Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio

Riepilogo

Viene fornito un protocollo per l'induzione dell'eriptosi, la morte cellulare programmata negli eritrociti, utilizzando l'ionoforo di calcio, la ionomycina. L'eryptosi di successo viene valutata monitorando la fosfatidilaserina di localizzazione nel foglietto illustrativo esterno della membrana. Sono stati esaminati i fattori che influiscono sul successo del protocollo e sono state fornite condizioni ottimali.

Abstract

L'eriptosi, l'eritrocito morto cellulare programmato, si verifica in una serie di malattie ematologiche e durante la lesione agli eritrociti. Un segno distintivo delle cellule eriptotiche è la perdita di asimmetria compositiva della membrana cellulare, che porta alla traslocazione della fosfatidilanella nel volantino esterno della membrana. Questo processo è innescato da una maggiore concentrazione intracellulare di Ca^{2 ,}che attiva la scramblase, un enzima che facilita il movimento bidirezionale dei fosfolipidi tra volantini a membrana. Data l'importanza dell'eriptosi in varie condizioni malate, ci sono stati sforzi per indurre l'eriptosi in vitro. Tali sforzi si sono generalmente affidati all'ionoforo di calcio, la ionomycina, per migliorare la concentrazione intracellulare di Ca² e indurre l'eriptosi. Tuttavia, molte discrepanze sono state segnalate nella letteratura per quanto riguarda la procedura per indurre l'eryptosi utilizzando ionomycina. Qui, riportiamo un protocollo passo-passo per l'eriptosi indotta da ionomicina negli eritrociti umani. Ci concentriamo su importanti passi nella procedura, tra cui la concentrazione di ionoforo, il tempo di incubazione e l'esaurimento del glucosio e forniamo risultati rappresentativi. Questo protocollo può essere utilizzato per indurre riproducibilmente l'eryptosi in laboratorio.

Introduzione

La morte cellulare programmata negli eritrociti, nota anche come eriptosi, è comune in molte condizioni cliniche e disturbi ematologici. L'eryptosi è associata al restringimento cellulare e alla perdita di asimmetria fosfolipidide nella membrana plasmatica cellulare^1,2. La perdita di asimmetria provoca la traslocazione della fosfatidiladila (PS), un lipido normalmente localizzato nell'opuscolo interno^3,4, nel volantino esterno della cellula, che segnala ai macrofagi di fagocitosi e rimuove gli eritrociti difettosi^5,6,7,8. Alla fine della normale durata della vita degli eritrociti, la rimozione delle cellule eriftotiche dai macrofagi garantisce l'equilibrio degli eritrociti in circolazione. Tuttavia, in condizioni di malattia, come la malattia delle cellule falciformi e talassemia^9,10,11, una maggiore eryptosi può provocare anemia grave². A causa della sua importanza nelle malattie ematologiche, c'è un interesse significativo nell'esaminare i fattori che inducono o inibiscono l'eryptosi e i meccanismi molecolari alla base di questo processo.

La membrana plasmatica di eritrociti sani è asimmetrica, con diversi fosfolipidi che si localizzano nei volantini esterni e interni. L'asimmetria della membrana è regolata principalmente dall'azione degli enzimi della membrana. La translocasi aminofosofilidi consente il trasporto di aminoofosbantidi, PS e fosfatidylethanolamina (PE), indirizzando questi lipidi al foglietto interno della cellula. D'altra parte, il floppase trasporta la colina contenente fosfolipidi, fosfatidilcolina (PC) e sphingomyelin (SM), dal volantino interno a quello esterno della membrana cellulare¹². Tuttavia, a differenza delle cellule sane, la membrana degli eritrociti erittoticiti è strapazzata. Ciò è dovuto all'azione di un terzo enzima, la scramblase, che interrompe l'asimmetria fosfolipidi facilitando il trasporto bidirezionale degli aminoofolipidi^13,14,15,16. La Scramblase viene attivata da livelli intracellulari elevati di Ca^2. Pertanto, gli ionofori di calcio, che facilitano il trasporto di Ca^{2 o} attraverso la membrana cellulare¹², sono efficienti induttori di eriptosi.

Ionomycin, un ionoforo di calcio, è stato ampiamente utilizzato per indurre eryptosi in eritrocites^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. L'ionomicina ha sia gruppi idrofili che idrofobici, che sono necessari per legare e catturare gli ioni Ca² e trasportarlo nello spazio citosolico^27,28,29. Questo porta all'attivazione della scramblase e alla traslocazione di PS al volantino esterno, che può essere facilmente rilevato utilizzando l'allegato-V, una proteina cellulare ad alta affinità con PS¹². Sebbene sia comunemente riportata l'eriptosi mediante ionomycina, vi è una notevole discrepanza di metodi nella letteratura (Tabella 1). La popolazione di eritrociti sottoposti a eriptosi dipende da diversi fattori come la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento con l'ionoforo e il contenuto di zucchero dell'ambiente extracellulare (l'esaurimento del glucosio attiva i canali di cation e facilita l'ingresso di Ca^2, nello spazio citoco)^30,31. Tuttavia, c'è poca coerenza in questi fattori nella letteratura, rendendo difficile eseguire l'eryptosi riproducibilmente in vitro.

In questo protocollo, presentiamo una procedura passo-passo per indurre l'eriptosi negli eritrociti umani. Vengono esaminati i fattori che influiscono sul successo dell'eryptosi, tra cui la concentrazione di Ca^{2o, la} concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento e la pre-incubazione nel buffer impoverito di glucosio e vengono riportati valori ottimali. Questa procedura dimostra che la pre-incubazione degli eritrociti in un buffer privo di glucosio aumenta significativamente la percentuale di eryptosi rispetto al buffer contenente glucosio. Questo protocollo può essere utilizzato in laboratorio per produrre eritrociti eritotici per varie applicazioni.

Protocollo

Tutti i campioni di sangue umano utilizzati nel protocollo descritto di seguito sono stati acquistati come campioni de-identificati. Nessun soggetto umano è stato direttamente coinvolto o reclutato per questo studio. Le linee guida della Dichiarazione di Helsinki dovrebbero essere utilizzate quando la ricerca coinvolge soggetti umani.

1. Isolamento degli eritrociti dal sangue intero

1. Aggiungere 500 l di sangue intero nel citrato acido dextrose (ACD) (conservato a 4 gradi centigradi) in un tubo di microcentrifuga.
   NOTA: Il sangue intero è stato acquistato in ACD. Secondo la società, 1,5 mL di ACD viene aggiunto a 7 mL di sangue intero (8,5 mL di volume totale).
2. Centrifugare l'intero sangue a 700 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il plasma chiaro e il sottile cappotto di buffy utilizzando una pipetta per lasciare lo strato di eritrociti rosso.
3. Preparare 1 L di Ringer soluzione contenente 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 32 mM HEPES, 5 mM di glucosio, e 1 mM CaCl₂. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo 2 gocce di 1,0 M NaOH. Per preparare la soluzione Ringer senza glucosio, seguire lo stesso protocollo, ma non includere il glucosio nella soluzione.
4. Lavare gli eritrociti 2x nella soluzione Ringer sospendendo il pellet cellulare in 1,5 mL di soluzione Ringer, centrifugeno a 700 x g per 5 min a RT e rimuovendo il supernatante.
5. Fare un ematocrito dello 0,4% risuspendendo 40 ll l del pellet eritrocito in 9.960 l di soluzione Ringer senza glucosio per raggiungere un volume finale di 10 mL.
   NOTA: L'ematocrite è un termine usato per riferirsi alla frazione di volume degli eritrociti in sospensione. Un ematocrite dello 0,4% è una sospensione contenente lo 0,4% di eritrociti.
6. Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi centigradi per 7 giorni.

2. Trattamento degli eritrociti con ionomycina e misurazione dell'emolisi

1. Sciogliere 1 mg di sale di calcio ionomycina in 630 l di zolfo dimetilo (DMSO) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
2. Prendere 1 mL dell'ematoctolo dello 0,4% dal punto 1,5 e aggiungere 0,5 luna di 2 mM ionomycin per raggiungere una concentrazione finale di 1 M. Incubazione per 2 h a 37 .
   1. Utilizzare 1 mL dell'ematocrito senza trattamento con ionomycina come controllo negativo.
3. Centrifugare gli ematocriti trattati con ionomycina e non trattati a 700 x g per 5 min a RT, e rimuovere i loro supernatanti per lasciare i pellet cellulari nella parte inferiore dei tubi.
4. Lavare le cellule 3x con la soluzione Ringer sospendendo i pellet cellulari in 1,5 mL di soluzione Ringer, centrifugeno a 700 x g per 5 min a RT e scartando i supernatanti.
5. Per misurare l'emolisi, aggiungere 1 mL dell'ematocrito dello 0,4% non trattato dal punto 1,5 a un tubo di microcentrifuga e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi come controllo negativo per l'emolisi (0%).
6. Aggiungere 1 mL dell'ematocrito dello 0,4% non trattato dal punto 1,5 a un tubo di microcentrifuga e centrifugare a 700 x g per 5 min a RT. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di acqua distillata al pellet cellulare e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi come controllo positivo per l'emolisi (100%).
7. Aggiungere 1 mL dell'ematocra trattato con ionomicina 0,4% dal punto 2.2 a un tubo di microcentrifuga.
8. Centrifugare le cellule non trattate, le cellule trattate e le cellule in acqua distillata a 700 x g per 5 min a RT.
9. Prendere 200 l dei supernatanti e aggiungere a una piastra di 96 pozze.
10. Misurare l'assorbimento a 541 nm utilizzando un lettore di microplacche.
11. Calcolare l'emolisi utilizzando l'equazione 1³²:
    
    %Emolisi (A_T - A₀)/(A₁₀₀ - A₀)
    
    dove A₀ è l'assorbimento degli eritrociti nella soluzione Ringer, A₁₀₀ è l'assorbimento degli eritrociti nell'acqua, e A_T è l'assorbimento degli eritrociti trattati dalla ionomicina.

3. Saggio vincolante allegato-V

1. Diluire 2 mL del buffer di associazione V allegato 5x in 8 mL di salina con buffer fosfato (PBS) per ottenere un buffer di rilegatura 1x.
2. Risospendere i pellet cellulari trattati con ionomycina e non trattati dal passaggio 2.4 in 1 mL del buffer di rilegatura 1x.
3. Prendere 235 l delle sospensioni cellulari nel cuscinetto di rilegatura e aggiungere 15 L di annessina V-Alexa Flour 488 coniugato.
4. Incubare le cellule a RT per 20 min in un luogo buio. Centrifuga a 700 x g per 5 min a RT e rimuovere il supernatante.
5. Lavare le celle 2x con buffer di rilegatura 1x, sospendendo il pellet cellulare in 1,5 mL del buffer di legame, centrifugeno a 700 x g per 5 min a RT e rimuovendo il supernatante.
6. Risospendere i pellet cellulari in un buffer di rilegatura di 1x pari a 250 gradi per le misurazioni della citometria di flusso.

4. Citometria di flusso

1. Trasferire 200 l degli eritrociti macchiati di annessa-V a 1 mL di tubi in polistirolo inferiore rotondi compatibili con la citometria di flusso.
2. Accedi al software di citometria del flusso e fai clic sul pulsante del nuovo esperimento. Fare clic sul nuovo pulsante del tubo. Selezionare il foglio globale e scegliere l'analisi di applicazione per misurare l'intensità di fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.
3. Impostare il numero di celle su 20.000 da raccogliere per l'analisi FACS (Fluorescenza-attivata dall'ordinamento delle cellule).
4. Selezionare il tubo desiderato e fare clic sul pulsante di carico. Fare clic sul pulsante registra per le misurazioni a dispersione in avanti e laterale. Ripetere l'operazione per tutti i campioni.
5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante del campione e fare clic su Applica analisi batch per generare il file dei risultati.
6. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante campione e fare clic su Genera file FSC.
7. Aggiungere i dati di citometria di flusso (file FSC) nell'area di lavoro del software di citometria di flusso.
8. Analizzare i dati di controllo selezionando la popolazione cellulare di interesse e aggiungendo statistiche per il valore dell'eryptosis.
   1. Fare doppio clic sul controllo e selezionare l'istogramma rispetto all'intensità della fluorescenza.
   2. Fare clic sul pulsante del cancello per disegnare un cancello sull'istogramma che indica la percentuale di eryptosi.
9. Applicare le stesse statistiche per tutti gli altri tubi sperimentali per ottenere i valori di eryptosis. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul controllo e selezionare Copia analisi in gruppo.
10. Dopo aver inserito correttamente tutti i campioni, trasferire i dati analizzati trascinandoli e rilasciandoli nell'editor di layout.
    1. Sovrapporre i dati analizzati con il controllo nell'editor di layout.
    2. Impostare gli istogrammi e le intensità desiderati modificando l'asse x e y dei grafici sovrapposti.
    3. Esportare i file di immagine facendo clic sul pulsante Esporta e salvare i grafici nella posizione desiderata.

5. Microscopia confocale

1. Trasferire 5 - L di cellule macchiate di annessione-V su un vetrino al microscopio e coprirlo con uno slittamento di copertura. Conservare in un luogo buio per evitare il fotosbiancamento.
2. Utilizzare il laser Argon del microscopio a fluorescenza confocale per osservare le cellule eccitate a 488 nm con gli ingrandimenti desiderati.
   NOTA: Un microscopio confocale non è necessariamente necessario e qualsiasi microscopio con capacità di fluorescenza può essere utilizzato per ottenere immagini a fluorescenza che dimostrino un legame annesso-V.
3. Ottenere immagini a fluorescenza del controllo (cellule non trattate) e cellule trattate.
   NOTA: Si prevede che le cellule non trattate mostrino segnali di fluorescenza molto deboli, mentre si prevede che le cellule trattate mostrino fluorescenza verde brillante sulle loro membrane.

Risultati

Ottimizzazione della concentrazione di ionomycina

Mentre l'iononomicina è necessaria per indurre l'eriptosi, l'aumento delle concentrazioni di ionomycina può portare all'emolisi (cioè la lisi degli eritrociti e il rilascio di emoglobina), che deve essere evitata. Il trattamento degli erittrociti con 1 .M ionomycin soluzione per 2 h è sufficiente per indurre l'eryptosi, come dimostra l'etichettatura di succes...

Discussione

L'obiettivo di questa procedura è quello di fornire valori ottimali per la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento e la concentrazione di glucosio extracellulare, che sono fattori importanti per garantire una corretta induzione di eriptosi. Un passo critico nel protocollo è l'esaurimento del glucosio extracellulare, che, nonostante la sua importanza, non è stato sufficientemente sottolineato nella letteratura. Il contenuto di zucchero nella normale soluzione Ringer (5 mM) ha un effetto inibitorio sull'eryp...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use