Индукция эриптоза в клетках красных кровяных клеток с использованием ионофора кальция

Резюме

Предусмотрен протокол индукции эриптоз, запрограммированный клеточной смерти в эритроцитах, с использованием ионофора кальция, иономицина. Успешный эриптоз оценивается путем мониторинга локализации фосфатидилсерина во мембранной внешней листовке. Были изучены факторы, влияющие на успешность протокола, и обеспечены оптимальные условия.

Аннотация

Эриптоз, эритроцит запрограммированной клеточной смерти, возникает при ряде гематологических заболеваний и при травме эритроцитов. Отличительной чертой эриптотических клеток является потеря композиционной асимметрии клеточной мембраны, что приводит к транслокации фосфатидилсерина в мембранную внешнюю листовку. Этот процесс вызван повышенной внутриклеточной концентрацией Ca^{2 ,}который активирует скремблаз, фермент, который облегчает двунаправленное движение фосфолипидов между мембранными листовками. Учитывая важность эриптоз в различных заболеваний, были предприняты усилия, чтобы вызвать эриптоз в пробирке. Такие усилия, как правило, опирались на ионофор кальция, иономицин, для повышения внутриклеточной концентрации Ca^{2 "и} вызвать эриптоз. Тем не менее, многие расхождения были зарегистрированы в литературе в отношении процедуры индуцирования эриптоз с использованием иомамицина. В этом мы сообщаем о поэтапном протоколе для иономицина индуцированного эриптозва в эритроцитах человека. Мы фокусируемся на важных шагах в процедуре, включая концентрацию ионофора, время инкубации и истощение глюкозы, и обеспечиваем репрезентативный результат. Этот протокол может быть использован для воспроизводимого индуцирования эриптоза в лаборатории.

Введение

Запрограммированная гибель клеток в эритроцитах, также известных как эриптоз, распространена во многих клинических условиях и гематологических расстройствах. Eryptosis связано с усадкой клеток и потерей фосфолипидной асимметрии в мембране плазмы клетки^1,2. Потеря асимметрии приводит к транслокации фосфатидилсерина (PS), липида, обычно локализуемого во внутренней листовке^3,4, к клеточной внешней листовке, которая сигнализирует макрофагам на фагоциты и удаляет дефектные эритроциты^5,6,7,8. В конце нормальной продолжительности жизни эритроцитов удаление эриптотических клеток макрофагами обеспечивает баланс эритроцитов в обращении. Однако, в болезненных условиях, таких как серповидно-клеточная болезнь и талассемия^9,10,11, повышенный эриптоз может привести к тяжелой анемии². Из-за его важности в гематологических заболеваний, существует значительный интерес к изучению факторов, вызывающих или ингибирующих эриптоб и молекулярных механизмов, лежащих в основе этого процесса.

Плазменная мембрана здоровых эритроцитов асимметрична, с различными фосфолипидами, локализующихся на наружных и внутренних листовках. Мембранная асимметрия в первую очередь регулируется действием мембранных ферментов. Аминофосфолипид транслокс облегчает транспортировку аминофосфолипидов, PS и фосфатидиэтаноламин (ПЭ), направляя эти липиды на клеточной внутренней листовке. С другой стороны, флоппас транспортирует холин, содержащий фосфолипиды, фосфатидилхолин (ПК) и сфингомиелин (СМ), от внутренней к внешней листовке клеточной мембраны¹². Однако, в отличие от здоровых клеток, мембрана эритроцитов скремблируется. Это связано с действием третьего фермента, скремблаза, который нарушает фосфолипидную асимметрию, облегчая двунаправленный перенос аминофосфолипидов^13,14,15,16. Scramblase активируется повышенными внутриклеточными уровнями Ca^{2 .} Таким образом, ионофоры кальция, которые облегчают транспортировку Ca^{2 "через} клеточную мембрану¹², являются эффективными индукторами эриптоса.

Иономицин, ионофор кальция, широко используется для индуцирования эриптоза в эритроцитах^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. Иономицин имеет как гидрофильные, так и гидрофобные группы, которые необходимы для связывания и захвата иона Ca^{2 и} транспортировать его в цитозолическое пространство^27,28,29. Это приводит к активации скремблаза и транслокации PS на внешнюю листовку, которая может быть легко обнаружена с помощью приложения-V, клеточного белка с высоким сродством к PS¹². Хотя запуск эриптоза иомамицином обычно сообщается, есть значительное расхождение метода в литературе (Таблица 1). Популяция эритроцитов, проходящих эриптоз, зависит от различных факторов, таких как концентрация ионофора, время лечения ионофором, а также содержание сахара в внеклеточной среде (истощение глюкозы активирует каналы катионов и облегчает вхождение Ca^{2 в} цитозоликическое пространство)^30,31. Тем не менее, есть мало последовательности в этих факторов в литературе, что затрудняет выполнение эриптоза воспроизводимо in vitro.

