JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم توفير بروتوكول لتحريض الخلايا الخلوية ، والمبرمجة موت الخلية في كريات الحمراء ، وذلك باستخدام ionophore الكالسيوم ، ionomycin ،. يتم تقييم المبرمج الناجح من خلال مراقبه التعريب فوسفاتيديلسيرين في النشرة الخارجية غشاء. وقد تم فحص العوامل التي تؤثر علي نجاح البروتوكول وتوفير الظروف المثلي.

Abstract

كريات الخلايا المبرمجة الموت ، يحدث في عدد من الامراض الدموية واثناء أصابه الكريات الحمراء. السمة المميزة للخلايا eryptotic هو فقدان التماثل الموضعي لغشاء الخلية ، مما يؤدي إلى نقل فوسفاتيديلسيسيرين إلى النشرة الخارجية غشاء. يتم تشغيل هذه العملية عن طريق زيادة تركيز داخل الخلايا من Ca2 +، والذي ينشط تشويش blase ، وهو الانزيم الذي يسهل حركه ثنائيه الاتجاه من الدهون الفوسفاتية بين المنشورات غشاء. ونظرا لاهميه الخلايا البينية في الظروف المرضية المختلفة, وكانت هناك جهود للحث علي الارطح في المختبر. وقد اعتمدت هذه الجهود عموما علي ionophore الكالسيوم, ionomycin, لتعزيز Ca داخل الخلايا2 + تركيز والحث علي الارطح. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن العديد من التناقضات في الأدبيات المتعلقة بالاجراء الخاص بحمل الخلايا البينية باستخدام ionomycin. هنا ، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول خطوه بخطوه ل ionomycin المستحثة في كريات الحمراء البشرية. ونحن نركز علي الخطوات الهامه في الاجراء بما في ذلك تركيز ايوكوفيري ، ووقت الحضانة ، واستنزاف الجلوكوز ، وتوفير نتيجة تمثيليه. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتكرار حث الخلايا البينية في المختبر.

Introduction

موت الخلايا المبرمجة في كريات الدم الحمراء ، والمعروف أيضا باسم الخلية ، هو شائع في العديد من الحالات السريرية والاضطرابات الدموية. ويرتبط اريبتوسيس مع انكماش الخلية وفقدان التماثل فوسفورية في غشاء البلازما الخلية1,2. فقدان عدم التماثل النتائج في نقل فوسفاتيديلسيسيرين (PS), الدهون المترجمة عاده في النشرة الداخلية3,4, إلى النشرة الخارجية الخلية, الذي يشير إلى الضامة لفاجوسيتوسي وأزاله الكريات الحمراء المعيبة5,6,7,8. في نهاية فتره الحياة الطبيعية من كريات الدم الحمراء ، وأزاله الخلايا الدموية من قبل الضامة يضمن التوازن من كريات الدم الحمراء في التداول. ومع ذلك ، في الظروف المرضية ، مثل مرض الخلية المنجلية و الثلاسيميا9،10،11، قد يؤدي تحسين الخلايا الخلوية إلى فقر الدم الشديد2. نظرا لأهميته في امراض الدم ، هناك اهتمام كبير في دراسة العوامل التي تحفز أو تمنع الخلايا الخلوية واليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العملية.

غشاء البلازما من كريات الدم الحمراء الصحية غير متناظرة ، مع الفوسفورية المختلفة التعريب في المنشورات الخارجية والداخلية. يتم تنظيم التماثل غشاء في المقام الأول من قبل عمل الانزيمات الغشاء. Aminophospholipid translocase يسهل نقل أمينوفوسفوليبيدس ، PS و فوسفهاتيديليثانولامين (PE) ، من خلال توجيه هذه الدهون إلى النشرة الداخلية الخلية. من ناحية أخرى, floppase ينقل الكولين التي تحتوي علي الدهون الفوسفاتية, فوسفاتيديلكولين (PC) و سفينغوميلين (SM), من الداخل إلى النشرة الخارجية لغشاء الخلية12. ومع ذلك ، علي عكس الخلايا السليمة ، يتم خلط غشاء الكريات الحمراء الخلوية. ويرجع ذلك إلى عمل الانزيم الثالث ، الذي يعطل التباين فوسفورية عن طريق تسهيل النقل ثنائي الاتجاه من أمينوفوسفوليبيدس13،14،15،16. يتم تنشيط تشويش بلاسي من خلال مستويات مرتفعه من الخلايا من Ca2 +. ولذلك ، ionophores الكالسيوم ، والتي تسهل نقل Ca2 + عبر غشاء الخلية12، هي محفزات فعاله من الخلايا البينية.

