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要約

微小パターン化細胞上のリソソームエキサイトーシスのライブイメージングは、このプロセスの空間的定量化を可能にする。マイクロパターンを用いたモルフォロジーの正規化は、細胞プロセスの空間分布に関する一般的なルールを明らかにする優れたツールです。

要約

pHluorinタグ付き可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質REceptor(v-SNARE)ベシクル関連膜タンパク質7(VAMP7)の生画像化は、全内部反射蛍光顕微鏡(TIRFM)によるリソマルコンパートメントからの分泌を探索する簡単な方法である。微小パターン化された表面での細胞培養を利用して細胞形状を正常化し、分泌パターンの空間解析を行う様々な統計ツールを用いた。RipleyのK関数と近傍距離(NND)に基づく統計的検定を用いて、リソソームからの分泌はランダムなプロセスではなく、有意なクラスタリングを示していることを確認した。なお、我々の分析は、エキソサイトーシス事象が非接着領域にも集まっていることを明らかにし、接着分子が形質膜で分泌ホットスポットを誘導できる唯一の構造ではないことを示した。それでも、細胞接着はクラスタリングを強化することがわかりました。これらのマイクロパターンの円形ジオメトリは、接着領域と非接着領域を正確に定義したほか、極座標を使用して解析を簡素化します。我々は、Exocitosisイベントの極座標に対するカーネル密度推定(KDE)および累積分布関数を用いて、興奮性細胞化の豊かな領域を同定した。リング状のマイクロパターンセルでは、接着領域と非接着領域の境界でクラスタリングが行われた。我々の分析は、統計的ツールを使用して多様な生物学的プロセスの空間分布を調査する方法を示しています。

概要

エキソサイトーシスは、小胞が血漿膜と融合し、その内容を放出する普遍的な細胞プロセスである。小胞は、完全に血漿膜(完全な融合)と融合するか、限られた時間(キスアンドラン)1の間に開いたままの融合細孔を作成することができます。例えば、新たに合成されたタンパク質は、ゴルジ複合体から来る小胞から細胞外媒体に放出される。この生合成、前向きの経路は、原始であり、特に多細胞生物において、シグナル伝達ペプチド(例えば、ホルモン、神経伝達物質)および細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン)を分泌すること、ならびに膜貫通タンパク質を細胞膜に通行させる。さらに、分泌物は異なるエンドーソームから起こり得る:1)膜貫通タンパク質を再利用するために、エンドーソームをリサイクルする。2)エキソソームを放出する多面体(MVB)。3)タンパク質分解酵素の放出のためのリソソーム。内膜分泌は、神経突起の成長、疑似ポディア形成、血漿膜修復、およびATP依存性シグナル伝達2にとって重要であることが示されている。

単細胞レベルでの興奮性の研究のために、いくつかの技術が採用されている。パッチクランプは、多種多様な生細胞3で高い時間分解能を持つ単一の興奮性イベントの検出を可能にする。ただし、このメソッドは、exocytosis イベントのローカライズに関する情報も、どのコンパートメントから発生するのかを提供しません。電子顕微鏡法は、高い空間分解能を持つexocyticイベントを直接可視化することを可能にし、免疫標識と組み合わせて、関係するコンパートメントおよび分子の特異性に関する情報を提供する。このアプローチの欠点は、プロセスのダイナミクスに関する情報の欠如と、ハイスループットの調査を実行できないことです。全内部反射蛍光顕微鏡(TIRFM)のような光顕微鏡法は、エバネッセントフィールドを利用してカバースリップ付近(100nm)の蛍光体を照射し、エキソサイトーシス事象を研究するための良好な時間的および空間的分解能を提供する。しかし、この方法は接着細胞とのみ互換性があり、細胞の腹側/劣った部分にのみ適用できます。

注目に、原形質膜は、制限された領域にのみ存在する接着複合体に基づいて有意な不均一性を明らかにする。この異質性は、例えば、異なるリガンド4の取り込みを制限する。同様に、最近、ゴルジ複合体からの分泌が、形質膜5の「ホットスポット」に集中することが報告されている。さらに、特定の貨物が焦点接着関連のエキソサイトーシス6によって分泌されるということが知られている。したがって、エキソサイトーシスイベントが空間内にランダムに分布しているのか、あるいはそれらが形質膜の特定の領域に集中しているのかという問題に特に注意する必要があります。リプリーのK関数に基づくいくつかの統計ツールは、これらの質問77、8、98,9を探求するために提案されています。当社のアプローチは、これらのツールをマイクロパターニングと組み合わせて、細胞形状および形質膜の不均一性を制御します。接着領域と非接着領域を区別する手段を提供することに加えて、この技術は異なる細胞および条件間の比較を可能にし、統計的分析の力を高める。

