Kalsiyum İyonofor Kullanarak Kırmızı Kan Hücrelerinde Eritotoz İndüksiyonu

Özet

Eritrositlerde eritrositlerde programlanmış hücre ölümü, kalsiyum iyonofor, iyonomisin kullanılarak programlanmış hücre ölümü için bir protokol sağlanır. Başarılı eritoz membran dış broşüründe lokalizasyon fosfatidilseriniz izleyerek değerlendirilir. Protokolün başarısını etkileyen faktörler incelenmiş ve en uygun koşullar sağlanmıştır.

Özet

Eritrosit programlı hücre ölümü olan eritoz, bir dizi hematolojik hastalıkta ve eritrositlerin yaralanması sırasında ortaya çıkar. Eritoretik hücrelerin ayırt edici özelliği hücre zarının bileşimsel asimetri kaybıdır, membran dış broşürfosfatidilserine translokasyon yol. Bu süreç Ca^{2 artan}hücre içi konsantrasyonu tarafından tetiklenir + hangi scramblase aktive, membran broşürler arasında fosfolipidlerin çift yönlü hareketini kolaylaştıran bir enzim. Çeşitli hastalıklı koşullarda eritozun önemi göz önüne alındığında, in vitroeritoz unneden çalışmalar yapılmıştır. Bu tür çabalar genellikle kalsiyum iyonofor dayanıyordu, ionomisin, hücre içi Ca^{geliştirmek için 2 +} konsantrasyonu ve eritotsis indüklemek. Ancak literatürde iyonomisin kullanılarak eritotoz unneden işlem le ilgili birçok tutarsızlık bildirilmiştir. Burada, insan eritrositlerinde iyonomisin kaynaklı eritoz için adım adım protokol bildiriyoruz. İonofor konsantrasyonu, kuluçka süresi ve glikoz tükenmesi gibi prosedürdeki önemli adımlara odaklanır ve temsili sonuç sağlarız. Bu protokol laboratuvarda tekrartekrar eritotis indüklemek için kullanılabilir.

Giriş

Eritrositlerde programlanmış hücre ölümü, eritoz olarak da bilinir, birçok klinik durum ve hematolojik bozukluklarda yaygındır. Eritoz hücre büzülmesi ve hücre plazma zarında fosfolipid asimetri kaybı ile ilişkilidir^1,2. Asimetri kaybı fosfatidilserin translokasyonu sonuçları (PS), normalde iç broşür lokalize bir lipid^3,4, hücre dış broşür, hangi fagositoz makrofajlar sinyalleri ve kusurlu eritrositkaldırmak^5,6,7,8. Eritrosit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Aşağıda açıklanan protokolde kullanılan tüm insan kanı örnekleri tanımlanmamış numuneler olarak satın alınmıştır. Hiçbir insan denek doğrudan dahil edildi veya bu çalışma için işe. Helsinki Bildirgesi'nin yönergeleri, araştırma insan denekleri kapsadığında kullanılmalıdır.

1. Tam kandan eritrosit izolasyonu

1. Bir mikrosantrifüj tüpüne asit sitrat dekstrozuna (ACD) (4 °C'de depolanır) 500 μL'lik tam kan ekleyin.
   NOT: Tam kan ACD olarak satın alındı. Şirkete göre 7 mL tam kana (8,5 mL toplam hacim) 1,5 mL ACD ilave edilmiştir.
2. Oda sıcaklığında 5 dakika (RT) için 700 x g tüm kan santrifüj ve kırmızı eritrosit taba....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İonomisin konsantrasyonunun optimizasyonu

İzomisin eritotaz neden olmak için gerekli iken, artan iyonomisin konsantrasyonları hemoliz yol açabilir (eritrositlerin lysis ve hemoglobin salınımı), kaçınılması gereken. 2 saat için Ringer çözeltisinde 1 μM iyonomisin ile eritrositlerin tedavisi, annexin-V Alexa Un 488 eşleç ve FACS analizi ile nicelleştirme ile başarılı etiketleme ile kanıtland.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu işlemin amacı, iyonofor konsantrasyonu, tedavi süresi ve eripozun başarılı indüksiyonunu sağlamada önemli faktörler olan hücre dışı glukoz konsantrasyonu için en uygun değerleri sağlamaktır. Protokoldeki kritik bir adım, önemine rağmen literatürde yeterince vurgulanamayan hücre dışı glikozun tükenmesidir. Normal Ringer çözeltisindeki şeker içeriği (5 mM) eritmetoz üzerinde önleyici etkiye sahiptir. Hücre dışı ortamda glikoz tükenmesi hücresel strese neden olur ve protein kiziaz .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use