Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen

Zusammenfassung

Die Live-Bildgebung der lysosomalen Exozytose auf mikromusterten Zellen ermöglicht eine räumliche Quantifizierung dieses Prozesses. Morphologie-Normalisierung mit Mikromustern ist ein hervorragendes Werkzeug, um allgemeine Regeln über die räumliche Verteilung zellulärer Prozesse aufzudecken.

Zusammenfassung

Die Live-Bildgebung des pHluorin-markierten Soluble N-Ethylmaleimid-sensitive-Faktor Attachment-Proteins REceptor (v-SNARE) Vesicle-assoziiertes Membranprotein 7 (VAMP7) durch totale interne Reflexionfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ist eine einfache Möglichkeit, die Sekretion aus dem lysosomalen Fach zu erforschen. Unter Ausnutzung der Zellkultur auf mikrogemusterten Oberflächen, um die Zellform zu normalisieren, wurden eine Vielzahl statistischer Werkzeuge eingesetzt, um eine räumliche Analyse von sekretohierten Mustern durchzuführen. Mit Ripleys K-Funktion und einem statistischen Test basierend auf der nächsten Nachbarentfernung (NND) haben wir bestätigt, dass die Sekretion von Lysosomen kein zufälliger Prozess ist, sondern signifikante Clustering zeigt. Bemerkenswert erweise hat unsere Analyse ergeben, dass Exozytose-Ereignisse auch in Nonadhesionsbereichen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretole Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Dennoch haben wir festgestellt, dass die Zellhaftung das Clustering verbessert. Neben genau definierten Klebe- und Nicht-Klebstoffbereichen ermöglicht die kreisförmige Geometrie dieser Mikromuster die Verwendung von Polarkoordinaten und vereinfacht analysen. Wir verwendeten Kernel Density Estimation (KDE) und die kumulative Verteilungsfunktion auf Polarkoordinaten von Exozytoseereignissen, um angereicherte Bereiche der Exozytose zu identifizieren. In ringförmigen Mikromusterzellen kam es an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen zu Clustering. Unsere Analyse zeigt, wie statistische Werkzeuge eingesetzt werden können, um räumliche Verteilungen verschiedener biologischer Prozesse zu untersuchen.

Einleitung

Exozytose ist ein universeller zellulärer Prozess, bei dem ein Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt und seinen Inhalt freisetzt. Das Vesikel kann entweder vollständig mit der Plasmamembran (Vollfusion) verschmelzen oder eine Fusionspore erzeugen, die während einer begrenzten Zeit offen bleibt (Kiss-and-Run)¹. So werden beispielsweise neu synthetisierte Proteine aus Vesikeln, die aus dem Golgi-Komplex stammen, in das extrazelluläre Medium freigesetzt. Dieser biosynthetische, anterograde Weg ist vor allem bei mehrzelligen Organismen primordial, um Signalpeptide (z. B. Hormone, Neurotransmitter) und extrazelluläre Matrixkomponenten (z. B. Kollagen) sowie den Verkehr von Transmembranproteinen an die Plasmamembran zu sezernieren. Zusätzlich können Sekrete aus verschiedenen Endosomen auftreten: 1) Recycling von Endosomen zur Wiederverwendung von Transmembranproteinen; 2) mehrschichtige Körper (MVBs) zur Freisetzung von Exosomen; und 3) Lysosomen zur Freisetzung von proteolytischen Enzymen. Die endosomale Sekretion hat sich als wichtig für das Neuritenwachstum, die Pseudopodienbildung, die Plasmamembranreparatur und die ATP-abhängige Signalisierung²erwiesen.

Um die Exozytose auf Einzelzellebene zu untersuchen, wurden mehrere Techniken eingesetzt. Patch-Clamp ermöglicht die Detektion einzelner Exozytose-Ereignisse mit einer hohen zeitlichen Auflösung in einer Vielzahl von lebenden Zellen³. Diese Methode liefert jedoch keine Informationen über die Lokalisierung von Exozytose-Ereignissen, noch aus welchem Fach sie auftritt. Die Elektronenmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung exozytischer Ereignisse mit hoher räumlicher Auflösung und liefert in Kombination mit Der Immunolabeling Informationen über die Spezifität der beteiligten Kompartimente und Moleküle. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist der Mangel an Informationen über die Dynamik des Prozesses sowie seine Unfähigkeit, Hochdurchsatzstudien durchzuführen. Lichtmikroskopische Ansätze wie die totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM), die das evaneszierende Feld nutzt, um Fluorophore in der Nähe des Deckslips (100 nm) zu beleuchten, bieten eine gute zeitliche und räumliche Auflösung, um Exozytose-Ereignisse zu untersuchen. Diese Methode ist jedoch nur mit anhaftenden Zellen kompatibel und kann nur auf den ventralen/unteren Zellteil angewendet werden.