Ionomycin ، ايونومور الكالسيوم ، وقد استخدمت علي نطاق واسع للحث علي الخلايا الحمراء في كريات الصدر12،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26. Ionomycin لديه كل من المجموعات هيدروفيلييك ومسعور ، والتي هي ضرورية لربط والتقاط Ca2 + أيون ، ونقله إلى الفضاء عصاري خلوي27،28،29. وهذا يؤدي إلى تفعيل التشويش ونقل الموقع من PS إلى النشرة الخارجية ، والتي يمكن الكشف عنها بسهوله باستخدام الملحقات-V ، وهو بروتين خلوي مع تقارب عاليه إلى PS12. وعلي الرغم من انه يتم الإبلاغ عن الآثار التي يسببها ionomycin عاده ، وهناك تباين طريقه كبيره في الأدب (الجدول 1). يعتمد السكان من كريات الحمراء التي تمر بالخلايا الخلوية علي عوامل مختلفه مثل تركيز ايوكوفيري ، ووقت العلاج مع ايوفونور ، ومحتوي السكر في البيئة خارج الخلية (استنزاف الجلوكوز ينشط قنوات الموجبة ويسهل دخول Ca2 + في الفضاء عصاري خلوي)30،31. ومع ذلك ، هناك القليل من الاتساق في هذه العوامل في الأدبيات ، مما يجعل من الصعب القيام التكرار في المختبر.

في هذا البروتوكول ، نقدم اجراء خطوه بخطوه للحث علي الارطح في كريات الحمراء البشرية. يتم فحص العوامل التي تؤثر علي الخلايا البينية الناجحة بما في ذلك Ca2 + تركيز ، تركيز ايوكوفيري ، وقت العلاج ، وما قبل الحضانة في المخزن المؤقت المنضب الجلوكوز ويتم الإبلاغ عن القيم المثلي. يوضح هذا الاجراء ان ما قبل الحضانة من كريات الحمراء في المخزن المؤقت الخالي من الجلوكوز يزيد بشكل كبير من نسبه الخلايا البينية مقارنه بالمخزن المؤقت المحتوي علي الجلوكوز. يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر لإنتاج كريات الحمراء الخارجية للتطبيقات المختلفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد تم شراء جميع عينات الدم البشرية المستخدمة في البروتوكول الموصوف أدناه كعينات تم التعرف عليها. ولم يشارك في هذه الدراسة اي أشخاص من البشر أو جندوا بصوره مباشره. وينبغي استخدام المبادئ التوجيهية لإعلان هلسنكي عندما تشمل البحوث المواضيع البشرية.

1-العزلة الكرياته عن الدم الكامل

  1. أضافه 500 μL من الدم كله في حمض السكر سيترات (الحوار) (المخزنة في 4 درجه مئوية) إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير.
    ملاحظه: تم شراء الدم الكامل في الحوار الاسيوي. وفقا للشركة ، يتم أضافه 1.5 مل من الحوار إلى 7 مل من الدم الكامل (8.5 mL حجم الكلي).
  2. الطرد المركزي الدم كله في 700 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT) وأزاله البلازما واضحة ومعطف بافي رقيقه باستخدام ماصه لترك طبقه كريات الحمراء.
  3. اعداد 1 لتر من الحل الرنين التي تحتوي علي 125 mM كلوريد الصوديوم ، 5 ملم KCl ، 1 مم MgSO4، 32 MM hepes ، 5 ملم الجلوكوز ، و 1 مم cacl2. ضبط درجه الحموضة إلى 7.4 باضافه 2 μL قطرات من 1.0 M NaOH. لاعداد حل الرنين الخالي من الجلوكوز ، اتبع نفس البروتوكول ، ولكن لا تقم بتضمين الجلوكوز في الحل.
  4. غسل كريات الحمراء 2x في الحل الرنين عن طريق تعليق بيليه الخلية في 1.5 mL من الحل الرنين ، يطرد في 700 x ز لمده 5 دقائق في RT ، وأزاله supernatant.
  5. جعل 0.4 ٪ هيتوكريت عن طريق أعاده تعليق 40 μL من بيليه كريات في 9,960 μL من الجلوكوز خاليه من حل الرنين للوصول إلى حجم النهائي من 10 مل.
    ملاحظه: هيتوكريت مصطلح يستخدم للاشاره إلى حجم جزء من كريات الدم الحمراء في التعليق. A 0.4 ٪ هيتوكريت هو تعليق يحتوي علي 0.4 ٪ كريات الدم الحمراء.
  6. احتضان تعليق الخلية في 37 درجه مئوية لمده 7 أيام.

