Indução de eryptose em glóbulos vermelhos usando um ionóforo de cálcio

Resumo

Um protocolo para a indução da eritupse, a morte celular programada em eritrócitos, usando o ionóforo de cálcio, ionomicina, é fornecido. A eittose bem-sucedida é avaliada monitorando a fosfateina da localização no folheto exterior da membrana. Foram examinados fatores que afetam o sucesso do protocolo e condições ideais fornecidas.

Resumo

Eritrose, morte celular programada de eritrócito, ocorre em uma série de doenças hematológicas e durante a lesão aos eritrócitos. Uma marca registrada das células eryptoticas é a perda da assimetria composicional da membrana celular, levando à translocação de fósforoarfrino para o folheto externo da membrana. Este processo é desencadeado pelo aumento da concentração intracelular de Ca²⁺, que ativa a scramblase, uma enzima que facilita o movimento bidirecional de fosfolípidos entre folhetos de membrana. Dada a importância da eryptose em várias condições doentes, tem havido esforços para induzir a erytose in vitro. Tais esforços têm geralmente invocado o ionóforo de cálcio, ionomicina, para melhorar a concentração intracelular Ca^{2 +} e induzir a eryptose. Entretanto, muitas discrepâncias foram relatadas na literatura a respeito do procedimento para induzir a eryptose usando o ionomycin. Aqui, relatamos um protocolo passo a passo para eritptose induzida pela ionomicina em eritrócitos humanos. Nós nos concentramos em etapas importantes no procedimento, incluindo a concentração de ionóforo, tempo de incubação e esgotamento da glicose, e fornecer resultado representativo. Este protocolo pode ser usado para induzir reproduzivelmente a eryptose em laboratório.

Introdução

A morte celular programada em eritrócitos, também conhecida como eritrose, é comum em muitas condições clínicas e distúrbios hematológicos. A eryptose está associada ao encolhimento celular e à perda de assimetria fosfolípida na membrana plasmática celular^1,2. A perda de assimetria resulta na translocação de fosfatidylserine (PS), um lipídio normalmente localizado no folheto interno^3,4, para o folheto exterior celular, que sinaliza para macrófagos para phagocitose e remover eritrócitos defeituosos^5,6,7,8. No final da vida útil normal dos eritrócitos, a remoção de células eritptoticas por macrófagos garante o equilíbrio dos eritrócitos em circulação. No entanto, em condições doentes, como doença falciforme e talassemia^9,10,11,eritrese reforçada pode resultar em anemia grave². Devido à sua importância em doenças hematológicas, há um interesse significativo em examinar os fatores que induzem ou inibem a eryptose e os mecanismos moleculares subjacentes a este processo.

A membrana plasmática de eritrócitos saudáveis é assimétrica, com diferentes fosfolípidos localizando-se nos folhetos externos e internos. A assimetria da membrana é regulada principalmente pela ação das enzimas da membrana. O translocase aminofosfosfórico facilita o transporte de aminofosfípidos, PS e fosfatidylethanolamina (PE), direcionando esses lipídios para o folheto interno celular. Por outro lado, o floppase transporta a colina contendo fosfolípidos, fosfatatidylcholine (PC) e esfingomielina (SM), do interior ao folheto externo da membrana celular¹². No entanto, ao contrário das células saudáveis, a membrana dos eritrócitos eritptoticos é embaralhada. Isto é devido à ação de uma terceira enzima, scramblase, que interrompe a assimetria fosfolípido, facilitando o transporte bidirecional de aminofosfosfípidos^13,14,15,16. Scramblase é ativado por níveis intracelulares elevados de Ca²⁺. Portanto, os ionóforos de cálcio, que facilitam o transporte de Ca²⁺ através da membrana celular^12,são indutores eficientes de eitosse.

Ionomicina, um ionóforo de cálcio, tem sido amplamente utilizado para induzir erittose em eritrócitos^{12,17,18,19,20,22,23,24,25,26}. Ionomicina tem grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, que são necessários para ligar e capturar íon Ca^{2 +,} e transportá-lo para o espaço citosólico^27,28,29. Isso leva à ativação de scramblase e translocação de PS para o folheto externo, que pode ser facilmente detectado usando annexin-V, uma proteína celular com uma alta afinidade com PS¹². Embora provocar a eryptose por ionomicina seja relatado geralmente, há uma discrepância considerável do método na literatura(tabela 1). A população de eritrócitos submetidos à eritrose depende de diferentes fatores, como concentração de ionóforo, tempo de tratamento com ionóforo e o teor de açúcar do ambiente extracelular (esgotamento da glicose ativa canais de caation e facilita a entrada de Ca²⁺ no espaço citosólico)^30,31. No entanto, há pouca consistência nesses fatores na literatura, dificultando o desempenho da eritose reproduzivelmente in vitro.