Bemerkenswert ist, dass die Plasmamembran eine signifikante Heterogenität auf der Grundlage von Klebstoffkomplexen aufzeigt, die nur in eingeschränkten Bereichen vorhanden sind. Diese Heterogenität schränkt z.B. die Aufnahme verschiedener Liganden^{ein 4}. In ähnlicher Weise wurde kürzlich berichtet, dass die Sekretion aus dem Golgi-Komplex an "Hotspots" in der Plasmamembran⁵konzentriert ist. Darüber hinaus ist bekannt, dass bestimmte Ladungen durch fokaladad-assoziierte Exozytose⁶abgesondert werden. Daher sollte besonderes Augenmerk auf die Frage zu richten, ob Exozytoseereignisse zufällig im Weltraum verteilt sind oder ob sie auf bestimmte Bereiche der Plasmamembran konzentriert sind. Mehrere statistische Instrumente, die auf Ripleys K-Funktion basieren, wurden vorgeschlagen, um diese Fragen zu untersuchen^7,8,9. Unser Ansatz kombiniert diese Werkzeuge mit Mikromusterung zur Steuerung der Zellform und der Heterogenität der Plasmamembran. Diese Technik bietet nicht nur die Möglichkeit, zwischen Klebstoff- und Nichtklebstoffbereichen zu unterscheiden, sondern ermöglicht auch den Vergleich zwischen verschiedenen Zellen und Bedingungen und erhöht die Leistungsfähigkeit statistischer Analysen.

Hier verwenden wir eine Vielzahl statistischer Werkzeuge, um die räumliche Verteilung von Exozytose-Ereignissen aus dem lysosomalen Fach zu untersuchen, das durch TIRFM-Livezellenbildgebung von VAMP7-pHluorin in ringförmigen mikromusternormalisierten hTert-RPE1-Zellen überwacht wird. Es wurde bestätigt, dass die Sekretion von Lysosomen kein zufälliger Prozess^{ist 8,,9} und dass Exozytose-Ereignisse Clustering aufweisen. Bemerkenswert erweise gilt, dass Exozytose-Ereignisse auch in nicht-klebenden Bereichen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretore Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Dennoch hat die Zellhaftung das Clustering verbessert. Konsequenterweise identifizierte unsere Analyse angereicherte Bereiche der Exozytose, die sich an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen befanden.

