Inducción de eritosis en glóbulos rojos utilizando un ionoforo de calcio

Resumen

Se proporciona un protocolo para la inducción de la eritosis, muerte celular programada en eritrocitos, utilizando el ionóforo de calcio, ionomicina. La eriptosis exitosa se evalúa mediante el seguimiento de la fosfatidilserina de localización en el prospecto externo de la membrana. Se han examinado los factores que afectan al éxito del protocolo y se han proporcionado condiciones óptimas.

Resumen

La eriftosis, muerte celular programada por eritrocitos, ocurre en una serie de enfermedades hematológicas y durante la lesión de eritrocitos. Un sello distintivo de las células eriptóticas es la pérdida de asimetría compositiva de la membrana celular, lo que conduce a la translocación de fosfatidilserina al prospecto externo de la membrana. Este proceso se desencadena por el aumento de la concentración intracelular de Ca^2+,que activa la escramblasa, una enzima que facilita el movimiento bidireccional de los fosfolípidos entre los foliolos de membrana. Dada la importancia de la eritosis en diversas condiciones enfermas, ha habido esfuerzos para inducir la eritosis in vitro. Tales esfuerzos han confiado generalmente en el ionóforo de calcio, ionomicina, para mejorar la concentración intracelular de Ca²⁺ e inducir la eritosis. Sin embargo, muchas discrepancias se han divulgado en la literatura con respecto al procedimiento para inducir la eritosis usando ionomicina. Aquí, reportamos un protocolo paso a paso para la eritosis inducida por ionomicina en eritrocitos humanos. Nos centramos en pasos importantes en el procedimiento, incluyendo la concentración de ionóforo, el tiempo de incubación y el agotamiento de la glucosa, y proporcionamos un resultado representativo. Este protocolo se puede utilizar para inducir reproduciblemente eritosis en el laboratorio.

Introducción

La muerte celular programada en eritrocitos, también conocida como eritosis, es común en muchas condiciones clínicas y trastornos hematológicos. La eritosis se asocia con la contracción celular y la pérdida de asimetría fosfolípido en la membrana plasmática celular^1,2. La pérdida de asimetría resulta en la translocación de fosfatidilserina (PS), un lípido normalmente localizado en el prospecto interno^3,4, al prospecto externo celular, que indica a los macrófagos a la fagocitosa y eliminar eritrocitos defectuosos⁵,^6,7,8. Al final de la vida útil normal de los eritrocitos, la eliminación de células eriptóticas por macrófagos asegura el equilibrio de los eritrocitos en circulación. Sin embargo, en condiciones enfermas, como la enfermedad de las células falciformes y la talasemia^9,10,11, eritosis mejorada puede resultar en anemia grave². Debido a su importancia en las enfermedades hematológicas, existe un interés significativo en examinar los factores que inducen o inhiben la eritosis y los mecanismos moleculares subyacentes a este proceso.

La membrana plasmática de eritrocitos sanos es asimétrica, con diferentes fosfolípidos localizando en los foliolos externos e internos. La asimetría de la membrana se regula principalmente por la acción de las enzimas de membrana. El translocase de aminofosfolípidos facilita el transporte de aminofosfolípidos, PS y fosfatidiletanolamina (PE), dirigiendo estos lípidos al prospecto interno celular. Por otro lado, floppase transporta la colina que contiene fosfolípidos, fosfatidilcolina (PC) y esfingomielina (SM), desde el interior hasta el foliolo exterior de la membrana celular¹². Sin embargo, a diferencia de las células sanas, la membrana de los eritrocitos erifóticos está revuelta. Esto se debe a la acción de una tercera enzima, la escramblasa, que interrumpe la asimetría fosfolípido facilitando el transporte bidireccional de los aminofosfolípidos^13,14,15,16. Scramblase se activa por niveles intracelulares elevados de Ca^2+. Por lo tanto, los ionoforos de calcio, que facilitan el transporte de Ca²⁺ a través de la membrana celular^12,son inductores eficientes de la eriptosis.

La ionomicina, un ionóforo de calcio, ha sido ampliamente utilizada para inducir la eritosis en eritrocitos^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. La ionomicina tiene grupos hidrófilos e hidrófobos, que son necesarios para unir y capturar el ion Ca^2+, y transportarlo al espacio citosólico^27,28,29. Esto conduce a la activación de la scramblasa y la translocación de PS al prospecto exterior, que se puede detectar fácilmente utilizando annexin-V, una proteína celular con una alta afinidad a PS^12. Aunque la activación de la eritosis por ionomicina se divulga comúnmente, hay una considerable discrepancia de método en la literatura (Tabla 1). La población de eritrocitos sometidos a eriptosis depende de diferentes factores como la concentración de ionóforos, el tiempo de tratamiento con ionóforo y el contenido de azúcar del entorno extracelular (el agotamiento de la glucosa activa los canales catiónicos y facilita la entrada de Ca²⁺ en el espacio citosólico)^30,31. Sin embargo, hay poca consistencia en estos factores en la literatura, lo que dificulta la realización de eritosis reproduciblemente in vitro.

