אינדוקציה של אירוטוזה בתאי דם אדומים באמצעות היואופלפור סידן

Summary

פרוטוקול עבור אינדוקציה של אריטוזה, מוות תאים מתוכנת ב אריתרופוציטים, באמצעות סידן היואופלפור, איקונמיצין, מסופק. הערכה מוצלחת מוערכת על-ידי ניטור פוספוליזה של הלוקליזציה בעלון החיצוני של הממברנה. הגורמים המשפיעים על הצלחת הפרוטוקול נבדקו ותנאים אופטימליים שסופקו.

Abstract

האריציטוזה, מוות מתוכנת באמצעות אריתרופוציטים, מתרחש במספר מחלות המטאולוגיות ובמהלך הפגיעה באריתרופותאי. הסימן ההיכר של התאים eryptotic הוא אובדן של הקובית סימטריה של קרום התא, המוביל הטרנסלוקציה של פוספארידילסרין אל העלון החיצוני קרום. תהליך זה מופעל על ידי ריכוז תאיים מוגבר של Ca^{2 +}, אשר מפעיל את הסמבלאז, אנזים המקל על התנועה הדו של פוספוליפידים בין עלונים ממברנה. בהתחשב בחשיבות הארגטוזה בתנאים נגועים שונים, היו מאמצים לגרום לארגטוזה בתוך מבחנה. מאמצים כאלה בדרך כלל להסתמך על הסידן היואופלפור, איקונמיצין, כדי לשפר את Ca תאיים^{2 +} ריכוז ולגרום אריפיסיס. עם זאת, אי-התאמות רבים דווחו בספרות לגבי ההליך לגרימת שימוש באיקונמיצין. להלן, אנו מדווחים על פרוטוקול צעד אחר צעד לאיקונמיצין-המושרה באמצעות אריתרופוציטים אנושיים. אנו מתמקדים בצעדים חשובים בהליך, כולל ריכוז ביופור, זמן דגירה, ומחסור בגלוקוז, ולספק תוצאה מייצגת. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לאפשר באופן מידי לגרום הארגיוסיס במעבדה.

Introduction

מוות תאים מתוכנת ב אריתרופוציטים, הידוע גם בשם eryptosis, הוא נפוץ בתנאים קליניים רבים הפרעות המטולוגית. Eryptosis קשורה להתכווצות התאים ואובדן פוספוליפיד-סימטריה בקרום פלזמה התא^1,2. אובדן של א. א. א. תוצאות ב רוברטסוניים של זרחן (PS), שומנים בדרך כלל מקומי בעלון הפנימי^3,4, אל העלון החיצוני התא, אשר אותות מקרופאגים כדי phagocytose ולהסיר אריתרופוציטים פגום^5,6,7,8. בסוף תוחלת החיים הנורמלית של אריתרופוציטים, הסרת התאים eryptotic על ידי מקרופאגים מבטיח את האיזון של אריתרופוציטים במחזור הדם. עם זאת, בתנאים חולים, כגון מחלת תאים מגל ו תלסמיה^9,10,11, eryptosis משופרת עלולה לגרום לאנמיה חמורה². בשל חשיבותו במחלות המטולוגית, יש עניין משמעותי בבדיקת הגורמים העלולים להיות מעכבים או לעכב את המנגנונים המולקולריים ואת המנגנון המולקולרי שבבסיס תהליך זה.

קרום הפלזמה של אריתרופוציטים בריאים הוא אסימטרי, עם שונים פוספוליפידים לוקליזציה על העלונים החיצוניים והפנימיים. א-סימטריה ממברנה מוסדר בעיקר על ידי פעולה של אנזימים ממברנה. Aminophospholipid טרנסלוקייס מקלה על ההובלה של aminophospholipids, PS ו פוספולידילטהולאמין (PE), על ידי הנחיית שומנים אלה אל העלון הפנימי של התא. מצד שני, floppase מסיע את כולין המכיל פוספוליפידים, זרחן (PC) ו ספינגומיילין (SM), מן הפנימי אל העלעל החיצוני של קרום התא¹². עם זאת, בניגוד לתאים בריאים, קרום של האריתרופוציטים eryptotic מעורבל. הדבר נובע מהפעולה של אנזים שלישי, השבלקלז, אשר משבש פוספוליפיד על אי-סימטריה על ידי הקלה על ההובלה הדו-כיוונית של aminophospholipids^13,14,15,16. הסמבלאז מופעל על ידי רמות תאיים גבוהות של Ca^{2 +}. לכן, סידן ionophores, אשר להקל על ההובלה של Ca^{2 +} על פני קרום התא¹², הם השראות יעיל של אריפיסיס.