Neste protocolo, apresentamos um procedimento passo a passo para induzir eritrose em eritrócitos humanos. Os fatores que afetam a eryptose bem-sucedida que inclui a concentração de Ca^2+, concentração do ionophore, tempo do tratamento, e pre-incubação no amortecedor glicose-esgotado são examinados e os valores óptimos são relatados. Este procedimento demonstra que a pré-incubação de eritrócitos em um amortecedor livre de glicose aumenta significativamente a porcentagem de eritrose em comparação com tampão contendo glicose. Este protocolo pode ser usado em laboratório para produzir eritrócitos eritptoticos para várias aplicações.

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Protocolo

Todas as amostras de sangue humanas utilizadas no protocolo descrito abaixo foram compradas como amostras desidentificadas. Nenhum sujeito humano foi diretamente envolvido ou recrutado para este estudo. As orientações da Declaração de Helsínquia devem ser utilizadas quando a investigação envolve seres humanos.

1. Isolamento eritrócito de sangue inteiro

1. Adicione 500 μL de sangue inteiro em dextrose citrato ácido (ACD) (armazenado a 4 °C) a um tubo de microcentrífuga.
   NOTA: Sangue inteiro foi comprado em ACD. De acordo com a empresa, 1,5 mL de ACD é adicionado a 7 mL de sangue inteiro (8,5 mL volume total).
2. Centrífuga todo o sangue a 700 x g para 5 min à temperatura ambiente (RT) e remover o plasma claro eo casaco buffy fina usando uma pipeta para deixar a camada de eritrócito vermelho.
3. Prepare 1 L de solução Ringer contendo 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 32 mM HEPES, 5 mM glicose, e 1 mM CaCl₂. Ajuste o pH para 7,4 adicionando 2 μL gotas de 1,0 M NaOH. Para preparar a solução Ringer sem glicose, siga o mesmo protocolo, mas não inclua glicose na solução.
4. Lave os eritrócitos 2x na solução Ringer suspendendo a pelota de celular em 1,5 mL da solução Ringer, centrífuga a 700 x g por 5 min na RT e removendo o supernatant.
5. Faça um hematocrit de 0,4% resuspendendo 40 μL da pelota de eritrócito em 9.960 μL de solução Ringer sem glicose para atingir um volume final de 10 mL.
   NOTA: Hematocrit é um termo usado para se referir à fração de volume de eritrócitos em suspensão. Um hematocrita de 0,4%.
6. Incubar a suspensão celular a 37 °C por 7 dias.

2. Tratamento de eritrócitos com ionomicina e medição de hemolíse

1. Dissolva 1 mg de sal de cálcio de ionomicina em 630 μL de dimetil sulfoxida (DMSO) para alcançar uma concentração final de 2 mM. Aliquot e armazenar a -20 °C.
2. Tome 1 mL do hematocrit de 0,4% do passo 1.5 e adicione 0,5 μL de ionomicina de 2 mm para alcançar uma concentração final de 1 μM. Incubate por 2 h a 37 °C.
   1. Use 1 mL do hematocrito sem tratamento de ionomicina como controle negativo.
3. Centrífuga a ionomicina tratada e hematocrits tratados em 700 x g para 5 min em RT, e remover suas supernatants para deixar as pelotas celulares na parte inferior dos tubos.
4. Lave as células 3x com a solução Ringer suspendendo as pelotas celulares em 1,5 mL da solução Ringer, centrífuga a 700 x g por 5 min na RT e descartando as supernatantes.
5. Para medir a hemolíse, adicione 1 mL do hematocrit não tratado de 0,4% do passo 1.5 a um tubo de microcentrífuga e incubar por 2 h a 37 °C como o controle negativo para a hemolíse (0%).
6. Adicione 1 mL do hematocrit não tratado de 0,4% do passo 1.5 a um tubo de microcentrífuga e centrífuga a 700 x g por 5 min na RT. Remova o supernatant e adicione 1 mL de água destilada e incubada por 2 h a 37 °C como o controle positivo para a hemolíse (100%).
7. Adicione 1 mL do hematocrit o tratado de ionomicina 0,4% do passo 2.2 para um tubo de microcentrífuga.
8. Centrífugaas as células não tratadas, células tratadas e as células em água destilada a 700 x g por 5 min no RT.
9. Pegue 200 μL das supernatantes e adicione a uma placa de 96 poços.
10. Medir a absorção em 541 nm usando um leitor de microplaca.
11. Calcule a hemotimese usando a Equação 1³²:
    
    %Hemolysis = (A_T - A 0)/(A₁₀₀ - A₀)*100
    
    onde A₀ é a absorção de eritrócitos na solução Ringer, A₁₀₀ é a absorção de eritrócitos na água, e A_T é a absorção de eritrócitos tratados por ionomicina.