2. علاج كريات الحمراء مع ايونوميمايسين وقياس انحلال الدموي

  1. تذوب 1 ملغ من ملح الكالسيوم ionomycin في 630 μL من ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) للوصول إلى التركيز النهائي من 2 ملم. Aliquot ومخزن في-20 درجه مئوية.
  2. خذ 1 مل من الدم 0.4 ٪ من الخطوة 1.5 وأضافه 0.5 μL من 2 mM ionomycin للوصول إلى تركيز نهائي من 1 μM. احتضان لمده 2 ح في 37 درجه مئوية.
    1. استخدام 1 مل من الهيكوكريت مع عدم وجود العلاج ionomycin كعنصر تحكم سلبي.
  3. الطاردة للطرد المركزي ionomycin المعالجة والدموية غير المعالجة في 700 x g ل 5 دقيقه في RT ، وأزاله supernatants بهم لترك الكريات الخلية في الجزء السفلي من الأنابيب.
  4. غسل الخلايا 3x مع الحل الرنين عن طريق تعليق الكريات الخلية في 1.5 mL من الحل الرنين ، يطرد في 700 x ز لمده 5 دقائق في RT ونبذ supernatants.
  5. لقياس انحلال الدم ، أضف 1 مل من الدم غير المعالج 0.4 ٪ من الهيكوريت من الخطوة 1.5 إلى أنبوب الطرد المركزي واحتضان لمده 2 ح في 37 درجه مئوية كعنصر تحكم سلبي لانحلال الدم (0 ٪).
  6. أضافه 1 مل من 0.4 ٪ غير المعالجة من الدم من الخطوة 1.5 إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 700 x ز لمده 5 دقائق في RT. أزاله ماده طافي وأضافه 1 مل من الماء المقطر إلى بيليه الخلية واحتضان ل 2 ح في 37 درجه مئوية كعنصر تحكم إيجابي لانحلال الدم (100 ٪).
  7. أضافه 1 مل من ionomycin-معالجه 0.4 ٪ الهيكوريت من الخطوة 2.2 إلى أنبوب الطرد المركزي.
  8. طرد مركزي الخلايا غير المعالجة ، الخلايا المعالجة ، والخلايا في الماء المقطر في 700 x g لمده 5 دقائق في RT.
  9. خذ 200 μL من supernatants وأضافه إلى لوحه 96-حسنا.
  10. قياس الامتصاص في 541 nm باستخدام قارئ ميكروبلايت.
  11. حساب انحلال النصفي باستخدام المعادلة 132:

    % انحلال الدموي = (اT -a0)/(100 -ا0) * 100

    حيث A0 هو امتصاص كريات الحمراء في حل الرنين ، a100 هو امتصاص كريات الحمراء في الماء ، وT هو امتصاص الكريات الحمراء المعالجة بواسطة ionomycin.

3-المرفق الخامس لمقايسة الربط

  1. تمييع 2 مل من 5x المرفق الخامس المخزن المؤقت ملزمه في 8 مل من الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) للحصول علي 1x ملزمه العازلة.
  2. أعاده التعليق الكريات الخلية ionomycin المعالجة وغير المعالجة من الخطوة 2.4 في 1 مل من 1x العازلة ملزمه.
  3. خذ 235 μL من تعليقات الخلية في المخزن المؤقت للربط وأضافه 15 μL من الضم الخامس-اليكسا الطحين 488 المقارن.
  4. احتضان الخلايا في RT لمده 20 دقيقه في مكان مظلم. الطرد المركزي في 700 x g لمده 5 دقائق في RT وأزاله supernatant.
  5. غسل الخلايا 2x مع 1x العازلة ملزمه ، عن طريق تعليق بيليه الخلية في 1.5 mL من العازلة ملزمه ، يطرد في 700 x ز لمده 5 دقائق في RT وأزاله supernatant.
  6. أعاده تعليق كريات الخلية في 250 μL من المخزن المؤقت للربط 1x لقياسات التدفق الخلوي.