איקונמיצין, סידן מיואופלפור, נעשה שימוש נרחב כדי לגרום לאריטוסיס ב אריתרופוציטים^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. איקונמיצין יש גם קבוצות ידרופילי ו הידרופובי, אשר נחוצים כדי לאגד וללכוד Ca^{2 +} יון, ולהעביר אותו לחלל ציטוסולג^27,28,29. הדבר מוביל להפעלת הסמבלאז והטרנסלוקציה של PS לעלעל החיצוני, שניתן לאתרם בקלות באמצעות השימוש ב-אנסי-V, חלבון תאי בעל זיקה גבוהה ל-PS¹². למרות שמפעיל את האירוטוזה על ידי איקונמיצין מדווחים בדרך כלל, יש אי-התאמה ניכרת בשיטה בספרות (שולחן 1). האוכלוסייה של אריתרופוציטים שעברו אריטוציטוזה תלוי בגורמים שונים כגון ריכוז ביוופפור, זמן טיפול עם היופופור, ואת תכולת הסוכר של הסביבה המרחפת (גלוקוז המחסור מפעיל ערוצי הקטיון ומקל את הכניסה של Ca^{2 +} לתוך שטח cytosolic)^30,31. עם זאת, יש מעט עקביות בגורמים אלה בספרות, מה שמקשה על ביצוע של האריטוסיס בלתי מתורבת.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים הליך צעד אחר צעד כדי לזרז את התהליך של אריתרופוציטים אנושיים. הגורמים המשפיעים על האריטוסיס המצליח כולל Ca^{2 +} ריכוז, ריכוז ביופור, זמן טיפול, וטרום דגירה במאגר מרוקן גלוקוז נבדקים ערכים אופטימליים מדווחים. הליך זה מדגים כי טרום דגירה של אריתרופוציטים במאגר נטול גלוקוז מגדיל באופן משמעותי את אחוז האריטוזה לעומת מאגר המכיל גלוקוז. פרוטוקול זה יכול לשמש במעבדה כדי לייצר האריציטים eryptotic עבור יישומים שונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל דגימות הדם האנושיות המשמשות בפרוטוקול המתואר להלן נרכשו כדגימות דה מזוהה. שום אדם לא היה מעורב במישרין. או גויס למחקר הזה יש להשתמש בהנחיות של הצהרת הלסינקי כאשר המחקר כולל נושאים אנושיים.

1. בידוד אריתרופוציט מדם שלם

1. הוסף 500 μL של דם שלם ב חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) (מאוחסן ב -4 ° c) לצינור מיקרוצנטריפוגה.
   הערה: דם שלם נרכש ב-ACD. לדברי החברה, 1.5 mL של ACD מתווסף 7 מ ל של דם שלם (8.5 mL כולל נפח).
2. צנטריפוגה את הדם כולו על 700 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהסיר את הפלזמה ברורה ואת המעיל באפי דק באמצעות הפיפטה לעזוב את שכבת אריתרופואריציט אדום.
3. הכינו 1 L של פתרון הצלצול המכיל 125 מ"מ מילימטר, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgSO₄, 32 מ"מ hepes, 5 מ"מ גלוקוז, ו 1 מ"מ cacl₂. להתאים את ה-pH ל 7.4 על ידי הוספת 2 μL טיפות של 1.0 M NaOH. כדי להכין פתרון לצלצול ללא גלוקוז, בצע את אותו הפרוטוקול, אך אל תכלול גלוקוז בפתרון.
4. לשטוף את האריתרופוציטים 2x בפתרון הצלצול על ידי השעיית הגלולה תא ב 1.5 mL של הפתרון הצלצול, תפרידו ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT, והסרת supernatant.
5. הפוך 0.4% המטוקריט על-ידי השעיית 40 μL של כמות האריתרופואריציט ב-9,960 μL של פתרון הצלצול ללא גלוקוז כדי להגיע לנפח הסופי של 10 mL.
   הערה: המטוקריט הוא מונח המשמש להתייחסות לחלק האמצעי של אריתרופוציטים בהשעיה. 0.4% המטוקריט הוא השעיה המכילה 0.4% אריתרופוציטים.
6. מכשיר הבולם הסלולרי ב-37 ° c במשך 7 ימים.