Protokoll

1. Herstellung von mikrogemusterten Zellen

1. Transfektion von Zellen
   1. Einen Tag vor der Transfektion 2,5 x 10⁶ hTERT-RPE1-Zellen in einen Brunnen einer 12-Well-Platte (2 x 2 cm) in 1 ml Medium.
   2. Am Tag der Transfektion die Transfektionsmischung mit VAMP7-pHluorin-Plasmid (100 l Puffer, 0,8 g DNA, 3 l Transfektionsgemisch) vorbereiten. 10 min inkubieren.
      HINWEIS: VAMP7 ist ein lysosomales v-SNARE, das mit einem luminalen pHluorin-Tag verschmolzen ist. Die pHluorin-Sonde wird durch niedrigen pH-Wert abgeschreckt, aber während der Exozytose werden Protonen freigesetzt und pHluorin beginnt, ein Signal^10,11auszusenden.
   3. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu den Zellen in ihrem Medium hinzu.
   4. Ändern Sie das Medium 4 h nach dem Hinzufügen der Transfektionsmischung auf den Zellen.
   5. Verwenden Sie die Zellen für Experimente während der nächsten 24-48 h.
2. Mikromustervorbereitung (Photolithographiemethode)
   1. Die Deckellipsen (25 mm Durchmesser) in Ethanol waschen und 5 min trocknen lassen.
   2. Aktivieren Sie Abdeckungen durch Beleuchtung unter tiefem UV für 5 min.
   3. Erstellen Sie eine feuchte Kammer, indem Sie ein Papiertuch, auf dem ein Paraffinfilm platziert ist, gründlich befeuchten. Tropfen (30 l für 22 mm Deckblatt) der Poly-L-Lysin-Transplantat-Polyethylenglycol-Lösung (PLL-g-PEG) (0,1 mg/ml, 10 mM HEPES, pH = 7,4) hinzufügen und Abdeckungen mit der aktivierten Oberfläche darauf legen. Schließen Sie die feuchte Kammer mit einer Oberseite und inkubieren Sie Dielipse für 1 h.
   4. Coverlips 2x in PBS und 1x in destilliertem Wasser waschen und trocknen lassen.
   5. Die Quarz-Fotomaske mit destilliertem Wasser und dann mit Ethanol oder Propanol waschen. Trocknen Sie die Fotomaske mit gefiltertem Luftstrom.
      HINWEIS: Die Quarz-Fotomaske ist einseitig mit antireflektierendem Chrom beschichtet, das Löcher in Form von Mikromustern enthält. In diesem Protokoll wird eine Fotomaske verwendet, die ringförmige Mikromuster von 37 m enthält. Wenn tiefeS UV auf die Fotomaske gestrahlt wird, kann das Licht nur durch diese Löcher¹²gehen.
   6. Setzen Sie die Fotomaske (verchromte Seite) 5 min lang tief UV-Strahlung aus, um die Oberfläche zu reinigen.
   7. Kleine Wassertropfen (10 l für einen 20 mm Coverslip) auf die verchromte Seite der Fotomaske geben. Den Deckelzettel mit der PLL-g-PEG-behandelten Seite auf den Tropfen legen und das zusätzliche Wasser trocknen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen der Maske und den Abdeckungen bilden.
      HINWEIS: Die Kapillarkraft des Wassers wird die Abdeckungen immobilisieren.
   8. Setzen Sie die Fotomaske für 5 min mit der nicht verchromten Seite nach oben (die Abdeckungen sind auf der unteren Oberfläche befestigt) tief UV-aussetzen.
      HINWEIS: Das Licht kann nur durch die Löcher gehen und die PLL-g-PEG-behandelte Oberfläche von Abdeckungen unterhalb der Fotomaske modifizieren.
   9. Entfernen Sie die Abdeckungen von der Fotomaske, indem Sie überschüssiges Wasser hinzufügen.
      HINWEIS: Coverslips sollten schnell abschwimmen.
   10. Inkubieren Sie die Abdeckungen in einer Lösung von extrazellulären Matrixproteinen (50 g/ml Fibronectin, 5 g/ml in Wasser verdünntes fluoreszierendes Fibrinogen) auf Paraffinfolie in einer feuchten Kammer (wie in Schritt 1.2.3) für 1 h unter einer laminaren Strömungshaube, um eine Kontamination zu vermeiden.
       HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden, indem die Abdeckungen in PBS bei 4 °C gespeichert werden.
3. Zellsaataufung auf mikrogemusterten Oberflächen
   1. Verwenden Sie einen magnetischen Deckelhalter, der der Größe der mikrogemusterten Abdeckungen entspricht, um die Abdeckungen zu montieren. Am Tag der Erfassung den Deckelschlupfhalter auf 37 °C erhitzen, um thermischen Schock für die Zellen in den nachfolgenden Schritten zu vermeiden.
   2. Bereiten Sie das Mustermedium vor, indem Sie DMEM/F12 medium mit 20 mM HEPES und 2% Penicillin/Streptomycin ergänzen.
   3. Legen Sie Deckellipsen mit der mikrogemusterten Seite nach oben in den Halter und fügen Sie Mustermedium hinzu, sobald sich der Deckelschlupf auf der Halterbasis befindet. Fügen Sie die Dichtung hinzu und immobilisieren Sie mit dem magnetischen Gerät. Füllen Sie den Deckelhalter mit dem Mustermedium und schließen Sie ihn mit dem Glasdeckel.
      HINWEIS: Seien Sie schnell, um den Deckelrutsch nicht trocknen zu lassen. Waschen Sie den Deckelhalter zwischen den Experimenten nicht mit Ethanol, da die Dichtung etwas Ethanol behalten könnte, das mit PLL-g-PEG reagieren und zu Zellstress führen kann. Waschen Sie den Deckelhalter nur mit Seifenwasser. Darüber hinaus kann das Gelenk im Mustermedium bei 37 °C für 1 h inkubiert werden, um das Restprodukt zu verdünnen.
   4. Sammeln Sie transfizierte hTERT-RPE1-Zellen durch Trypsinisierung (0,5 ml für eine 12-Well-Platte) und fügen Sie 1 ml 10% FBS DMEM/F12 medium hinzu.
   5. 0,5 x 10⁶ transfizierte hTERT-RPE1-Zellen in den Deckelschlupfhalter geben und wieder schließen. 10 min im Inkubator inkubieren.
   6. Waschen Sie den Coverslip-Halter 5x mit Mustermedium, um nicht angefügte Zellen und Rest-FBS zu entfernen, indem Sie das Mustermedium mit einer Pipette hinzufügen und das Medium mit einer anderen Pipette ansieren, um einen Waschfluss zu erzeugen. Halten Sie immer ein kleines Volumen des Mustermediums im Deckelhalter, um das Trocknen der Zellen auf dem mikrogemusterten Deckelzuschlag zu vermeiden, was zum Zelltod führt.
   7. Inkubieren Sie im Inkubator für 3 h, um eine vollständige Zellausbreitung zu ermöglichen.

