قياس المعلمات االوقائية من إكسوسيتسيس الخلوية في الخلايا micropatterned

Hugo Lachuer; Pallavi Mathur; Kevin Bleakley; Kristine Schauer

doi:10.3791/60801

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

التصوير الحي للزخات الليفية على الخلايا الصغيرة يسمح لك بالكمية المكانية لهذه العملية. التطبيع مورفولوجيا باستخدام micropatterns هو أداة متميزة للكشف عن القواعد العامة حول التوزيع المكاني للعمليات الخلوية.

Abstract

التصوير الحي للpHluorin الموسومة القابلة للذوبان N-ethylmaleimide الحساسة عامل ملحق البروتين REceptor (V-SNARE) بروتين الغشاء المرتبط Vesicle 7 (VAMP7) عن طريق مجموع المجهر الفلورية الداخلية الانعكاس (TIRFM) هو وسيلة مباشرة لاستكشاف إفراز من المقصورة lysosomal. الاستفادة من ثقافة الخلية على الأسطح micropatterned لتطبيع شكل الخلية، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأدوات الإحصائية لإجراء تحليل مكاني للأنماط الإفرازية. باستخدام وظيفة ريبلي K واختبار إحصائي يستند إلى أقرب مسافة الجيران (NND)، أكدنا أن إفراز من lysosomes ليست عملية عشوائية ولكن يظهر التجمع كبيرة. ملاحظة, تحليلنا كشفت أن الأحداث exocytosis هي أيضا مجمعة في المناطق غير الالتصاق, مشيرا إلى أن جزيئات الالتصاق ليست الهياكل الوحيدة التي يمكن أن تحفز بؤر ساخنة إفرازية في غشاء البلازما. ومع ذلك، وجدنا أن التصاق الخلية يعزز التجمع. بالإضافة إلى المناطق اللاصقة وغير اللاصقة المحددة بدقة ، فإن الهندسة الدائرية لهذه الميكوروبات يسمح باستخدام الإحداثيات القطبية ، وتبسيط التحليلات. استخدمنا تقدير كثافة النواة (KDE) ووظيفة التوزيع التراكمية على الإحداثيات القطبية لأحداث الإزدِاد لتحديد المناطق الغنية من الزّب. وفي الخلايا الصغيرة ذات الشكل الحلقي، حدث التجميع عند الحدود بين المناطق اللاصقة وغير اللاصقة. ويوضح تحليلنا كيف يمكن استخدام الأدوات الإحصائية لدراسة التوزيعات المكانية للعمليات البيولوجية المتنوعة.

Introduction

إكسوسيتوزيس هو عملية الخلوية العالمية التي الصمامات في vesicle مع غشاء البلازما وتطلق محتواها. يمكن للفتح إما أن يصهر تماما مع غشاء البلازما (الانصهار الكامل) أو إنشاء المسام الانصهار التي تبقى مفتوحة خلال فترة زمنية محدودة (قبلة وتشغيل)¹. على سبيل المثال، يتم إطلاق البروتينات المركبة حديثاً في الوسط خارج الخلية من الفُيْنَسَة التي تأتي من مجمع غولجي. هذا المسار البيولوجي، anterograde هو بدائي، وخاصة في الكائنات الحية متعددة الخلايا، لافراز الببتيدات إشارة (على سبيل المثال، الهرمونات، الناقلات العصبية) ومكونات مصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال، الكولاجين)، وكذلك إلى نقل البروتينات عبر الغشاء إلى غشاء البلازما. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحدث إفرازات من إندوسومات مختلفة: 1) إعادة تدوير الغدد الوسومات من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الميمبرين؛ 1) إعادة تدوير الغدد الانسهازومات من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الغشاء؛ 1) إعادة تدوير الغدد الانسهازية من أجل إعادة استخدام البروتينات عبر الغشاء؛ (1) إعادة تدوير الغدد الانسهازية من أجل إعادة استخدام البروتين 2) الهيئات متعددة الأطراف (MVBs) لإطلاق الكوسومات؛ و 3) lysosomes للافراج عن الانزيمات البروتية. وقد تبين إفراز الغدد النابعة لتكون مهمة لthgrowth نيوريت، تشكيل pseudopodia، وإصلاح غشاء البلازما، وإشارات ATP تعتمد².

