カルシウムイオノフォアを用いた赤血球中の赤血球誘導

要約

赤血球の誘導のためのプロトコルは、赤血球における細胞死をプログラムし、イオノフォアカルシウム、イオノマイシン、を使用して、提供される。成功したエリプトーシスは、膜外葉ペレット中の局在ホスファチジルセリンをモニタリングすることによって評価される。プロトコルの成功に影響を与える要因が検討され、最適な条件が提供されています。

要約

赤血球は、細胞死をプログラムし、多くの血球疾患および赤血球への損傷の間に起こる。赤血球の特徴は、細胞膜の組成非対称性の喪失であり、膜外葉にホスファチジルセリンの転座につながる。このプロセスは、膜リーフレット間のリン脂質の双方向移動を促進する酵素であるスクランバゼを活性化する^Ca2+の細胞内濃度の増加によって引き起こされます。様々な疾患状態における赤血球症の重要性を考えると、インビトロで赤血球症を誘発する取り組みが行われてきた。このような努力は、一般に、カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、細胞内^Ca2+濃度を増強し、赤血球症を誘発することに依存してきた。しかしながら、ヨーノマイシンを用いてエリプトーシスを誘導する手順に関して、文献には多くの不一致が報告されている。本明細書では、ヒト赤血球におけるイオノマイシン誘発性赤血球に対する段階的なプロトコルを報告する。イオノフォア濃度、インキュベーション時間、グルコース枯渇などの重要なステップに焦点を当て、代表的な結果を提供します。このプロトコルは、実験室で再現的に赤血球症を誘発するために使用することができる。

概要

赤血球のプログラム細胞死は、赤血球とも呼ばれ、多くの臨床状態および血腫性疾患で一般的である。赤血球症は、細胞形質膜^1、2における細胞収縮およびリン脂質非対称性の喪失に関連する。非対称性の喪失は、通常内側リーフレット^3、4に局在する脂質であるホスファチジルセリン(PS)を細胞外リーフレットに転位させ、マクロファージにシグナルを送り、欠陥のある赤血球^{5、6、7、8}を除去する。赤血球の正常寿命の終わりに、マクロファージによる赤血球の除去は、循環中の赤血球のバランスを保証する。しかしながら、鎌状赤血球症およびサラセミア^9、10、11などの疾患状態では、赤血球症の増強が重症貧血²をもたらし得る。血行性疾患における重要性から、赤血球症を誘発または阻害する因子と、この過程の基礎となる分子機構を調べることに大きな関心がある。

健康な赤血球の形質膜は非対称であり、異なるリン脂質が外側と内側のリーフレットに局在する。膜非対称性は、主に膜酵素の作用によって調節される。アミノリン脂質トランスロカーゼは、アミノリン脂質、PSおよびホスファチジルエタノールアミン(PE)の輸送を促進し、これらの脂質を細胞内リーフレットに導くことによって。一方、フロフパーゼは、リン脂質を含むコリンを輸送し、ホスファチジルコリン(PC)およびスフィンゴミエリン(SM)を、細胞膜¹²の内側から外側のリーフレットに輸送する。しかし、健康な細胞とは異なり、赤球の膜はスクランブルされます。これは、第3の酵素の作用によるもので、スクランバゼは、アミノリン脂質13、14、15、16の双方向輸送を促進することによりリン脂質非対称性を破壊する。スクランマゼは^、Ca2+の高い細胞内レベルによって活性化される。従って、細胞膜¹²を横切る^Ca2+の輸送を容易にするカルシウムイオノフォアは、赤血球症の効率的な誘導剤である。

イオノマイシンは、イオノフォアカルシウムであり、赤血球12、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26で赤血球中の赤血球を誘導するために広く使用されている。イオノマイシンは^、Ca2+イオンを結合および捕捉し、それを細胞質空間^27、28、29に輸送するために必要な親水性基および疎水性基の両方を有する。これは、スクランブラーゼの活性化およびPSの外側リーフレットへの転位につながり、これは^、PS12に対する親和性が高い細胞タンパク質であるアネキシンVを用いて容易に検出することができる。イオノマイシンによるエリプトーシスの誘発は一般的に報告されているが、文献にはかなりの方法の不一致がある(表1)。赤血球の集団は、イオノフォア濃度、イオノフォアによる治療時間、および細胞外環境の糖度(グルコース枯渇がカチオンチャネルを活性化し、細胞質空間への^Ca2+の侵入を容易にする^)30、31などの異なる要因に依存する。しかし、文献ではこれらの因子にはほとんど一貫性がなく、インビトロで再現的に赤血球症を行うことが困難である。