В этом протоколе мы представляем пошаговую процедуру, чтобы вызвать эритроциты человека. Учитываются факторы, влияющие на успешный эрипток, включая концентрацию Ca^2, концентрацию ионофора, время лечения и предварительное инкубацию в глюкозно-обеденный буфер и сообщается об оптимальных значениях. Эта процедура показывает, что прединкубация эритроцитов в буфере без глюкозы значительно увеличивает процент эриптоза по сравнению с глюкозосодержащим буфером. Этот протокол может быть использован в лаборатории для производства эриптотических эритроцитов для различных применений.

протокол

Все образцы крови человека, использованные в описанном ниже протоколе, были приобретены в качестве деидентифицированных образцов. Ни один человек не был непосредственно вовлечен или набран для этого исследования. Руководящие принципы Хельсинкской декларации должны использоваться в том случае, если исследования затрагивают людей.

1. Эритроцитная изоляция от цельной крови

1. Добавьте 500 л цельной крови в кислотную цитрат декстрозу (ACD) (хранящуюся при 4 градусах Цельсия) в микроцентрифугную трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вся кровь была приобретена в ACD. По данным компании, к 7 мл цельной крови добавляется 1,5 мл ACD (общий объем 8,5 мл).
2. Centrifuge всю кровь на 700 х г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) и удалить прозрачная плазма и тонкий шафлы пальто с помощью пипетки, чтобы оставить красный слой эритроцита.
3. Подготовьте 1 l раствора Ringer, содержащего 125 мм NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgSO_4,32 мМ HEPES, 5 мм глюкозы и 1 мМ CaCl₂. Отрегулируйте рН до 7,4, добавив 2 капли на 1,0 МН. Чтобы подготовить без глюкозное решение Ringer, следуйте тому же протоколу, но не включайте глюкозу в раствор.
4. Вымойте эритроциты 2x в растворе Ringer, приостановив клеточные гранулы в 1,5 мл раствора Ringer, центрифугируя при 700 х г в течение 5 мин на РТ, и удалив супернатант.
5. Сделайте 0,4% гематокрит, отодвинив 40 л гранул эритроцита в 9960 л раствора Ringer без глюкозы, чтобы достичь конечного объема 10 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гематокрит это термин, используемый для обозначения объема фракции эритроцитов в подвеске. Гематокрит 0,4% - это суспензия, содержащая 0,4% эритроцитов.
6. Инкубировать суспензию клетки при 37 градусах По Цельсию в течение 7 дней.

2. Лечение эритроцитов иономицином и измерение гемолиза

1. Растворите 1 мг иономицина соли кальция в 630 л диметилсульксида (ДМСО) для достижения конечной концентрации в 2 мМ. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
2. Возьмите 1 мл гематокрит 0,4% со ступени 1,5 и добавьте 0,5 л 2 ММ иомомицина, чтобы достичь конечной концентрации 1 м/м. Инкубировать 2 ч при 37 градусах Цельсия.
   1. Используйте 1 мл гематокрит без лечения иономицином в качестве отрицательного контроля.
3. Centrifuge иономицин лечения и необработанных гематократов на 700 х г в течение 5 минут на RT, и удалить их супернатанты, чтобы оставить клетки гранулы в нижней части труб.
4. Вымойте клетки 3x с ringer раствор, подвенив клеточные гранулы в 1,5 мл раствора Ringer, центрифугирование на 700 х г в течение 5 минут на RT и отбрасывая супернатанты.
5. Для измерения гемолиза добавьте 1 мл необработанного 0,4% гематокрита от ступени 1,5 до микроцентрифуговой трубки и инкубируют в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия в качестве отрицательного контроля гемолиза (0%).
6. Добавьте 1 мл необработанного 0,4% гематокрита от шага 1,5 до микроцентрифуги трубки и центрифуги при 700 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и добавьте 1 мл дистиллированной воды в пеллету клетки и инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах по Цельсию в качестве положительного контроля при гемолизе (100%).
7. Добавьте 1 мл обработанного иомицина 0,4% гематокрита от ступени 2.2 до микроцентрифуговой трубки.
8. Центрифуги необработанных клеток, обработанных клеток, и клетки в дистиллированной воде на 700 х г в течение 5 мин на RT.
9. Возьмите 200 л супернатантов и добавьте в 96-колодую пластину.
10. Измерьте абсорбцию на уровне 541 нм с помощью микроплитного считывателя.
11. Рассчитайте гемолиз с помощью уравнения 1³²:
    
    %Гемолиз_{(A T} - A₀)/(A₁₀₀ -₀)
    
    где A₀ является поглощение эритроцитов в растворе Ringer, A₁₀₀ является поглощение эритроцитов в воде, и_{A T} является поглощение обработанных эритроцитов иономицином.

3. Привязка Annexin-V

1. Разбавить 2 мл 5x annexin V связывающий буфер в 8 мл фосфат-буферного солева (PBS) для получения 1x связывающего буфера.
2. Отрежь иономицин-обработанные и необработанные гранулы клетки от шага 2.4 в 1 mL 1x связывающем буфера.
3. Возьмите 235 qL клеточных суспензий в связывающем буфере и добавьте 15 зл и конъюгированной муки Annexin V-Alexa.
4. Инкубировать клетки на RT в течение 20 минут в темном месте. Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин на RT и удалить супернатант.
5. Вымойте клетки 2x с 1x связывающий буфер, приостановив клетки гранулы в 1,5 мл связывающего буфера, центрифугирование на 700 х г в течение 5 минут на RT и удаление супернатанта.
6. Повторите пеллеты клеток в 250 л 1x связывающего буфера для измерения цитометрии потока.

4. Цитометрия потока

1. Передача 200 зл иэрроцитов аннексии-V в 1 мл круглых нижних полистироловых труб, совместимых с цитометрией потока.
2. Войти в поток цитометрии программного обеспечения и нажмите на новую кнопку эксперимента. Нажмите на новую кнопку трубки. Выберите глобальный лист и выберите анализ применения для измерения интенсивности флуоресценции с длиной волн возбуждения 488 нм и длиной волны выбросов 530 нм.
3. Установите количество ячеек до 20 000, которые будут собраны для анализа сортировки клеток, активированных флуоресценцией (FACS).
4. Выберите нужную трубку и нажмите на кнопку нагрузки. Нажмите на кнопку записи для измерения рассеяния вперед и бокового рассеяния. Повторите для всех образцов.
5. Нажмите правой кнопкой «Образец» и нажмите на применить пакетный анализ для создания файла результата.
6. Нажмите правой кнопкой «Образец» и нажмите на генерацию файлов FSC.
7. Добавьте данные цитометрии потока (файлы FSC) на рабочее место программного обеспечения цитометрии потока.
8. Проанализируйте контрольные данные, выбрав интересующую группу клеток и добавив статистику стоимости эриптобиса.
   1. Дважды нажмите на контроль и выберите гистограмму против интенсивности флуоресценции.
   2. Нажмите на кнопку ворот, чтобы нарисовать ворота на гистограмме, которая указывает процент эриптоза.
9. Применить ту же статистику для всех других экспериментальных труб для получения значений эриптоз. Нажмите право йняж на элемент управления и выберите анализ копий в группу.
10. После правильного удаления всех образцов перенесите проанализированные данные путем перетаскивания и сброса их в редактор макета.
    1. Накладывайте анализируемые данные с помощью управления в редакторе макета.
    2. Установите желаемые гистограммы и интенсивности, изменив ось x и y накладных графиков.
    3. Экспорт файлы изображений, нажав на кнопку экспорта и сохранить графики в нужном месте.

5. Конфокальная микроскопия

1. Передача 5 Зл аннексии-V-окрашенных клеток на слайд микроскопа и покрыть его крышкой скольжения. Хранить в темном месте, чтобы предотвратить фотоотбеление.
2. Используйте аргонный лазер конфокального флуоресцентного микроскопа для наблюдения за клетками, возбужденными при 488 нм с желаемыми увеличениями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальный микроскоп не обязательно нужен, и любой микроскоп с возможностями флуоресценции может быть использован для получения флуоресценции изображения, которые демонстрируют привязки annexin-V.
3. Получайте флуоресценцию изображения контрольных (необработанных клеток) и обработанных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные клетки, как ожидается, показывают очень слабые сигналы флуоресценции, в то время как обработанные клетки, как ожидается, показывают ярко-зеленую флуоресценцию на их мембранах.

Результаты

Оптимизация концентрации иомицина

В то время как иономицин необходим для индуцирования эриптоза, увеличение концентрации иомицина может привести к гемолизу (т.е. лизозу эритроцитов и высвобождению гемоглобина), чего необход?...

Обсуждение

Целью данной процедуры является обеспечение оптимальных значений концентрации ионофора, времени лечения и внеклеточной концентрации глюкозы, которые являются важными факторами обеспечения успешной индукции эриптобиа. Важным шагом в протоколе является истощение внеклеточной глюко?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use