2. Erfassung von Exozytosedaten

1. Abbildung von Exozytose-Ereignissen
   1. Platzieren Sie den Deckelhalter unter einem TIRM. Das Signal muss von einer empfindlichen Kamera mit dem besten verfügbaren Bildformat erkannt werden.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurden ein 100-faches Objektiv objektiv und eine EMCCD-Kamera mit 512 x 512 Pixel-Erkennungsbereich verwendet, was zu einer Pixelgröße von 160 nm führte.
   2. Suchen Sie nach einer Zelle, die VAMP7-pHluorin exprosient, die vollständig verbreitet ist (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Zellen, die VAMP7 exemiten, sind eindeutig identifizierbar, da sie ein grünes Signal aufweisen.
   3. Ändern Sie den Winkel des Lasers, bis ein TIRF-Winkel erreicht ist, der die Visualisierung von VAMP7-pHluorin-Exozytose-Ereignissen ermöglicht. Führen Sie eine Erfassung von 5 min bei einer Frequenz durch, die mit der Exozytoserate und der Zeitskala (typischerweise 3 Hz, Abbildung 1D) mit der Mikroskopsoftware kompatibel ist.
      HINWEIS: hTERT-RPE1-Zellen haben eine lysosomale Sekretoretorerate von etwa 0,3 Hz auf Mikromustern. Die lysosomale Exozytose hat eine typische Dauer von 1 s. Es zeichnet sich durch eine Spitzenintensität, gefolgt von einem exponentiellen Zerfall aus. Die Diffusion der Sonde sollte zu diesem Zeitpunkt offensichtlich sein (Abbildung 1B, C).
   4. Führen Sie für jede Zelle auch eine Erfassung des Mikromusters mit der Mikroskopsoftware durch (Abbildung 1A).
2. Erfassung von Exozytose-Koordinaten
   1. Öffnen Sie den erworbenen Film mit ImageJ/FIJI. Datei File verwenden | Import | Bildsequenz. Finden Sie Exozytose-Ereignisse mit dem Auge. Ein Exozytose-Ereignis zeichnet sich durch das Auftreten eines hellen Signals aus, das sich nach außen ausbreitet (Abbildung 1).
   2. Verwenden Sie das Punktwerkzeug, um den Mittelpunkt des exozytischen Ereignisses zu markieren. Verwenden von Analyze | Messen, um X- und Y-Koordinaten sowie die zeitliche Koordinate (Slice-Zahl) zu messen. Führen Sie diese Messungen für alle Exozytose-Ereignisse des Films durch.
   3. Speichern der Ergebnisse (Ergebnisse | Datei | Speichern unter). Bereiten Sie eine Textdatei für jede analysierte Zelle mit dem Namen "Results(cell_name.txt" vor, die das Slice, die X-Koordinaten und die Y-Koordinaten für alle Exozytoseereignisse in dieser Reihenfolge enthält.
      