4. تدفق الخلوي

  1. نقل 200 μL من المرفقات-V الكريات الحمراء الملونة إلى 1 مل أنابيب البوليسترين أسفل الجولة متوافقة مع تدفق الخلوي.
  2. تسجيل الدخول إلى برنامج تدفق الخلوي وانقر علي زر التجربة الجديدة . انقر علي زر أنبوب جديد . حدد ورقه العالمية واختيار تطبيق التحليل لقياس كثافة مضان مع الطول الموجي الاثاره من 488 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات من 530 nm.
  3. تعيين عدد الخلايا إلى 20,000 ليتم جمعها لتحليل الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) الفرز.
  4. حدد الأنبوب المطلوب وانقر علي زر تحميل . انقر علي زر التسجيل لقياسات مبعثرة إلى الامام والجانب مبعثر. كرر لجميع العينات.
  5. الحق انقر علي زر العينة وانقر علي تطبيق تحليل الدفعة لإنشاء ملف النتيجة.
  6. الحق انقر علي زر عينه وانقر علي إنشاء ملفات FSC.
  7. أضافه بيانات التدفق الخلوي (ملفات FSC) في مكان العمل من البرمجيات تدفق الخلوي.
  8. تحليل بيانات عنصر التحكم عن طريق تحديد عدد الخلايا من الفائدة وأضافه إحصائيات للقيمة المبرمجة.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق التحكم وحدد الرسم البياني مقابل كثافة الفلورية.
    2. انقر علي زر البوابة لرسم بوابه علي المدرج التكراري الذي يشير إلى النسبة المئوية للارطح.
  9. تطبيق نفس الإحصائيات لكافة الأنابيب التجريبية الأخرى للحصول علي قيم الخلايا الخارجية. انقر بزر الماوس الأيمن علي التحكم وحدد نسخ التحليل إلى المجموعة.
  10. بعد النابضة بشكل صحيح جميع العينات ، نقل البيانات التي تم تحليلها عن طريق سحب وإسقاطها في محرر التخطيط.
    1. تراكب البيانات المحللة مع عنصر التحكم في محرر التخطيط.
    2. قم بتعيين الرسوم البيانية المطلوبة والشدات عن طريق تغيير محور x و y للرسومات البيانية المتراكبه.
    3. تصدير ملفات الصور عن طريق النقر علي زر التصدير وحفظ الرسوم البيانية في الموقع المطلوب.

5. المجهر البؤري

  1. نقل 5 μL من الملحقات-V-الخلايا الملونة علي شريحة المجهر وتغطيتها مع زلة الغطاء. يحفظ في مكان مظلم لمنع الرشح الضوئي.
  2. استخدام الليزر الارجون من المجهر مضان البؤري لمراقبه الخلايا متحمس في 488 nm مع التكبير المطلوب.
    ملاحظه: المجهر البؤري لا حاجه بالضرورة ويمكن استخدام اي المجهر مع قدرات مضان للحصول علي الصور الفلورية التي تثبت الضم الخامس ملزمه.
  3. الحصول علي صور فلورية لعنصر التحكم (الخلايا غير المعالجة) والخلايا المعالجة.
    ملاحظه: من المتوقع ان تظهر الخلايا غير المعالجة إشارات فلورية ضعيفه جدا ، بينما من المتوقع ان تظهر الخلايا المعالجة الفلورية الخضراء الساطعة علي اغشيها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تحسين تركيز ايونوميمايسين

في حين ان ionomycin مطلوب للحث علي الخلايا الدموية ، يمكن ان تؤدي زيادة تركيزات ionomycin إلى انحلال الدم (اي تحلل كريات الدم الحمراء وإفراز الهيموجلوبين) ، والذي يحتاج إلى تجنب. علاج الكريات الحمراء مع ionomycin 1 μM ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

والهدف من هذا الاجراء هو توفير القيم المثلي لتركيز ايوكوفيري ، والوقت العلاج ، وتركيز الجلوكوز خارج الخلية ، والتي هي عوامل هامه في ضمان الحث الناجح للارطح. ومن الخطوات الحاسمة في البروتوكول استنفاد الجلوكوز خارج الخلية ، والتي ، علي الرغم من أهميتها ، لم يتم التاكيد بما فيه الكفاية في ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحه R15ES030140 و NSF منحه CBET1903568. ومن المسلم به أيضا الدعم المالي من كليه روس للهندسة والتكنولوجيا وقسم الهندسة الكيميائية والجزيئية الحيوية في جامعه أوهايو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plateFisher Scientific12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kitFisher ScientificA10788Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometerBD Biosciences643177
CaCl2Fisher ScientificC79-500
CentrifugeMillipore SigmaM7157Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopyZeiss, LSM Tek ThornwoodModel LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circlesFisher Scientific12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tubeVWRVWRU47729-566
DMSOSigma-Aldrich472301-100ML
DPBSVWR Life ScienceSH30028.02
Glucose monohydrateSigma-AldrichY0001745
HEPES Buffer (1 M)Fisher Scientific50-751-7290Store at 4 °C
Ionomycin calcium saltEMD Milipore Corp.407952-1MGDissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KClFisher ScientificP330-500
MgSO4Fisher ScientificM65-500
Microcentrifuge tubeFisher Scientific02-681-5
NaClFisher ScientificS271-500
Plain glass microscope slidesFisher Scientific12-544-4
Synergy HFM microplate readerBioTek
Whole blood in ACDZen-BioStore at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

References

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9(2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6 (10), e26575(2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157 (5), 1365(2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018 (5), 9405617(2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 ionomycin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved