칼슘 이오노포어를 사용하여 적혈구에 있는 에리녹증의 유도

요약

적혈구에서 적혈구의 세포 사멸, 칼슘 이오노포어, 요오마이신을 사용하여 적혈구의 유도를위한 프로토콜이 제공됩니다. 성공적인 에적엽증은 막 외부 전단지에서 국소화 포스파티딜세린을 모니터링하여 평가됩니다. 프로토콜의 성공에 영향을 미치는 요인을 검토하고 최적의 조건을 제공했습니다.

초록

적혈구, 적혈구 프로그램 세포 사멸, 혈액 학적 질환의 숫자와 적혈구 부상 동안 발생합니다. 홍반 세포의 특징은 세포막의 조성 비대칭의 손실이며, 막 외부 전단지로 포스 파티딜세린의 전좌로 이어진다. 이 과정은^Ca2+의세포 내 농도 증가에 의해 유발되며, 이는 멤브레인 리플렛 사이의 인지질의 양방향 이동을 용이하게하는 효소인 스크램블라제를 활성화시킵니다. 다양한 질병 조건에서 에적혈구증의 중요성을 감안할 때, 시험관내에서에리프토시스를 유도하기 위한 노력이 있었다. 이러한 노력은 일반적으로 칼슘 이오노포어, 요오마이신에 의존하여 세포내 Ca²⁺ 농도를 향상시키고 에리프토증을 유발합니다. 그러나, 많은 불일치는 요오마이신을 사용하여 에적ptosis를 유도하기위한 절차에 관한 문헌에서보고되었다. 본 명세서에서, 우리는 인간 적혈구에서 이오노마이신 유도 적혈구에 대한 단계별 프로토콜을 보고한다. 우리는 이오노포어 농도, 배양 시간 및 포도당 고갈을 포함하여 절차의 중요한 단계에 집중하고, 대표적인 결과를 제공합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 재생성 적으로 홍채증을 유도하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

적혈구에서 프로그래밍 된 세포 죽음, 또한 적혈구로 알려진, 많은 임상 조건 및 혈액 학적 장애에서 일반적이다. 에반색은 세포혈장막^1,2에서세포 수축 및 인지질 비대칭의 손실과 관련이 있다. 비대칭의 손실은 내부 전단지^3,4에국한된 지질인 포스파티딜세린(PS)의 전좌를 초래하며, 이는 세포 외부 리플렛에, 이는 식세포에 대식세포를 신호하고 결함이 있는 적혈구^5,6,7,8을제거한다. 적혈구의 정상적인 수명이 끝나면 대식세포에 의한 적혈구 세포를 제거하면 순환에 적혈구의 균형이 보장됩니다. 그러나, 겸상적혈구 및 탈라세미증^9,10,11,강화된 적혈구와 같은 병든^{조건에서는}심한 빈혈을 초래할 수 있다 2. 혈액학적 인 질병에 그것의 중요성 때문에, 이 프로세스의 밑에 있는 적혈구및 분자 기계장치를 유도하거나 억제하는 요인을 검토에 있는 중요한 관심사가 있습니다.

건강한 적혈구의 혈장 막은 비대칭이며, 다른 인지질이 외부 및 내부 전단지에 국한됩니다. 막 비대칭은 주로 막 효소의 작용에 의해 조절됩니다. 아미노포스포이시드 트랜스로케이스는 이러한 지질을 세포 내부 리플렛으로 유도하여 아미노포스포이시드, PS 및 포스파티딜레탄아민(PE)의 수송을 용이하게 한다. 한편, 플롭파제는 인지질, 포스파티딜콜린(PC) 및 스핑고미엘린(SM)을 함유하는 콜린을^{세포막(12)의}외부 리플렛으로 내부에서 수송한다. 그러나 건강한 세포와 달리 적혈구의 막이 스크램블됩니다. 이것은 아미노포스포이시드^{13,14,15,16의}양방향 수송을 촉진하여 인지질 비대칭을 방해하는 제 3 효소 인 스크램블라제의 작용에 기인한다. 스크램블라제는 Ca²⁺이상의 높은 세포내 수준에 의해 활성화됩니다. 따라서^{세포막(12)을}가로질러^Ca2+의 수송을 용이하게 하는 칼슘 이온포르는 적색증의 효율적인 유도제이다.