En este protocolo, presentamos un procedimiento paso a paso para inducir la eritosis en eritrocitos humanos. Se examinan los factores que afectan a la eriptosis exitosa, como la concentración de Ca^2+, la concentración de ionoforres, el tiempo de tratamiento y la preincubación en el tampón agotado de glucosa y se notifican valores óptimos. Este procedimiento demuestra que la preincubación de eritrocitos en un tampón libre de glucosa aumenta significativamente el porcentaje de eritosis en comparación con el tampón que contiene glucosa. Este protocolo se puede utilizar en el laboratorio para producir eritrocitos eriptóticos para diversas aplicaciones.

Protocolo

Todas las muestras de sangre humana utilizadas en el protocolo descrito a continuación se compraron como muestras no identificadas. Ningún sujeto humano estuvo directamente involucrado o reclutado para este estudio. Las directrices de la Declaración de Helsinki deben utilizarse cuando la investigación involucre a sujetos humanos.

1. Aislamiento de eritrocitos de sangre entera

1. Añadir 500 l de sangre entera en citrato ácido dextrosa (ACD) (almacenado a 4 oC) a un tubo de microcentrífuga.
   NOTA: Se compró sangre entera en aCD. Según la empresa, 1,5 ml de ACD se añade a 7 ml de sangre entera (8,5 ml de volumen total).
2. Centrifugar toda la sangre a 700 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y eliminar el plasma transparente y la capa fina y ligera con una pipeta para dejar la capa roja de eritrocitos.
3. Preparar 1 L de solución de Ringer que contenga 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 32 mM HEPES, 5 mM de glucosa y 1 mM de CaCl₂. Ajuste el pH a 7,4 añadiendo 2 gotas de 1,0 M De NaOH. Para preparar la solución de Ringer sin glucosa, siga el mismo protocolo, pero no incluya glucosa en la solución.
4. Lavar los eritrocitos 2x en solución Ringer suspendiendo el pellet celular en 1,5 ml de solución de Ringer, centrifugando a 700 x g durante 5 min en RT, y retirando el sobrenadante.
5. Hacer un hematocrito al 0,4% resuponiendo 40 l del pellet de eritrocitos en 9.960 ml de solución de timbre libre de glucosa para alcanzar un volumen final de 10 ml.
   NOTA: Hematocrito es un término utilizado para referirse a la fracción de volumen de eritrocitos en suspensión. Un hematocrito del 0,4% es una suspensión que contiene 0,4% de eritrocitos.
6. Incubar la suspensión celular a 37oC durante 7 días.

2. Tratamiento de eritrocitos con ionomicina y medición de la hemólisis

1. Disolver 1 mg de sal de calcio de ionomicina en 630 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Aliquot y almacenar a -20oC.
2. Tomar 1 mL del hematocrito al 0,4% del paso 1,5 y añadir 0,5 ml de ionomicina de 2 mM para alcanzar una concentración final de 1 M. Incubar durante 2 h a 37oC.
   1. Utilice 1 ml del hematocrito sin tratamiento con ionomicina como control negativo.
3. Centrifugar los hematocritos tratados con ionomicina y no tratados a 700 x g durante 5 min en RT, y retire sus sobrenadores para dejar los gránulos celulares en la parte inferior de los tubos.
4. Lave las células 3 veces con la solución Ringer suspendiendo los pellets celulares en 1,5 ml de solución Ringer, centrifugando a 700 x g durante 5 min a RT y descartando los sobrenatodores.
5. Para medir la hemólisis, añadir 1 ml del hematocrito no tratado 0,4% del paso 1,5 a un tubo de microcentrífuga e incubar durante 2 h a 37 oC como control negativo para la hemólisis (0%).
6. Añadir 1 ml del hematocrito no tratado 0,4% del paso 1,5 a un tubo de microcentrífuga y centrífuga a 700 x g durante 5 min a RT. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de agua destilada al pellet celular e incubar durante 2 h a 37 oC como control positivo para la hemólisis (100%).
7. Añadir 1 ml del hematocrito de la ionomicina tratada con 0,4% del paso 2.2 a un tubo de microcentrífuga.
8. Centrifugar las células no tratadas, las células tratadas y las células en agua destilada a 700 x g durante 5 min a RT.
9. Tome 200 s de los supernatantes y agréguelos a una placa de 96 pocillos.
10. Mida la absorbancia a 541 nm utilizando un lector de microplacas.
11. Calcular la hemólisis usando la Ecuación 1³²:
    
    %Hemolisis (A_T - A₀)/(A₁₀₀ - A₀)*100
    
    donde A₀ es la absorbancia de eritrocitos en la solución de Ringer, A₁₀₀ es la absorción de eritrocitos en el agua, y Una_T es la absorción de eritrocitos tratados por ionomicina.