ここでは、リング状の微小パターン正規化hTert-RPE1細胞におけるVAMP7-pHluorinのTIRFMライブ細胞イメージングによって監視されるリソソームコンパートメントからのエキソサイトーシスイベントの空間分布を研究するために、さまざまな統計学的ツールを用います。リソソームからの分泌はランダムなプロセス88,9ではなく、9エキソサイトーシスイベントがクラスタリングを示すことを確認した。なお、エキソサイトーシスの事象は非接着領域にも集まっており、接着分子が、形質膜で分泌ホットスポットを誘導できる唯一の構造ではないことを示している。それにもかかわらず、細胞接着はクラスタリングを増強した。一貫して、我々の分析は、接着剤と非接着領域の境界に位置する興奮性の豊かな領域を同定した。

プロトコル

1. 微小パターン化細胞の調製

  1. 細胞のトランスフェクション
    1. トランスフェクションの1日前に、種子2.5 x 106 hTERT-RPE1細胞を12ウェルプレート(2 x 2 cm)の1ウェルに培地1mLで入れる。
    2. トランスフェクションの日に、トランスフェクション混合物をVAMP7-pHluorinプラスミド(100 μLバッファー、0.8 μgのDNA、トランスフェクション混合物3 μL)で調製します。10分間インキュベートします。
      注:VAMP7はリソソームv-SNAREで、ルミナルpHluorinタグと融合しています。pHluorinプローブは低pHによってクエンチされるが、エキソシトーシスの間に陽子が放出され、pHluorinはシグナル10、11,11を放出し始める。
    3. トランスフェクションミックスを培地の細胞に加えます。
    4. トランスフェクションミックスを細胞に加えた後、培地4時間を変更します。
    5. 次の24-48時間の間に実験のために細胞を使用してください。
  2. マイクロパターン調製法(フォトリソグラフィ法)
    1. カバーリップ(直径25mm)をエタノールで洗い、5分間乾燥させます。
    2. 深いUVの下で5分間の照明によってカバースリップをアクティブにします。
    3. パラフィンフィルムを入れたペーパータオルを徹底的に加湿して、湿気の多いチャンバーを作ります。ポリL-リジングラフトポリエチレングリコール(PLL-g-PEG)溶液(0.1 mg/mL、10 mM HEPES、pH = 7.4)の滴(22mmカバースリップ用30μL)を加え、活性表面を持つカバーリップを配置します。上部で湿気の多いチャンバーを閉じ、カバースリップを1時間インキュベートします。
    4. PBSでカバーリップ2倍、蒸留水で1倍を洗浄し、乾燥させます。
    5. 水晶質を蒸留水で洗い、エタノールまたはプロパノールで洗います。フォトマスクをフィルター処理された空気流で乾燥させます。
      注:石英フォトマスクは、マイクロパターンの形の穴を含む反射防止クロムで片側にコーティングされています。このプロトコルでは、リング状のマイクロパターンが37μmのフォトマスクが使用されています。フォトマスク上で深いUVが光を当てたとき、光はこれらの穴12を通過することしかできない。
    6. フォトマスク(クロムコーティングされた側面)を深いUVに5分間露出して表面をきれいにします。
    7. フォトマスクのクロムコーティングされた側に小さな水滴(20mmカバースリップの場合は10 μL)を加えます。PLL-g-PEG処理側をドロップに置き、余分な水を乾燥させます。マスクとカバーリップの間に気泡が形成されないようにします。
      注:水の毛細血管力はカバーリップを固定します。
    8. フォトマスクを、クロムを塗り付けない側を上にして5分間深いUVに露出します(カバーリップは下面に取り付けられています)。
      注: ライトは穴を通過し、フォトマスクの下にあるカバーリップのPLL-g-PEG処理面を修正することしかできません。
    9. 余分な水を加えてフォトマスクからカバーリップを取り除きます。
      注:カバーリップはすぐに浮かぶはずです。
    10. 汚染を避けるために、層流フードの下で1時間(ステップ1.2.3のように)湿気の多いチャンバーのパラフィン膜に、細胞外マトリックスタンパク質(フィブロネクチン50μg/mL、水中で希釈された蛍光フィブリノーゲン5μg/mL)の溶液中でカバースリップをインキュベートします。
      注: この時点で、PBS に 4 °C のカバーリップを保存することで、実験を一時停止できます。
  3. マイクロパターン化された表面での細胞のシード
    1. マイクロパターンのカバーリップのサイズに合った磁気カバースリップホルダーを使用して、カバーリップを取り付けます。取得日には、カバースリップホルダーを37°Cに加熱し、その後のステップでセルの熱衝撃を避けます。
    2. 20 mM HEPES とペニシリン/ストレプトマイシンの 2% で DMEM/F12 培地を補ってパターン培地を準備します。.
    3. カバースリップをマイクロパターン化されたサイドを上にしてホルダーに入れ、カバースリップがホルダーベースに付くとすぐにパターンメディアを追加します。シールを追加し、磁気デバイスで固定化します。カバースリップホルダーにパターン媒体を充填し、ガラス蓋で閉じます。
      注:カバースリップが乾燥しないように、迅速にしてください。シールは、PLL-g-PEGと反応し、細胞ストレスをもたらす可能性のあるエタノールを保持する可能性があるため、実験の間に、実験の間にエタノールでカバースリップホルダーを洗浄しないでください。カバースリップホルダーは石鹸水のみで洗います。また、残存物を希釈するために、37°Cでパターン媒体中で1時間インキュベートすることができる。
    4. トランスフェクション hTERT-RPE1 細胞をトリプシナイズ(1 つの 12 ウェル プレートに 0.5 mL)で収集し、10% FBS DMEM/F12 培地の 1 mL を追加します。
    5. 0.5 x 106 トランス フェクション hTERT-RPE1 細胞をカバースリップ ホルダーに追加し、再び閉じます。インキュベーターで10分間インキュベートします。
    6. パターン・メディアでカバースリップホルダー5倍を洗浄し、パターン・メディアに1つのピペットを加え、別のピペットで吸い込んで洗浄フローを作り出すことで、非結合セルと残留FBSを除去します。マイクロパターン化されたカバースリップ上の細胞の乾燥を避けるために、常にカバースリップホルダーに少量のパターン培地を保管し、細胞死につながる。
    7. インキュベーター中で3時間インキュベートし、完全な細胞の広がることを可能にする。