요오노마이신, 칼슘 이오노포어는 적혈구^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26에서}적혈구를 유도하는 데 널리 사용되어 왔다. 이오노마이신은^Ca2+ 이온을 결합하고 포획하는 데 필요한 친수성 및 소수성 그룹을 모두 가지고 있으며, 이를 세포순환 공간^27,28,29로수송한다. 이는 PS^12에대한 높은 친화성을 가진 세포 단백질인 annexin-V를 사용하여 쉽게 검출될 수 있는 외부 리플렛으로의 스크램블라제 및 전좌의 활성화를 유도한다. 이오노마이신에 의한 에릭토증을 유발하는 것은 일반적으로 보고되지만, 문헌에 상당한 방법 불일치가있다(표 1). 적혈구의 인구는 이오노포어 농도, 이오노포어를 통한 치료 시간 및 세포외 환경의 당도(포도당 고갈이 양이온 채널을 활성화하고 Cytosolic 공간으로^Ca2+의 진입을 용이하게 함)^30,31과같은 다른 요인에 의존한다. 그러나, 문헌에서 이러한 요인에 약간의 일관성이 있어 시험관 내에서에리프토증을 재현하기 어렵게 만듭니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 인간 적혈구에 있는 홍색토증을 유도하는 단계별 절차를 제시합니다. Ca²⁺ 농도, 이오노포어 농도, 치료 시간 및 포도당 고갈 된 완충제의 사전 배양을 포함하여 성공적인 에적혈관증에 영향을 미치는 요인을 검사하고 최적의 값이보고됩니다. 이 절차는 포도당 없는 완충액에 있는 적혈구의 사전 배양이 포도당 함유 완충액에 비해 적색지대의 백분율을 현저하게 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다양한 응용 프로그램에 대한 적혈구 적혈구를 생산하기 위해 실험실에서 사용할 수 있습니다.

프로토콜

아래에 기술된 프로토콜에 사용된 모든 인간 혈액 샘플은 비식별 샘플로서 구입하였다. 어떤 인간 과목이 직접 참여 하거나이 연구에 대 한 모집 했다. 헬싱키 선언의 지침은 연구가 인간의 과목을 포함 할 때 사용되어야한다.

1. 전혈로부터적혈구 분리

1. 500 μL의 전혈을 산구연산 덱스트로스(ACD)(4°C에서 보관)에 미세원심지 튜브에 넣습니다.
   참고: 전혈은 ACD에서 구입했습니다. 회사에 따르면, ACD의 1.5 mL는 전혈의 7 mL에 추가됩니다 (8.5 mL 총 부피).
2. 전피를 700 x g에서 실온(RT)에서 5분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 투명한 플라즈마와 얇은 버피 코트를 제거하여 적혈구 층을 남긴다.
3. 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO_4,32 mM HEPES, 5 mM 포도당 및 1 mM CaCl_2를포함하는 링거 용액 1 L을 준비합니다. pH를 1.0 M NaOH의 2 μL 방울을 추가하여 7.4로 조정합니다. 포도당 없는 링거 용액을 준비하려면 동일한 프로토콜을 따르지만 용액에 포도당을 포함하지 마십시오.
4. 링거 용액의 1.5 mL에 세포 펠릿을 일시 중단하고 RT에서 5 분 동안 700 x g에서 원심분리하고 상한자를 제거하여 링거 용액에서 적혈구 2 x를 씻으십시오.
5. 포도당 프리 링거 용액의 9,960 μL에서 적혈구 펠릿40 μL을 재중단하여 0.4% 혈전을 만들어 최종 부피에 도달하여 10 mL의 최종 부피에 도달합니다.
   참고 : 헤마토크릿은 현탁액에서 적혈구의 부피 분율을 참조하는 데 사용되는 용어입니다. 0.4% 혈중 혈술은 0.4% 적혈구를 함유하는 현탁액이다.
6. 세포 현탁액을 37°C에서 7일 동안 배양합니다.