3. Ensaio obrigatório anexo-V

1. Diluir 2 mL do buffer de ligação 5x annexin V em 8 mL de soline tampão de fosfato (PBS) para obter buffer de ligação 1x.
2. Resuspenda as pelotas celulares tratadas e não tratadas com ionomicina do passo 2.4 em 1 mL de buffer de ligação 1x.
3. Tome 235 μL das suspensões de células no tampão de ligação e adicione 15 μL de Annexin V-Alexa Farinha 488 conjugado.
4. Incubar as células em RT por 20 min em um lugar escuro. Centrífuga a 700 x g por 5 min em RT e remover o supernatant.
5. Lave as células 2x com tampão de ligação 1x, suspendendo a pelota de célula em 1,5 mL do tampão de ligação, centrífuga a 700 x g por 5 minutos em RT e removendo o supernatant.
6. Resuspenda as pelotas celulares em 250 μL de buffer de ligação 1x para medições de citometria de fluxo.

4. Citometria flow

1. Transfira 200 μL dos eritrócitos manchados annexin-V para tubos de poliestireno de fundo redondo de 1 mL compatíveis com citometria de fluxo.
2. Faça login no software de citometria de fluxo e clique no novo botão experimento. Clique no novo botão do tubo. Selecione a folha global e escolha a análise de aplicar para medir a intensidade da fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm.
3. Definir o número de células para 20.000 a serem coletadas para análise de classificação celular ativada por fluorescência (FACS).
4. Selecione o tubo desejado e clique no botão de carga. Clique no botão de registro para a dispersão para a frente e medições de dispersão lateral. Repita para todas as amostras.
5. Clique direito no botão do espécime e clique na análise de lote de aplicar para gerar o arquivo de resultado.
6. Clique direito no botão do espécime e clique em gerar arquivos FSC.
7. Adicione os dados de citometria de fluxo (arquivos FSC) no local de trabalho do software de citometria de fluxo.
8. Analise os dados de controle selecionando a população celular de interesse e adicionando estatísticas para o valor da erytose.
   1. Clique duas vezes no controle e selecione histograma versus intensidade de fluorescência.
   2. Clique no botão do portão para desenhar um portão no histograma que indica a porcentagem de erídose.
9. Aplique as mesmas estatísticas para todos os outros tubos experimentais para obter os valores de erytose. Clique direito no controle e selecione a análise de cópia para o grupo.
10. Depois de devidamente gating todas as amostras, transferir os dados analisados, arrastando-os e deixá-los cair no editor layout.
    1. Sobreponha os dados analisados com controle no editor de layout.
    2. Defina os histogramas e intensidades desejados alterando o eixo x e y dos gráficos sobrepostos.
    3. Exportar arquivos de imagem clicando no botão de exportação e salvar os gráficos no local desejado.

5. Microscopia confocal

1. Transfira 5 μL de células manchadas de anexo-V em um slide de microscópio e cubra-a com um deslizamento de cobertura. Mantenha-se em um lugar escuro para evitar o clareamento fotográfico.
2. Use laser argônio do microscópio de fluorescência confocal para observar as células animadas em 488 nm com ampliações desejadas.
   NOTA: Um microscópio confocal não é necessariamente necessário e qualquer microscópio com capacidades de fluorescência pode ser usado para obter imagens de fluorescência que demonstram ligação annexin-V.
3. Obtenha imagens de fluorescência do controle (células não tratadas) e células tratadas.
   NOTA: As células não tratadas são esperados para mostrar sinais de fluorescência muito fraco, enquanto as células tratadas são esperados para mostrar fluorescência verde brilhante em suas membranas.

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Resultados

Otimização da concentração de ionomicina

Enquanto a ionomicina é necessária para induzir eritrose, o aumento das concentrações de ionomicina pode levar à hemolíse (ou seja, lise de eritrócitos e liberação de hemoglobina), que precisa ser evitada. O tratamento dos eritrócitos com 1 μM ionomicina na solução Ringer para 2 h é suficiente para induzir eritptose, como evidenciado pela rotulagem bem s...

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Discussão

O objetivo deste procedimento é fornecer valores ideais para a concentração de ionóforo, tempo de tratamento e concentração de glicose extracelular, que são fatores importantes para garantir a indução bem-sucedida da eryptose. Um passo crítico no protocolo é o esgotamento da glicose extracelular, que, apesar de sua importância, não tem sido suficientemente enfatizada na literatura. O teor de açúcar na solução ringer normal (5 mM) tem um efeito inibitório sobre a eryptose. O esgotamento da glicose no amb...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use