2. エキソサイトーシスデータの取得

  1. エキソサイトーシスイベントのイメージング
    1. TIRM の下にカバースリップ ホルダーを置きます。信号は、利用可能な最高のイメージング形式で設定された敏感なカメラによって検出される必要があります。
      注: この実験では、100xレンズの対向部と 512 x 512 ピクセル検出領域を備えた EMCCD カメラを使用し、160 nm のピクセル サイズを生み出しました。
    2. 完全に広がっているVAMP7-pHluorinを発現するセルを検索します(図1A)。
      注: VAMP7 を表すセルは、緑色の信号を示すため、明確に識別できます。
    3. VAMP7-pHluorin エキソサイトーシスイベントの可視化を可能にするTIRF角度に達するまで、レーザーの角度を変更します。顕微鏡ソフトウェアを使用して、exocytosis 速度とタイムスケール(通常は 3 Hz、図 1D)と互換性のある周波数で 5 分の取得を実行します。
      注: hTERT-RPE1 細胞は、マイクロパターン上で約 0.3 Hz のリソソーム分泌速度を有します。リソソームエキサイトーシスは、典型的な持続時間が1sである。ピーク強度の後に指数関数的な減衰が続く特徴です。この時点でプローブの拡散は明らかであるべきです(図1B、C)。 C
    4. 各細胞について、顕微鏡ソフトを用いてマイクロパターンの取得も行う(図1A)。
  2. エキソサイトーシス座標の取得
    1. 取得したムービーを ImageJ/FIJI で開きます。ファイルを使用する|インポート|イメージ シーケンス。目でエキサイトーシスイベントを見つけます。エキサイトーシスイベントは、外側に広がる明るい信号の出現によって特徴付けられる(図1)。
    2. ポイント ツールを使用して、エキソキティック イベントの中心をマークします。分析を使用 する | X 座標と Y 座標、および時間座標 (スライス番号) を測定します。ムービーのすべての興奮性イベントに対してこれらの測定を行います。
    3. 結果を保存する (結果 | ファイル | 名前を付けて保存)。スライス、X 座標、Y 座標を含む"Results(cell_name).txt" という名前の分析されたセルごとに、その順序ですべての exocytosis イベントのテキスト ファイルを準備します。

      テキスト ファイルは次のようになります。
      ID X Y フェレットの直径半径
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      注: すべてのカンマをポイントに置き換えるのは注意してください。
    4. 「楕円形ツール」を使用して、各セルの中心と直径を測定します。完全な円(楕円形を使用しない)をフィットさせ、「測定」を使用してXとYの座標とフェレットの直径を取得します。各セルの ID(ID)、X 座標と Y 座標、フェレットの直径、半径 (直径/2) を"球面パラメータ.txt"という名前のテキスト ファイルに保存します。

      テキスト ファイルは次のようになります。
      ID X Y フェレットの直径半径
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      注: すべてのカンマをポイントに置き換えるのは注意してください。
    5. 直線ツールでマイクロパターンリングの厚さ(接着長)を測定し、セルID、セル半径(ファイルから:"球面parameter.txt")、および「Pattern parameter.txt」という名前のテキストファイルの接着長を保存します。接着長をセル半径で割って正規化接着長を計算します。
      注: すべてのコンマをポイントで置き換える必要があります。