2. 요오마이신으로 적혈구 치료 및 간혈측정

1. 630 μl의 디메틸 설폭화물(DMSO)에 이오노마이신 칼슘 염 1 mg을 용해하여 최종 농도 2 mM에 도달합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.
2. 단계 1.5에서 0.4% 헤마토크릿의 1 mL을 취하고 37°C에서 2 시간 동안 인큐베이트의 최종 농도에 도달하기 위해 2 mM 요오마이신의 0.5 μL을 추가합니다.
   1. 부정 대조군으로 요오마이신 치료없이 헤마토크릿 1 mL을 사용하십시오.
3. 이오노마이신 처리 및 처리되지 않은 헤마토크릿을 RT에서 5분 동안 700 x g으로 원심분리하고, 관 의 바닥에 세포 펠릿을 남기도록 그들의 상황제를 제거한다.
4. 링거 용액의 1.5 mL에서 세포 펠릿을 일시 중단하고 RT에서 5 분 동안 700 x g에서 원심분리하고 슈퍼 나탄제를 폐기하여 링거 용액으로 세포를 3 x 씻어.
5. 용혈을 측정하기 위해, 치료되지 않은 0.4% 헤마토크릿 1 mL을 1.5 단계에서 미세 원심분리튜브에 넣고 용혈에 대한 네거티브 대조군으로 37°C에서 2시간 동안 배양한다(0%).
6. 처리되지 않은 0.4% 헤마토크릿 1mL을 1.5단계에서 마이크로원심지 튜브및 원심분리기로 5분 동안 700 x g으로 추가하고, 상구체를 제거하고 1 mL의 증류수를 세포 펠릿에 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양하여 37°C에서 투석(10%)을 양성대조한다(10%).
7. 2.2단계에서 0.4% 헤마토크릿을 미세원심지 튜브에 1 mL의 요오마이신 처리하였습니다.
8. 처리되지 않은 세포, 처리된 세포 및 증류수내의 세포를 RT에서 5분 동안 700 x g으로 원심분리한다.
9. 200 μL의 초자연자를 가지고 96 웰 플레이트에 추가하십시오.
10. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 541 nm에서 흡광도를 측정합니다.
11. 방정식 1^32를사용하여 용혈을 계산 :
    
    %용혈 =_{(A T} - A 0)/(A₁₀₀ - A_0)*100
    
    여기서 A_0은 링거 용액에서 적혈구의 흡광도이며, A_100은 물에서 적혈구의 흡광도이고,_AT는 요오마이신에 의한 치료된 적혈구의 흡광도이다.

3. 부속서-V 결합 분석

1. 인산완충식염수(PBS)의 8 mL에서 5x 아넥신 V 결합 완충액의 2 mL를 희석하여 1x 결합 완충액을 얻었다.
2. 1x 결합 완충액의 1 mL에서 2.4 단계에서 요오마이신 처리 및 처리되지 않은 세포 펠릿을 재중단.
3. 결합 완충액에서 세포 현탁액 의 235 μL을 취하고 아넥신 V-알렉사 가루 488 컨쥬게이트의 15 μL을 추가합니다.
4. 어두운 곳에서 20 분 동안 RT에서 세포를 배양하십시오. RT에서 5 분 동안 700 x g의 원심 분리기를 제거하고 상류를 제거하십시오.
5. 1x 결합 버퍼로 세포를 2x 세척하고, 결합 버퍼의 1.5 mL에서 세포 펠릿을 현탁시키고, RT에서 5분 동안 700 x g에서 원심분리하고 상급자를 제거하였다.
6. 유세포 분석 측정을 위해 1x 결합 버퍼의 250 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.