      Die Textdatei soll wie folgt aussehen:
      ID X Y Ferets Durchmesser Radius
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Kommas durch Punkte zu ersetzen.
   4. Messen Sie den Mittelpunkt und Den Durchmesser jeder Zelle mit dem "Oval Tool". Passen Sie einen perfekten Kreis an (verwenden Sie kein Oval) und verwenden Sie "Messen", um die X- und Y-Koordinaten und den Feret-Durchmesser zu erhalten. Speichern Sie die Identität (ID), die X- und Y-Koordinaten, die Feret-Koordinaten und den Radius (Durchmesser/2) in einer Textdatei mit dem Namen "Spherical parameter.txt".
      
      Die Textdatei soll wie folgt aussehen:
      ID X Y Ferets Durchmesser Radius
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Kommas durch Punkte zu ersetzen.
   5. Messen Sie die Dicke des Mikromusterrings (Haftungslänge) mit dem geraden Werkzeug und speichern Sie die Zellen-ID, den Zellradius (aus der Datei: "Sphärischer parameter.txt") und die Haftungslänge in einer Textdatei mit dem Namen "Pattern parameter.txt". Berechnen Sie die normalisierte Haftlänge, indem Sie die Haftlänge durch den Zellradius dividieren.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Kommas durch Punkte zu ersetzen.
      
      Die Datei sollte wie folgt aussehen:
      ID Zellradius Haftlänge Normalisierte Haftungslänge
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826

3. Einzelzellige räumliche Analyse

1. R-Paket und Installation
   HINWEIS: Das R-Paket für diese Analyse nutzt das Spatstat-Paket^13, um die zweidimensionale (2D) Dichte und Ripleys K-Funktion zu berechnen. Der Code ist Open-Source und verwendet Zuvor beschriebene Textdateien.
   1. Herunterladen und Installieren von R von https://www.r-project.org/ (Version 3.5.2 wurde in dieser Analyse verwendet).
   2. Laden Sie das Paket (und das Demo-Dataset) herunter von: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
   3. Installieren Sie das Paket auf R Studio mit "Tools" mit "Install Packages". Wählen Sie "Package Archive File (.zip; .tar.gz)" für die Kategorie "Install from :" und wählen Sie die Paketdatei aus. Drücken Sie "Installieren".
   4. Laden Sie das Paket mit der Funktion "library("ExocytosisSpatialAnalysis")", indem Sie diesen Befehl in R studio schreiben und"Enter" drücken.
   5. Führen Sie das Paket mit der Funktion "ESA()" aus, indem Sie diesen Befehl im R-Studio schreiben und "Enter" drücken.
      HINWEIS: Eine Benutzeroberfläche wird geöffnet.
   6. Wählen Sie das Verzeichnis für das Dataset (.txt-Dateien) und ein Verzeichnis für Ausgabediagramme aus.
      HINWEIS: Parameter der Analyse (siehe Text unten) können über eine Benutzeroberfläche geändert werden.
   7. Dieses Skript wird automatisch gestartet und führt die Analyse durch. Es bietet .pdf Dateien von entsprechenden Plots und .txt Dateien mit numerischen Ergebnissen.

Ergebnisse

Die räumlich zeitlichen Eigenschaften von Exozytose-Ereignissen wurden anhand von Lysosomen analysiert, die durch VAMP7-pHluorin^10,11 in hTert-RPE1-Zellen visualisiert wurden. hTert-RPE1-Zellen sind nicht transformierte Zellen, die sich gut an Mikromustern ereignen und in früheren Mikromuster-basierten Studien^4,14ausgiebig verwendet wurden. VAMP7 ist ein lysosomales v-SNARE^15, da...

Diskussion

Wir überwachten Exozytose-Ereignisse aus dem lysosomalen Fach durch TIRFM-Livezellbildgebung von VAMP7-pHluorin in ringförmigen mikromusternormalisierten Zellen und führten eine strenge statistische Analyse der räumlichen Parameter von Exozytoseereignissen durch. Unter Verwendung der transformierten Ripley-Funktion K und eines statistischen Tests auf der Grundlage der nächsten Nachbardistanz bestätigten wir, dass die Sekretion von Lysosomen kein zuzufälliger Prozess ist^8,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.