لدراسة الزخراب على مستوى الخلية الواحدة، تم استخدام العديد من التقنيات. التصحيح المشبك يسمح للكشف عن أحداث اكسوسيتوزيس واحد مع دقة زمنية عالية في مجموعة واسعة من الخلايا الحية³. ومع ذلك، لا يوفر هذا الأسلوب معلومات حول ترجمة أحداث القذف، ولا من أي المقصورة يحدث. يسمح المجهر الإلكتروني بالتصور المباشر للأحداث واظهارية مع دقة مكانية عالية، وبالاقتران مع علم المناعة يوفر معلومات حول خصوصية المقصورات والجزيئات المعنية. ومن عيوب هذا النهج نقص المعلومات عن ديناميات العملية، فضلا عن عدم قدرتها على إجراء دراسات عالية الإنتاجية. 24- توفر أساليب التحليل المجهري الخفيف مثل التحليل المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM)، الذي يستغل الحقل المضيء لإلقاء الضوء على الفلوروفور في محيط الغطاء (100 نانومتر)، دقة زمنية ومكانية جيدة لدراسة أحداث القذف. ومع ذلك، هذه الطريقة متوافقة فقط مع الخلايا المتصّقة ولا يمكن تطبيقها إلا على الجزء البطني/السفلي من الخلايا.

لاحظ أن غشاء البلازما يكشف عن عدم تجانس كبير على أساس مجمعات لاصقة موجودة فقط في المناطق المحظورة. هذا التغاير يقيد، على سبيل المثال، امتصاص حروف رابطة مختلفة^4. وبالمثل، فقد أفيد مؤخرا أن إفراز مجمع غولجي يتركز في "النقاط الساخنة" في غشاء البلازما⁵. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف أن بعض البضائع تفرز من خلال التركيز التصاق المرتبطة exocytosis⁶. وهكذا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لمسألة ما إذا كانت الأحداث exocytosis توزع عشوائيا في الفضاء، أو ما إذا كانت تتركز في مناطق محددة من غشاء البلازما. وقد اقترحت العديد من الأدوات الإحصائية على أساس وظيفة سبيلي K لاستكشاف هذه الأسئلة⁷^،⁸^،^9. نهجنا يجمع بين هذه الأدوات مع micropatterning للسيطرة على شكل الخلية وغشاء البلازما غير متجانسة. بالإضافة إلى توفير وسيلة للتمييز بين المناطق اللاصقة وغير اللاصقة ، تسمح هذه التقنية أيضًا بالمقارنة عبر الخلايا والظروف المختلفة وتزيد من قوة التحليلات الإحصائية.

هنا نوظف مجموعة متنوعة من الأدوات الإحصائية لدراسة التوزيع المكاني لأحداث القذف من المقصورة الليسوسومية التي رصدها TIRFM التصوير الخلية الحية من VAMP7-pHluorin في شكل رنين micropattern تطبيع hTert-RPE1 الخلايا. وقد تأكد أن إفراز من lysosomes ليست عملية عشوائية⁸^,⁹ وأن الأحداث exocytosis المعرض التجمع. ملاحظة, وجدنا أن الأحداث exocytosis هي أيضا مجمعة في المناطق غير التصانية, مشيرا إلى أن جزيئات الالتصاق ليست الهياكل الوحيدة التي يمكن أن تحفز النقاط الساخنة الإفرازية في غشاء البلازما. ومع ذلك، فإن التصاق الخلية عزز التجمع. على الدوام، حدد تحليلنا المناطق المخصبة من الزخرفة التي كانت تقع على الحدود بين المناطق اللاصقة وغير الالتصاقية.