4. 유세포분석

1. 유세포분석과 호환되는 1 mL 라운드 바닥 폴리스티렌 튜브에 아넥신-V 염색 적혈구의 200 μL을 전송한다.
2. 유세포 분석 소프트웨어에 로그인하고 새 실험 버튼을 클릭합니다. 새 튜브 버튼을 클릭합니다. 전역 시트를 선택하고 적용 분석을 선택하여 488 nm의 여기 파장과 530 nm의 방출 파장으로 형광 강도를 측정합니다.
3. 형광 활성화 세포 선별(FACS) 분석을 위해 수집될 셀 수를 20,000개로 설정합니다.
4. 원하는 튜브를 선택하고 로드 버튼을 클릭합니다. 전진 분산 및 측면 분산 측정을 위해 기록 버튼을 클릭합니다. 모든 샘플에 대해 반복합니다.
5. 표본 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 배치 분석을 적용하여 결과 파일을 생성합니다.
6. 표본 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 FSC 파일을 생성을클릭합니다.
7. 유세포 분석 데이터(FSC 파일)를 유세포 분석 소프트웨어의 작업부분에 추가합니다.
8. 관심 있는 세포 집단을 선택하고 에리프토시스 값에 대한 통계를 추가하여 제어 데이터를 분석합니다.
   1. 제어를 두 번 클릭하고 형광 강도 대 히스토그램을 선택합니다.
   2. 게이트 버튼을 클릭하여 히스토그램에 대한 게이트를 그려 적혈구의 백분율을 나타냅니다.
9. 다른 모든 실험 튜브에 대해 동일한 통계를 적용하여 홍반증 값을 얻습니다. 컨트롤을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 복사 분석을 선택하여 그룹.
10. 모든 샘플을 올바르게 게이팅한 후 분석된 데이터를 드래그하여 레이아웃 편집기로 전송합니다.
    1. 레이아웃 편집기에서 컨트롤을 사용하여 분석된 데이터를 오버레이합니다.
    2. 중첩된 그래프의 x 축과 y축을 변경하여 원하는 히스토그램과 강도를 설정합니다.
    3. 내보내기 버튼을 클릭하여 이미지 파일을 내보내고 원하는 위치에 그래프를 저장합니다.

5. 공초점 현미경 검사법

1. 현미경 슬라이드에 아넥신-V 염색 세포의 5 μL을 전송하고 커버 슬립으로 덮습니다. 광표백을 방지하기 위해 어두운 곳에 보관하십시오.
2. 공초점 형광 현미경의 아르곤 레이저를 사용하여 원하는 배율로 488 nm에서 흥분된 세포를 관찰합니다.
   참고: 공초점 현미경이 반드시 필요한 것은 아니며 형광 기능이 있는 현미경을 사용하여 annexin-V 결합을 입증하는 형광 이미지를 얻을 수 있습니다.
3. 대조군(비처리된 세포) 및 처리된 세포의 형광 이미지를 얻는다.
   참고: 처리되지 않은 세포는 그들의 막에 밝은 녹색 형광을 보여주기 위하여 예상되는 반면, 처리된 세포는 아주 약한 형광 신호를 보여주기 위하여 예상됩니다.

결과

이오노마이신 농도 최적화

이오노마이신은 홍색증을 유도하는 데 필요한 반면, 증가 된 요오마이신 농도는 혈우만에 발생할 수 있습니다 (즉, 적혈구의 포해와 헤모글로빈의 방출), 이는 피해야 할 필요가있다. 링거 용액에서 1 μM 요오마이신을 2 시간 동안 적혈구로 처리하면 아넥신-V 알렉사 가루 488 컨쥬게이트?...

토론

이 절차의 목표는 이오노포어 농도, 치료 시간 및 적색증의 성공적인 유도를 보장하는 데 중요한 요소인 세포외 포도당 농도에 대한 최적의 값을 제공하는 것입니다. 프로토콜의 중요한 단계는 그 중요성에도 불구하고 문헌에서 충분히 강조되지 않은 세포 외 포도당의 고갈입니다. 정상 링거 용액 (5 mM)의 당도는 에리펙트증에 억제 효과가 있습니다. 세포 외 환경에서 포도당 고갈은 세포 스트레?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use