このプロトコルでは、ヒト赤血球において赤血球を誘導する段階的な手順を提示する。^Ca2+濃度、イオノフォア濃度、治療時間、グルコース枯渇緩衝液中のプレインキュベーションを含む成功したエリプトーシスに影響を与える因子を調べ、最適な値が報告される。この手順は、グルコースフリー緩衝液中の赤血球のプレインキュベーションが、グルコース含有緩衝液と比較して赤血球症の割合を有意に増加することを示す。このプロトコルは、様々な用途に対して赤血球を作製するために実験室で使用することができます。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

以下に説明するプロトコルで使用されるすべてのヒト血液サンプルは、非同定サンプルとして購入された。この研究に直接関与したり募集したりしたヒト被験者は一人もいない。ヘルシンキ宣言のガイドラインは、研究が人間の被験者を含む場合に使用する必要があります。

1. 全血からの赤血球分離

1. 酸クエン酸デキストロース(ACD)に500μLの全血を加え(4°Cで保存)、マイクロ遠心管に加えます。
   注:全血はACDで購入されました。同社によると、1.5 mLのACDが全血7mL(総量8.5mL)に添加される。
2. 室温(RT)で700 x gで全血を遠心分離し、ピペットを使用して透明なプラズマと薄いバフィーコートを取り除き、赤赤血球層を残します。
3. 125 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgSO_4、32mM HEPES、5 mM グルコース、および 1 mM CaCl₂を含むリンガー溶液の1 Lを調製する。1.0 M NaOHの2 μLドロップを加えて、pHを7.4に調整します。グルコースフリーリンガー溶液を調製するには、同じプロトコルに従うが、溶液中にグルコースを含めない。
4. リンジャー溶液の1.5 mLで細胞ペレットを一時停止し、RTで700 x gで遠心分離し、上清を除去して、リンジャー溶液中の赤血球2xを洗浄する。
5. 赤血球ペレットの40°Lを9,960°Lのグルコースフリーリンガー溶液に再サスペンドして0.4%ヘマトクリットを作り、最終体積10mLに達します。
   注:ヘマトクリットは、懸濁液中の赤血球の体積分率を指すために使用される用語です。0.4%ヘマトクリットは、0.4%赤血球を含む懸濁液である。
6. 細胞懸濁液を37°Cで7日間インキュベートする。

2. イオノマイシンによる赤血球の治療とヘモリシスの測定

1. ジメチルスルホキシド(DMSO)の630μLに1mgのイオノマイシンカルシウム塩を溶解し、2mMの最終濃度に達する。アリコートと-20°で保存します。
2. ステップ1.5から0.4%ヘマトクリットの1mLを取り、2 mMイオノマイシンの0.5 μLを加えて、37°Cで2時間インキュベートする1μMの最終濃度に達します。
   1. マイナス対照としてヨオノマイシン治療を行わずにヘマトクリットの1mLを使用する。
3. RTで700 x gでイオノマイシン処理および未処理のヘマトクリットを5分間遠心分離し、上清を取り除き、細胞ペレットをチューブの底に残します。
4. リンジャー溶液の1.5 mLで細胞ペレットを中断し、RTで700 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄することにより、リンジャー溶液で細胞を3倍洗浄します。
5. 血液分析を測定するには、ステップ1.5から未処理の0.4%ヘマトクリットをマイクロ遠心管に1mL加え、経血症の陰性対照として37°Cで2時間インキュベートします(0%)。
6. ステップ1.5から未処理の0.4%ヘマトクリットをマイクロ遠心管に1mL、RTで700 x gで5分間の遠心分離機を加え、上清を取り除き、細胞ペレットに蒸留水を1mL加え、ヘモリシス(100%)の陽性対照として37°Cで2時間インキュベートします。
7. ステップ2.2からマイクロ遠心管にイオノマイシン処理0.4%ヘマトクリットを1mL加えます。
8. 未処理の細胞、処理された細胞、および蒸留水中の細胞を700xgでRTで5分間遠心分離する。
9. 上清の200°Lを取り、96ウェルプレートに追加します。
10. マイクロプレートリーダーを使用して541nmで吸光度を測定します。
11. 方程式 1³²を使用して解熟を計算します。
    