3. Ensayo vinculante Anexo-V

1. Diluir 2 ml del búfer de unión V de 5x annexin en 8 ml de solución salina con fosfato (PBS) para obtener 1 búfer de unión.
2. Resuspenda los gránulos celulares tratados con ionomicina y no tratados del paso 2.4 en 1 ml de búfer de unión 1x.
3. Tomar 235 l de las suspensiones celulares en el tampón de unión y añadir 15 l de conjugado Annexin V-Alexa Flour 488.
4. Incubar las células a RT durante 20 minutos en un lugar oscuro. Centrífuga a 700 x g durante 5 min en RT y retire el sobrenadante.
5. Lavar las células 2x con 1x tampón de unión, suspendiendo el pellet celular en 1,5 ml del tampón de unión, centrifugando a 700 x g durante 5 min en RT y retirando el sobrenadante.
6. Resuspenda los gránulos celulares en 250 ml de búfer de unión de 1x para mediciones de citometría de flujo.

4. Citometría de flujo

1. Transfiera 200 ml de los eritrocitos teñidos annexin-V a tubos de poliestireno de fondo redondo de 1 ml compatibles con la citometría de flujo.
2. Inicie sesión en el software de citometría de flujo y haga clic en el nuevo botón de experimento. Haga clic en el nuevo botón de tubo. Seleccione la hoja global y elija el análisis de aplicación para medir la intensidad de la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.
3. Establezca el número de células en 20.000 que se recogerán para el análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS).
4. Seleccione el tubo deseado y haga clic en el botón de carga. Haga clic en el botón de registro para mediciones de dispersión hacia delante y dispersión lateral. Repita el proceso para todas las muestras.
5. Haga clic derecho en el botón de la muestra y haga clic en aplicar el análisis por lotes para generar el archivo de resultados.
6. Haga clic derecho en el botón de la muestra y haga clic en generar archivos FSC.
7. Agregue los datos de citometría de flujo (archivos FSC) al lugar de trabajo del software de citometría de flujo.
8. Analice los datos de control seleccionando la población celular de interés y agregando estadísticas para el valor de eritosis.
   1. Haga doble clic en el control y seleccione el histograma frente a la intensidad de la fluorescencia.
   2. Haga clic en el botón de puerta para dibujar una puerta en el histograma que indica el porcentaje de eritosis.
9. Aplique las mismas estadísticas para todos los demás tubos experimentales para obtener los valores de eritosis. Haga clic con el botón derecho en el control y seleccione copiar análisis para agrupar.
10. Después de hacer correctamente todas las muestras, transfiera los datos analizados arrastrándolos y soltándolos en el editor de diseño.
    1. Superponer los datos analizados con control en el editor de diseño.
    2. Establezca los histogramas e intensidades deseados cambiando los ejes x e y de los gráficos superpuestos.
    3. Exporte archivos de imagen haciendo clic en el botón de exportación y guarde los gráficos en la ubicación deseada.

5. Microscopía confocal

1. Transfiera 5 l de células teñidas anexión en V en una diapositiva del microscopio y cúbrala con un resbalón de la cubierta. Mantener en un lugar oscuro para evitar el fotoblanqueo.
2. Utilice el láser de argón del microscopio de fluorescencia confocal para observar las células excitadas a 488 nm con las ampliaciones deseadas.
   NOTA: No es necesariamente necesario un microscopio confocal y cualquier microscopio con capacidades de fluorescencia se puede utilizar para obtener imágenes de fluorescencia que demuestren la unión anexión-V.
3. Obtener imágenes de fluorescencia del control (células no tratadas) y células tratadas.
   NOTA: Se espera que las células no tratadas muestren señales de fluorescencia muy débiles, mientras que se espera que las células tratadas muestren fluorescencia verde brillante en sus membranas.

Resultados

Optimización de la concentración de ionomicina

Mientras que la ionomicina es necesaria para inducir la eritosis, el aumento de las concentraciones de ionomicina puede conducir a la hemólisis (es decir, lisis de eritrocitos y liberación de hemoglobina), que debe evitarse. El tratamiento de los eritrocitos con 1 M de ionomicina en solución de timbre durante 2 h es suficiente para inducir la eritosis, como lo ...

Discusión

El objetivo de este procedimiento es proporcionar valores óptimos para la concentración de ionóforo, el tiempo de tratamiento y la concentración de glucosa extracelular, que son factores importantes para garantizar la inducción exitosa de la eritosis. Un paso crítico en el protocolo es el agotamiento de la glucosa extracelular, que, a pesar de su importancia, no ha sido suficientemente enfatizado en la literatura. El contenido de azúcar en la solución normal de Ringer (5 mM) tiene un efecto inhibitorio sobre la e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use