Protocol

1- إعداد الخلايا الصغيرة

نقل الخلايا
1. قبل يوم واحد من عملية الانتـرُف، بذور 2.5 × 10⁶ خلايا hTERT-RPE1 في بئر واحد من 12 بئراً (2 × 2 سم) في 1 مل من المتوسط.
2. في يوم transfection، وإعداد خليط transfection مع VAMP7-pHluorin plasmid (100 ميكرولتر من العازلة، 0.8 ميكروغرام من الحمض النووي، 3 ميكرولتر من خليط transfection). احتضان لمدة 10 دقيقة.
  ملاحظة: VAMP7 هو lysosomal v-SNARE، تنصهر مع علامة pHluorin لامعة. يتم إخماد مسبار pHluorin بواسطة انخفاض نسبة الوفيات، ولكن أثناء البروتونات القذفية يتم إطلاقها ويبدأ pHluorin تنبعث منها إشارة¹⁰^،¹¹.
3. إضافة مزيج transfection إلى الخلايا في وسطها.
4. تغيير 4 ساعة المتوسطة بعد إضافة مزيج transfection على الخلايا.
5. استخدم الخلايا لإجراء التجارب خلال 24-48 ساعة التالية.
إعداد micropattern (طريقة التصوير الضوئي)
1. غسل الأغطية (25 مم من القطر) في الإيثانول والسماح لهم الجافة لمدة 5 دقائق.
2. تنشيط الأغطية عن طريق الإضاءة تحت الأشعة فوق البنفسجية العميقة لمدة 5 دقائق.
3. إنشاء غرفة رطبة من خلال الترطيب بدقة منشفة ورقية التي يتم وضع فيلم البارافين. إضافة قطرات (30 ميكرولتر ل22 مم غطاء) من بولي-L-ليسين-الكسب غير المشروع-البولي إيثيلين جلايكول (PLL-g-PEG) (0.1 ملغم / مل، 10 mM HEPES، درجة الHH = 7.4) وأغطية مكان مع السطح المنشط عليها. أغلق الغرفة الرطبة مع غطاء علوي واحتضان لمدة ساعة.
4. غسل يغطي 2X في برنامج تلفزيوني و 1x في الماء المقطر والسماح لهم الجافة.
5. غسل الزهة الضوئية الكوارتز بالماء المقطر ومن ثم مع الإيثانول أو البربانول. جفف قناع ضوئي مع تدفق الهواء المصفى.
  ملاحظة: يتم تغليف قناع الكوارتز الضوئي على جانب واحد مع الكروم المضاد للريف الذي يحتوي على ثقوب في شكل ميكروباتين. ويستخدم في هذا البروتوكول قناع ضوئي يحتوي على مصغرة على شكل حلقة من 37 ميكرومتر. عندما يتم لمعان الأشعة فوق البنفسجية العميقة على قناع ضوئي، يمكن أن يمر الضوء فقط من خلال هذه الثقوب¹².
6. يعرض قناع ضوئي (الجانب المغلف بالكروم) للأشعة فوق البنفسجية العميقة لمدة 5 دقائق لتنظيف السطح.
7. أضف قطرات ماء صغيرة (10 ميكرولتر لأغطية 20 مم) على الجانب المغلف بالكروم من قناع الفوتو. ضع الغطاء مع الجانب PLL-g-PEG المعالج على القطرة وجفف الماء الإضافي. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء بين قناع وأغطية.
  ملاحظة: قوة الشعيرات الدموية للماء سوف تُشل الغطاءات.
8. تعريض قناع ضوئي للأشعة فوق البنفسجية العميقة لمدة 5 دقائق مع الجانب غير المغلفة بالكروم حتى (يتم إرفاق الأغطية على السطح السفلي).
  ملاحظة: يمكن للضوء أن يمر فقط من خلال الثقوب وتعديل سطح PLL-g-PEG-المعالجة من الأغطية تحت قناع ضوئي.
9. إزالة الأغطية من قناع ضوئي عن طريق إضافة المياه الزائدة.
  ملاحظة: يجب أن تعويم الأغطية بسرعة إيقاف.
10. احتضان الأغطية في محلول من بروتينات المصفوفة خارج الخلية (50 ميكروغرام/مل من الليفية، 5 ميكروغرام/مل من الفيبرينوجين الفلوري المخفف في الماء) على فيلم البارافين في غرفة رطبة (كما هو الحال في الخطوة 1.2.3) لـ 1 ح تحت غطاء تدفق لامين لتجنب التلوث.
  ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتًا عند هذه النقطة عن طريق تخزين الأغطية في PBS عند 4 درجة مئوية.
بذر الخلايا على الأسطح الصغيرة
1. استخدم حامل غطاء مغناطيسي يناسب حجم الأغطية الصغيرة لتركيب الأغطية. في يوم الاستحواذ، سخني حامل الغطاء إلى 37 درجة مئوية لتجنب الصدمة الحرارية للخلايا خلال الخطوات اللاحقة.
2. إعداد نمط المتوسطة من خلال المكمل DMEM /F12 المتوسطة مع 20 M هيبس و 2٪ من البنسلين / ستريبتوميسين.
3. مكان يغطي في حامل مع الجانب micropatterned حتى وإضافة نمط المتوسطة بمجرد أن غطاء هو على قاعدة حامل. إضافة الختم وشل مع الجهاز المغناطيسي. املأ حامل الغطاء بمتوسط النقش وأقفله بالغطاء الزجاجي.
  ملاحظة: كن سريعًا، لعدم السماح لأغطية الأغطية بالجفاف. لا تغسل حامل الغطاء بالإيثانول بين التجارب، لأن الختم قد يحتفظ ببعض الإيثانول، الذي يمكن أن يتفاعل مع PLL-g-PEG ويؤدي إلى إجهاد الخلية. اغسل حامل الغطاء بالماء الصابون فقط. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون محتضنة في المفصل في نمط المتوسطة في 37 درجة مئوية ل 1 ساعة لتخفيف المنتج المتبقية.
4. جمع الخلايا المتحولة hTERT-RPE1 عن طريق التربسيني (0.5 مل لواحد 12 لوحة جيدا) وإضافة 1 مل من 10٪ FBS DMEM/F12 المتوسطة.
5. إضافة 0.5 × 10⁶ transtert- RPE1 الخلايا إلى حامل الغطاء وإعادة غلقه. احتضان لمدة 10 دقيقة في الحاضنة.
6. اغسل حامل الغطاء 5x مع نمط متوسط لإزالة الخلايا غير المرتبطة وFBS المتبقية عن طريق إضافة متوسطة النمط مع ماصة واحدة وpirating المتوسطة مع ماصة أخرى لخلق تدفق الغسيل. دائماً الاحتفاظ بحجم صغير من نمط المتوسطة في حامل الغطاء لتجنب تجفيف الخلايا على الأغطية micropatterned، الأمر الذي سيؤدي إلى موت الخلية.
7. احتضان في الحاضنة لمدة 3 ساعة للسماح بتنتشر الخلية الكاملة.

