros Organics	66-22-8