    %ヘモライシス = (A_T - A₀)/(A₁₀₀ - A₀)*100
    
    ここで_{、A 0}はリンガー溶液中の赤血球の吸光度、A100は水中の赤血球の吸光度、ATはイオノマイシンによる治療された赤血球の吸光度である。

3. アネキシン-V結合アッセイ

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の8mLにおける5xアネキシンV結合緩衝液の希釈2mLを、1x結合緩衝液を得た。
2. 1x結合緩衝液の1mLでステップ2.4からイオノマイシン処理および未処理の細胞ペレットを再中断する。
3. 結合バッファー内の細胞懸濁液の235 μLを取り、アネキシンV-Alexa Flour 488コンジュゲートの15°Lを追加します。
4. 暗い場所で20分間RTで細胞をインキュベートします。RTで5分間700 x gで遠心分離し、上清を取り除く。
5. 細胞2xを1x結合緩衝液で洗浄し、結合緩衝液の1.5mLで細胞ペレットをサスペンドし、RTで700xgで5分間遠心分離し、上清を除去する。
6. フローサイトメトリー測定のために、1x結合バッファーの250°Lで細胞ペレットを再サスペンドします。

4. フローサイトメトリー

1. アネキシンV染色赤血球の200μLを、フローサイトメトリーと互換性のある1mLラウンドボトムポリスチレンチューブに転写する。
2. フローサイトメトリーソフトウェアにログインし、新しい実験ボタンをクリックします。新しいチューブボタンをクリックします。グローバルシートを選択し、励起波長488nm、発光波長530nmの蛍光強度を測定する適用分析を選択します。
3. 蛍光活性化細胞選別(FACS)分析のために収集する細胞数を20,000に設定します。
4. 目的のチューブを選択し、ロードボタンをクリックします。前方散乱と側面散乱の測定のための記録ボタンをクリックします。すべてのサンプルに対してこの手順を繰り返します。
5. 標本ボタンを右クリックし、バッチ分析の適用をクリックして結果ファイルを生成します。
6. 標本ボタンを右クリックし、FSCファイルの生成をクリックします。
7. フローサイトメトリーソフトウェアの職場にフローサイトメトリーデータ(FSCファイル)を追加します。
8. 対象のセル集団を選択し、赤血球症値の統計を追加して、制御データを分析します。
   1. コントロールをダブルクリックし、ヒストグラム対蛍光強度を選択します。
   2. ゲートボタンをクリックして、エリプトーシスのパーセンテージを示すヒストグラムにゲートを描画します。
9. 他のすべての実験管に同じ統計量を適用して、エリプトーシス値を得る。コントロールを右クリックし、[グループ化する分析のコピー] を選択します。
10. すべてのサンプルを適切にゲーティングした後、分析したデータをレイアウト エディタにドラッグ アンド ドロップして転送します。
    1. レイアウト エディターで、分析されたデータをコントロールにオーバーレイします。
    2. オーバーレイされたグラフの x 軸と y 軸を変更して、目的のヒストグラムと強度を設定します。
    3. [エクスポート]ボタンをクリックして画像ファイルをエクスポートし、グラフを目的の場所に保存します。

5. 共焦点顕微鏡

1. アネキシンV染色細胞を顕微鏡スライドに5μL転写し、カバースリップで覆います。光の漂白を防ぐために暗い場所に保管してください。
2. 共焦点蛍光顕微鏡のアルゴンレーザーを使用して、所望の倍率で488nmで励起された細胞を観察します。
   注:共焦点顕微鏡は必ずしも必要ではなく、蛍光機能を備えた顕微鏡を使用して、アネキシンV結合を実証する蛍光画像を得ることができます。
3. 対照(非処理細胞)および処理された細胞の蛍光画像を得る。
   注:非処理細胞は非常に弱い蛍光シグナルを示すことが期待され、処理された細胞は膜上で明るい緑色蛍光を示すことが期待されます。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

イオノマイシン濃度の最適化

イオノマイシンは赤血球を誘発するために必要であるが、イオノマイシン濃度の増加は、出血(すなわち赤血球の溶解およびヘモグロビンの放出)を避ける必要がある。2時間のリンガー溶液中の1μMイオノマイシンによる赤血球の治療は、アネキシンVアレクサ小麦粉488共役とFACS分析...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

この手順の目的は、エリプトーシスの誘導を成功させるために重要な要因であるイオノフォア濃度、治療時間、および細胞外グルコース濃度に最適な値を提供することです。プロトコルの重要なステップは、細胞外グルコースの枯渇であり、その重要性にもかかわらず、文献では十分に強調されていない。通常のリンガー溶液中の糖度(5mM)は、赤血球症に対する阻害効果を有する。細胞外環?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use