2- الحصول على بيانات الطاردات

تصوير أحداث التناضح
1. وضع حامل الغطاء تحت TIRM. يجب اكتشاف الإشارة بواسطة كاميرا حساسة تم إعدادها باستخدام أفضل تنسيق تصوير متاح.
  ملاحظة: في هذه التجربة، تم استخدام هدف عدسة 100x وكاميرا EMCCD مع منطقة كشف 512 × 512 بكسل مما أدى إلى حجم بكسل من 160 نانومتر.
2. البحث عن خلية تعبر عن VAMP7-pHluorin التي تنتشر بشكل كامل(الشكل 1A).
  ملاحظة: الخلايا التي تعبر عن VAMP7 قابلة للتعرف بوضوح، لأنها تظهر إشارة خضراء.
3. تغيير زاوية الليزر حتى يتم الوصول إلى زاوية TIRF التي تسمح بالتصور من أحداث إكسوسيتوزيت VAMP7-pHluorin. إجراء عملية شراء 5 دقائق في تردد متوافق مع معدل القذف ومقياس الوقت (عادة 3 هرتز، الشكل 1D)باستخدام برنامج المجهر.
  ملاحظة: خلايا hTERT-RPE1 لديها معدل إفرازية lysosomal حوالي 0.3 هرتز على micropatterns. lysosomal exocytosis له مدة نموذجية من 1 s. ويتميز بكثافة الذروة تليها تسوس أسي. وينبغي أن يكون انتشار المسبار واضحا في هذا الوقت (الشكل 1B، C).
4. لكل خلية، وأيضا إجراء عملية اقتناء micropattern باستخدام برنامج المجهر (الشكل 1A).
اكتساب إحداثيات الإزداز
1. افتح الفيلم المكتسب مع ImageJ/ FIJI. استخدام الملف | استيراد | تسلسل الصورة. العثور على أحداث التناضح عن طريق العين. يتميز حدث الزخرفة بظهور إشارة ساطعة تنتشر إلى الخارج (الشكل 1).
2. استخدام أداة نقطة لوضع علامة على مركز الحدث exocytic. استخدام تحليل | قياس لقياس إحداثيات س و ص، وكذلك الإحداثيات الزمنية (رقم الشريحة). تنفيذ هذه القياسات لجميع الأحداث exocytosis من الفيلم.
3. حفظ النتائج (النتائج | ملف | حفظ باسم). إعداد ملف نصي لكل خلية تحليلية تسمى "نتائج(cell_name).txt" الذي يحتوي على شريحة إحداثيات X و Y إحداثيات لكافة أحداث exocytosis في هذا الترتيب.
  
  من المفترض أن يبدو الملف النصي كما يلي:
  ID X Y فيريت قطر نصف قطرها
  RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
  RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
  
  ملاحظة: كن حذراً لاستبدال كافة الفواصل مع نقاط.
4. قياس مركز وقطر كل خلية باستخدام"أداة البيضاوي". تناسب دائرة مثالية (لا تستخدم البيضاوي) واستخدام "قياس" للحصول على إحداثيات س و ص وقطر فيريت. حفظ هوية كل خلية (معرف) و إحداثيات X و Y قطر فيريت و radius (قطر/2) في ملف نصي يسمى "المعلمة الكروية.txt".
  