2. טיפול באריתרופוציטים עם איקונמיצין ומדידה של המוליזה

1. התמוססות 1 מ ג של איקונמיצין מלח סידן ב 630 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להגיע לריכוז הסופי של 2 מ"מ. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.
2. לקחת 1 מ ל של 0.4% המטקריט משלב 1.5 ולהוסיף 0.5 μL של 2 מ"מ ionomycin כדי להגיע לריכוז הסופי של 1 μM. הדגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
   1. השתמש ב-1 מ ל של המטוקריט ללא טיפול איקונמיצין כשליטה שלילית.
3. צנטריפוגה את ionomycin-מטופלים המטוקריטים ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT, ולהסיר supernatants שלהם לעזוב את כדורי התא בתחתית הצינורות.
4. לשטוף את התאים 3x עם הפתרון הצלצול על ידי השעיית כדורי התא ב 1.5 mL של הפתרון הצלצול, תפרידו ב 700 x g עבור 5 דקות ב RT ו להשליך את supernatants.
5. כדי למדוד המוליזיס, להוסיף 1 מ ל של 0.4% המטקריט מטופל משלב 1.5 לצינור מיקרוצנטריפוגה ו דגירה עבור 2 h ב 37 ° צ' כפקד שלילי עבור המוליזה (0%).
6. הוסף 1 מ ל של 0.4% המטקריט מטופל משלב 1.5 לצינור מיקרוצנטריפוגה ו צנטריפוגה ב 700 x g עבור 5 דקות ב RT. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ ל של מים מזוקקים לתוך הגלולה תא ו דגירה עבור 2 h ב 37 ° צ' כפקד חיובי עבור המוליזיס (100%).
7. הוסף 1 מ ל של האיקונמיצין שטופלו 0.4% המטוקריט משלב 2.2 לצינור מיקרוצנטריפוגה.
8. צנטריפוגה את התאים מטופל, תאים מטופלים, ואת התאים במים מזוקקים ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT.
9. קח 200 μL של סופרנטנים ולהוסיף לצלחת 96-באר.
10. למדוד את ספיגת ב 541 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלייט.
11. חישוב המוליזיס באמצעות משוואה 1³²:
    
    % המוליזיס = (_א- ת₀)/(a₁₀₀ -a₀) * 100
    
    כאשר₀ הוא ספיגת האריתרופוציטים בפתרון הצלצול,₁₀₀ הוא ספיגת האריתרופוציטים במים, ו-_T הוא ספיגת האריתרופוציטים המטופלת על ידי איקונמיצין.

3. שיטת הכריכה של אנשין-וי

1. לדלל 2 מ ל של מאגר כריכה V 5x לספח של 5-mL ב 8 מ ל של פוספט מאגר פוספטים (PBS) כדי להשיג במאגר כריכה של 1x.
2. השהה מחדש את כדורי התאים שטופלו על-ידי האיקונצין משלב 2.4 ב-1 mL של מאגר איגוד של 1x.
3. קח 235 μL של השעיות התא במאגר הכריכה והוסף 15 μL של הקמח של אנשין V-אלקסה 488 המשלים.
4. מודקון את התאים ב-RT עבור 20 דקות במקום חשוך. צנטריפוגה ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT ולהסיר את supernatant.
5. לשטוף את התאים 2x עם מאגר כריכת כריכה 1x, על ידי השעיית הגלולה תא ב 1.5 mL של מאגר הכריכה, תפרידו ב 700 x g עבור 5 דקות ב-RT והסרה של supernatant.
6. השהה מחדש את כדורי התא ב-250 μL של מאגר כריכה של 1x לצורך זרימה של המדידות cy, מדידות.

