Induktion der Eryptose in roten Blutkörperchen mit einem Calcium-Ionophor

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Induktion von Eryptose, programmierter Zelltod in Erythrozyten, mit dem Calciumionophor, Ionomycin, wird zur Verfügung gestellt. Erfolgreiche Eryptose wird durch Dieüberwachung der Lokalisation Phosphatidylserin in der Membran äußere Packungsbeilage bewertet. Faktoren, die den Erfolg des Protokolls beeinflussen, wurden untersucht und optimale Bedingungen bereitgestellt.

Zusammenfassung

Eryptose, Erythrozyten programmiertzelltod, tritt bei einer Reihe von hämatologischen Erkrankungen und während der Verletzung von Erythrozyten. Ein Kennzeichen eryptotischer Zellen ist der Verlust der kompositorischen Asymmetrie der Zellmembran, die zur Translokation von Phosphatidylserin in die äußere Membranbroschüre führt. Dieser Prozess wird durch eine erhöhte intrazelluläre Konzentration von Ca²⁺ausgelöst, die Scramblase aktiviert, ein Enzym, das die bidirektionale Bewegung von Phospholipiden zwischen Membranbroschüren erleichtert. Angesichts der Bedeutung der Eryptose unter verschiedenen krankheiten gab es Bemühungen, Eryptose in vitrozu induzieren. Solche Bemühungen haben sich im Allgemeinen auf das Calciumionophor, Ionomycin, zur Verbesserung der intrazellulären Ca^{2+-Konzentration} und induzieren Eryptose verlassen. Jedoch, viele Diskrepanzen wurden in der Literatur über das Verfahren zur Induktion von Eryptose mit Ionomycin berichtet. Hierin berichten wir über ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für Ionomycin-induzierte Eryptose bei menschlichen Erythrozyten. Wir konzentrieren uns auf wichtige Schritte im Verfahren, einschließlich der Ionophorkonzentration, Inkubationszeit und Glukoseermangel, und liefern repräsentative Ergebnisse. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Reproduzierbar Eryptose im Labor zu induzieren.

Einleitung

Programmierter Zelltod bei Erythrozyten, auch bekannt als Eryptose, ist bei vielen klinischen Erkrankungen und hämatologischen Erkrankungen häufig. Eryptose ist mit Zellschrumpfung und dem Verlust der Phospholipid-Asymmetrie in der Zellplasmamembran^1,2verbunden. Der Verlust der Asymmetrie führt zur Translokation von Phosphatidylserin (PS), einem Lipid, das normalerweise in der inneren Packungsbeilage^3,4, zur äußeren Zellbroschüre lokalisiert ist, die Anmacrophagen an Phagozytose sendet und defekte Erythrozyten^5,

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Protokoll

Alle menschlichen Blutproben, die in dem nachstehend beschriebenen Protokoll verwendet wurden, wurden als nicht identifizierte Proben erworben. Für diese Studie wurden keine menschlichen Probanden direkt beteiligt oder rekrutiert. Die Leitlinien der Erklärung von Helsinki sollten verwendet werden, wenn die Forschung menschliche Subjekte betrifft.

1. Erythrozyten-Isolation vom Vollblut

1. Fügen Sie 500 l Vollblut in saurer Citratdextrose (ACD) (bei 4 °C) zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu.
   HINWEIS: Vollblut wurde in ACD gekauft. Nach Angaben des Unternehmens werden 1,5 ml ACD zu 7 ml Vollblut (8,5 ml Gesamtvolumen) hinzugefügt.

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Ergebnisse

Optimierung der Ionomycinkonzentration

Während Ionomycin erforderlich ist, um Eryptose zu induzieren, können erhöhte Ionomycinkonzentrationen zu Hämolyse führen (d. h. Lyse von Erythrozyten und Freisetzung von Hämoglobin), die vermieden werden muss. Die Behandlung von Erythrozyten mit 1 M Ionomycin in Ringer-Lösung für 2 h reicht aus, um Eryptose zu induzieren, wie eine erfolgreiche Etikettierung mit Ann.......

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Diskussion

Ziel dieses Verfahrens ist es, optimale Werte für die Ionophorkonzentration, die Behandlungszeit und die extrazelluläre Glukosekonzentration zu liefern, die wichtige Faktoren für eine erfolgreiche Induktion der Eryptose sind. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Erschöpfung der extrazellulären Glukose, die trotz ihrer Bedeutung in der Literatur nicht ausreichend betont wurde. Der Zuckergehalt in normaler Ringer-Lösung (5 mM) wirkt hemmend auf die Eryptose. Glukosemangel in der extrazellulären Umgebung induz.......

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use