      ファイルは次のようになります。
      IDセル半径接着長正規化接着長
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. 単一セル空間解析

  1. R パッケージとインストール
    注: この解析用の R パッケージは、Spatstat パッケージ13 を利用して、2 次元 (2D) 密度とリプリーの K 関数を計算します。コードはオープン ソースであり、前述のテキスト ファイルを使用します。
    1. https://www.r-project.org/から R をダウンロードしてインストールします (この分析ではバージョン 3.5.2 が使用されました)。
    2. パッケージ (およびデモ データセット) を次のhttps://github.com/GoudTeam/JoVE-paperからダウンロードします。
    3. " パッケージのインストール " を使用して"ツール" を使用して R Studio にパッケージをインストールします。"インストール元:" カテゴリに対して [パッケージ アーカイブ ファイル (.zip; .tar.gz)]を選択し、パッケージ ファイルを選択します。を押す "インストール".
    4. Rスタジオでこのコマンドを書き、Enter"を押して、関数 "ライブラリ(「ExocitosisSpatialAnalysis」)を使用してパッケージを読み込みます。
    5. R studio でこのコマンドを書き、Enterキーを押して、関数"ESA()"を使用してパッケージを実行します。
      注: ユーザー インターフェイスが開きます。
    6. データセット (.txt ファイル) のディレクトリと出力プロットのディレクトリを選択します。
      注: 解析のパラメータ(下記のテキストを参照)は、ユーザインタフェースを介して変更できます。
    7. このスクリプトは自動的に開始され、分析が実行されます。これは、対応するプロットの.pdfファイルと数値結果を含む.txtファイルを提供します。

結果

エキソサイトーシスイベントの時空間的特徴を、hTert-RPE1細胞のVAMP7-pHluorin1010,1111で可視化したリソソームから分析した。hTert-RPE1細胞は、マイクロパターニングによく採用された非形質細胞であり、以前のマイクロパターンベースの研究44,1414で広く使用されてきた。VAMP7は、そのN末端でスーパーエクリプ?...

ディスカッション

リング状の微小パターン正規化細胞におけるVAMP7-pHluorinのTIRFM生細胞イメージングによるリソソームコンパートメントからのエキソサイトーシスイベントをモニタリングし、エキソサイトーシスイベントの空間パラメータの厳密な統計解析を行った。変換されたリプリーのK関数と最も近い近傍距離に基づく統計的検定を採用し、リソソームからの分泌はランダムなプロセス8<...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

我々は、VAMP7-pHluorinプラスミドを提供したティエリー・ガリ(精神医学・神経科学センター、INSERM)を大いに認める。統計分析に関するアドバイスとGOUD研究所のメンバーに対して、実りある議論を行なったTarn Duongに感謝します。著者らは、細胞・組織イメージング施設(PICT-IBiSA@Burg、PICT-EM@Burg、PICT-IBiSA@Pasteur)と、フランス国立研究インフラフランスバイオイメージング(ANR10-INBS-04)のメンバーであるニコンイメージングセンター、インスティトゥートキュリー(パリ)を大いに認めている。H.L.は、協会がラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガン(ARC)を注ぎ、P.M.はマリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第666003年に基づく欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから資金を受け取りました。この研究は、感染ERA(ANR-14-IFEC-0002-04)、ラベックス・セルティスフィバイオ(ANR-10-LBX-0038)、アイデックス・パリ・サイエンシズ・エ・レットレス(ANR-10-IDEX-0001-0001-02 PSL)、およびセンター・ナショナル・ド・ラ・レンチェルチェ・シビッテ・シヴィティー・シヴィティー・シヴィティー・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィット・シヴィット・アンド・イチビティ・ナショナル・ナショナル・デ・ラ・リチェルチェ・シビフィー・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シビティー・アンド・イン・シビティー・ナショナル・ナショナル・ド・ラ・リチェルチェリ・シビッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シビティー

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Chamlide Magnetic ChamberChamlide
DMEM/F12Gibco21041-025
FibrinogenMolecular Probes, InvitrogenF35200
Fibronectin bovine plasmaSigmaF1141
HEPES (1M)Gibco15630-056
hTert RPE1 cell linehttps://www.atcc.org
ImageJhttp://rsbweb.nih.gov/ij/n/aAuthored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagentPolyplus114-07
Penicilin/StreptomycinGibco15140-122
PhotomaskDelta Mask
PLL-g-PEG solutionSurface SolutionsPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Softwarehttps://www.r-project.org/n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)Gibco12605-010
UV ozone ovenJelight Company Inc342-220
VAMP7-pHFluorin plasmidn/an/aPaper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis.
J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200.
Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis.
Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.

参考文献

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  7. Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
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  18. Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).

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163TIRFMCSRVAMP7

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