4. להזרים את הציטוזה

1. העבר 200 μL של היחידה לניקוי מוכתם ב-1 mL בפוליסטירן מוקצף עם שפופרות מתאימות עם cy, הזרימה.
2. התחבר אל התוכנה cy, ללחוץ על כפתור הניסוי החדש . לחץ על כפתור הצינורית החדשה . בחר את הגיליון הגלובלי ולבחור את הניתוח להחיל כדי למדוד את עוצמת הקרינה עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ו-אורך הגל של 530 ננומטר.
3. הגדר את מספר התאים ל-20,000 שייאספו עבור ניתוח מיון תאים המופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS).
4. בחר את הצינור הרצוי ולחץ על כפתור עומס . לחץ על לחצן הקלטה עבור מדידות העברה פיזור ופיזור בצד. חזור על כל הדגימות.
5. קליק ימני על לחצן הדגימה ולחץ על החל ניתוח אצווה כדי ליצור את קובץ התוצאה.
6. קליק ימני על לחצן דגימה ולחץ על ליצור קבצי fsc.
7. הוסף את הזרם cy, לנסות את הנתונים (קבצי FSC) למקום העבודה של התוכנה cy, לנסות לזרום.
8. נתח את נתוני הפקד על-ידי בחירת אוכלוסיית התא המעניינים והוספת נתונים סטטיסטיים עבור ערך eryptosis.
   1. לחץ פעמיים על השליטה ובחר היסטוגרמה לעומת עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית.
   2. לחץ על כפתור השער כדי לצייר שער על ההיסטוגרמה אשר מציין את אחוז האריטוסיס.
9. החל את אותה סטטיסטיקה עבור כל הצינורות הניסיוניים האחרים כדי להשיג את ערכי האריטוזה. לחץ לחיצה ימנית על הפקד ובחר העתק ניתוח לקבוצה.
10. לאחר מעבר כראוי את כל הדגימות, להעביר את הנתונים שנותחו על ידי גרירה ושחרורו לתוך עורך הפריסה.
    1. שכבת-על של הנתונים שנותחו באמצעות הפקד בעורך הפריסה.
    2. קבעו את הכיוון הרצוי של היסטגרמות והעוצמות על-ידי שינוי ציר x ו-y של הגרפים הערוכים בשכבות.
    3. ייצוא קבצי תמונה על ידי לחיצה על כפתור ייצוא ולשמור את הגרפים במיקום הרצוי.

5. מיקרוסקופיה קונפוקלית

1. העברה 5 μL של אנשין-וי מוכתם תאים על שקופית מיקרוסקופ ולכסות אותו עם שובר כיסוי. שמור במקום אפל כדי למנוע הלבנה.
2. השתמש לייזר ארגון של מיקרוסקופ הקונגניסטנטית לבחון את התאים הנרגשים ב 488 ננומטר עם המאגציות הרצויות.
   הערה: מיקרוסקופ קונפוקלית וקד אינו נחוץ בהכרח, כל מיקרוסקופ עם יכולות קרינה ניתן להשתמש כדי לקבל תמונות פלואורסצנטית הממחישים את הכריכה של אנשין-וי.
3. להשיג תמונות של הזריחה של הפקד (תאים שאינם מטופלים) ותאים מטופלים.
   הערה: תאים שאינם מטופלים צפויים להראות אותות זריחה חלשה מאוד, ואילו תאים מטופלים צפויים להראות זריחה ירוקה בהירה על הקרומים שלהם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אופטימיזציה של הריכוז האיקונמיצין

בעוד איקונמיצין נדרש כדי לזרז את האריטוסיס, ריכוזי ionomycin מוגברת יכולים להוביל למוליזיס (כלומר, הליזה של אריתרופוציטים ושחרור של המוגלובין), אשר צריך להימנע. הטיפול של אריתרופוציטים עם 1 μM ionomycin ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המטרה של הליך זה היא לספק ערכים אופטימליים עבור ריכוז ביופור, זמן הטיפול, וריכוז גלוקוז החילוץ, שהם גורמים חשובים בהבטחת אינדוקציה מוצלחת של האריטוסיס. צעד קריטי בפרוטוקול הוא דלדול הגלוקוז של החילוץ, אשר, למרות חשיבותו, לא הודגש מספיק בספרות. תכולת הסוכר בפתרון הצלצול הרגיל (5 מ"מ) היא בעלת ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use