  من المفترض أن يبدو الملف النصي كما يلي:
  ID X Y فيريت قطر نصف قطرها
  RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
  RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
  
  ملاحظة: كن حذراً لاستبدال كافة الفواصل مع نقاط.
5. قياس سمك حلقة micropattern (طول التصاق) مع أداة مستقيمة وحفظ معرف الخلية، نصف قطر الخلية (من الملف: "المعلمات الكروية.txt")، وطول التصاق في ملف نصي يسمى "نمط parameter.txt". حساب طول التصاق تطبيع بتقسيم طول التصاق على نصف قطر الخلية.
  ملاحظة: كن حذراً لاستبدال كافة الفواصل بالنقاط.
  
  يجب أن تبدو الملف كما يلي:
  طول التصاق نصف قطرها خلية ID طول التصاق تطبيع
  RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
  RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. خلية واحدة التحليل المكاني

R حزمة وتركيب
ملاحظة: حزمة R لهذا التحليل يستفيد من حزمة^{Spatstat 13} لحساب الكثافة ثنائي الأبعاد (2D) ووظيفة K ريبلي. التعليمات البرمجية مفتوحة المصدر وتستخدم ملفات نصية تم وصفها مسبقاً.
1. تحميل وتثبيت R من https://www.r-project.org/ (الإصدار 3.5.2 تم استخدامه في هذا التحليل).
2. تحميل الحزمة (ومجموعة البيانات التجريبية) من: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
3. تثبيت الحزمة على R Studio باستخدام "أدوات" باستخدام "تثبيت الحزم". حدد "ملف أرشيف الحزمة (.zip; .tar.gz)" للفئة "تثبيت من:" واختيار ملف الحزمة. اضغط على "تثبيت".
4. تحميل الحزمة مع وظيفة "مكتبة ("ExocytosisSpatialال" "عن طريق كتابة هذا الأمر في الاستوديو R والضغط على "أدخل".
5. تشغيل الحزمة مع وظيفة "ESA()" عن طريق كتابة هذا الأمر في استوديو R والضغط على "أدخل".
  ملاحظة: سيتم فتح واجهة مستخدم.
6. حدد الدليل لمجموعة البيانات (ملفات.txt) ودليل لـ يرسم الإخراج.
  ملاحظة: يمكن تغيير معلمات التحليل (انظر النص أدناه) من خلال واجهة مستخدم.
7. سيقوم هذا البرنامج النصي تلقائياً بدء تنفيذ التحليل. ويوفر ملفات .pdf من المؤامرات المقابلة وملفات .txt التي تحتوي على نتائج رقمية.

النتائج

تم تحليل الخصائص الزقة من أحداث القذف من lysosomes التي تصورها VAMP7-pHluorin¹⁰^,¹¹ في خلايا hTert-RPE1. خلايا hTert-RPE1 هي خلايا غير مُنقلة تعتمد بشكل جيد على الميكروتيناتينغ وقد استخدمت على نطاق واسع في الدراسات السابقة المستندة إلى ميكروباتترن⁴^،¹⁴

Discussion

رصدنا أحداث الزخراب من المقصورة الليسوسومية من قبل TIRFM تصوير الخلايا الحية من VAMP7-pHluorin في خلايا ميكروباتترن على شكل حلقة وأجرى تحليلا إحصائيا دقيقا للبارامترات المكانية لأحداث الزبيب. توظيف وظيفة K ريبلي تحولت واختبار إحصائي على أساس أقرب مسافة الجار، وأكدنا أن إفراز من lysosomes ليست عملية ع?...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونحن نعترف كثيرا تييري غالي (مركز الطب النفسي وعلم الأعصاب، INSERM) لتوفير VAMP7-pHluorin plasmid. نشكر تارن دوونغ على المشورة بشأن التحليل الإحصائي وأعضاء مختبر GOUD لإجراء مناقشات مثمرة. الكتاب الاعتراف كثيرا الخلية والأنسجة التصوير مرفق (PICT - IBiSA @Burg ، PICT - EM @Burg وPICT - IBiSA @Pasteur) ونيكون مركز التصوير ، معهد كوري (باريس) ، عضو في فرنسا الفرنسية الوطنية للبحوث البنية التحتية - BioImaging (ANR10 - INBS - 04). وقد تلقت هـ.ل. الدعم من رابطة ابحاث السرطان (ARC) وتلقت P.M. التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie No 666003. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04)، وSlabex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038 ) وريديكس باريس للعلوم ولتريس (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)، وكذلك المركز الوطني لريشيرتشي ساينتفيك ومعهد كوري.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.

References

Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. . Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).
Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163 micropattern TIRFM VAMP7

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: