Mikro Desenli Hücrelerde Hücresel Eksositozun Spatiotemporal Parametrelerinin Ölçülmesi

Özet

Mikro desenli hücrelerde izosomal ekzositozun canlı görüntülemesi bu sürecin mekansal bir niceleifikasyonuna olanak sağlar. Mikro desenler kullanarak morfoloji normalleştirme hücresel süreçlerin mekansal dağılımı hakkında genel kuralları ortaya çıkarmak için olağanüstü bir araçtır.

Özet

PHluorin etiketli Çözünür N-etilmaleimid-duyarlı faktör Ek protein ReEceptor (v-SNARE) Vezikül ilişkili membran protein 7 (VAMP7) toplam iç yansıma floresan mikroskop (TIRFM) tarafından canlı görüntüleme lisosomal bölmesi salgıyı keşfetmek için basit bir yoldur. Hücre şeklini normalleştirmek için mikro desenli yüzeylerdeki hücre kültüründen yararlanarak, salgı desenlerinin mekansal analizini yapmak için çeşitli istatistiksel araçlar kullanılmıştır. Ripley'in K fonksiyonunu ve en yakın komşu mesafesine (NND) dayalı istatistiksel bir test kullanarak, lizozomlardan salgılanmanın rastgele bir süreç olmadığını, ancak önemli kümelenmeler gösterdiğini doğruladık. Analizlerimiz eksozis olaylarının da yapışmaz bölgelerde kümelenmiş olduğunu ortaya çıkararak, plazma zarında salgılayıcı sıcak noktalara neden olabilecek tek yapının yapışma molekülleri olmadığını göstermektedir. Yine de, hücre yapışmanın kümeleme artırır bulundu. Tam olarak tanımlanmış yapışkan ve yapışkan olmayan alanlara ek olarak, bu mikro desenlerin dairesel geometrisi kutupsal koordinatların kullanılmasına olanak sağlar ve analizleri basitleştirir. Eksozisin zenginleştirilmiş alanlarını belirlemek için Çekirdek Yoğunluk Tahmini (KDE) ve eksozis olaylarının polar koordinatlarında kümülatif dağılım fonksiyonunu kullandık. Halka şeklindeki mikro desenli hücrelerde, yapıştırıcı ve yapışkan olmayan alanlar arasındaki sınırda kümelenme meydana geldi. Analizlerimiz, çeşitli biyolojik süreçlerin mekansal dağılımlarını araştırmak için istatistiksel araçların nasıl kullanılabildiğini göstermektedir.

Giriş

Eksozisoz, vezikülün plazma zarı ile kaynaşıp içeriğini serbest bıraktırdığı evrensel bir hücresel süreçtir. Vezikül ya plazma membran (tam füzyon) ile tamamen sigorta veya sınırlı bir süre boyunca açık kalır bir füzyon gözenek oluşturmak (kiss-and-run)¹. Örneğin, yeni sentezlenen proteinler Golgi kompleksinden gelen veziküllerden hücre dışı ortama salınır. Bu biyosentetik, anterograd yolu ilkel, özellikle çok hücreli organizmalarda, sinyal peptidler salgılamak için (örneğin, hormonlar, nörotransmitterler) ve ekstrasellüler matriks bileşenleri (örneğin, kollajen), yanı sıra plazma membran trafik transmembran proteinleri. Ayrıca, salgıları farklı endozomlarda oluşabilir: 1) transmembran proteinleri yeniden kullanmak için geri dönüşüm endozoslar; 2) çok vezizküler cisimler (MVBs) ekzozomlar serbest bırakmak için; ve 3) proteolitik enzimlerin salınımı için lizozomlar. Endozomal salgının neurite büyüme, psödopodi oluşumu, plazma membran onarımı ve ATP'ye bağlı sinyalizasyon²için önemli olduğu gösterilmiştir.

Tek hücre düzeyinde eksofisoz çalışması için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Patch-clamp canlı hücrelerin geniş bir yelpazede yüksek zamansal çözünürlük ile tek eksozis olaylarının tespiti için izin verir³. Ancak, bu yöntem eksozis olaylarının yerelleştirilmesi veya hangi bölmeden oluştuğu hakkında bilgi sağlamaz. Elektron mikroskobu, ekszositik olayların yüksek uzamsal çözünürlükte doğrudan görüntülenmesine olanak sağlar ve immünetiketleme ile birlikte ilgili bölmelerin ve moleküllerin özgüllüğü hakkında bilgi sağlar. Bu yaklaşımın bir dezavantajı sürecin dinamikleri hakkında bilgi eksikliği yanı sıra yüksek iş itimat ları gerçekleştirmek için yetersizlik olduğunu. Coverslip (100 nm) civarındaki floroforları aydınlatmak için evanescent alanını kullanan total internal yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) gibi ışık mikroskobu yaklaşımları, eksositoz olaylarını incelemek için iyi zamansal ve mekansal çözünürlük sağlar. Ancak, bu yöntem sadece yapışık hücrelerle uyumludur ve sadece hücrelerin ventral/alt kısmına uygulanabilir.

Dikkat dikkat, plazma membran sadece kısıtlı alanlarda mevcut yapışkan kompleksleri dayalı önemli heterojenite ortaya koymaktadır. Bu heterojenlik, örneğin, farklı ligands^alımınıkısıtlar 4 . Benzer şekilde, son zamanlarda Golgi kompleksinden salgı plazma membran^"sıcaknoktalar" 5 yoğunlaşmıştır bildirilmiştir. Ayrıca bazı kargoların fokal-yapışma ile ilişkili eksozitoz⁶ile salgılandırılan bilinmektedir. Bu nedenle eksositoz olaylarının uzayda rastgele dağılıp dağıtılmadığı veya plazma zarının belirli bölgelerinde yoğunlanıp yoğunlaşmadığı sorusuna özel bir dikkat edilmelidir. Ripley's K fonksiyonudayalı çeşitli istatistiksel araçlar bu soruları keşfetmek için önerilmiştir^7,8,9. Yaklaşımımız hücre şekli ve plazma membran heterojenliğini kontrol etmek için mikro desenleme ile bu araçları birleştirir. Yapışkan ve yapışkan olmayan alanları ayırt etmek için bir araç sağlamanın yanı sıra, bu teknik aynı zamanda farklı hücreler ve koşullar arasında karşılaştırma sağlar ve istatistiksel analizlerin gücünü artırır.

Burada, RING şekilli mikro desenli hTert-RPE1 hücrelerinde VAMP7-pHluorin'in TIRFM canlı hücre görüntülemesi ile izlenen lysosomal kompartmandan ekzositoz olaylarının mekansal dağılımını incelemek için çeşitli istatistiksel araçlar uyguluyoruz. Bu izozomlardan salgı rastgele bir süreç^8,,⁹ değildir ve ekzositoz olayları kümelenme sergi doğrulandı. Eksozis olaylarının da adhesif olmayan bölgelerde kümelenmiş olduğunu ve adezyon moleküllerinin plazma zarında salgı layıcı sıcak noktalara neden olabilecek tek yapı olmadığını gördük. Yine de, hücre yapışması kümeleme geliştirmek yaptı. Analizlerimiz sürekli olarak yapışkan ve yapışkan olmayan bölgeler arasındaki sınırda bulunan zenginleştirilmiş eksofis alanları tespit etti.

Protokol

1. Mikro desenli hücrelerin hazırlanması

1. Hücrelerin transfeksiyonu
   1. Transfeksiyondan bir gün önce, tohum 2.5 x 10⁶ hTERT-RPE1 hücrelerini 1 mL orta 12 kuyuplakadan (2 x 2 cm) bir kuyuya yerleştirin.
   2. Transfeksiyon gününde, transfeksiyon karışımını VAMP7-pHluorin plazmid (100 μL tampon, 0.8 g DNA, 3 μL transfection karışımı) ile hazırlayın. 10 dakika kuluçka.
      NOT: VAMP7 bir lysosomal v-SNARE, luminal pHluorin etiketi ile erimiş. PHluorin probu düşük pH ile söndürülür, ancak eksoz proton lar serbest bırakılır ve pHluorin bir sinyal yaymaya başlar^10,11.
   3. Transfeksiyon karışımını kendi ortamlarındaki hücrelere ekleyin.
   4. Hücrelere transfeksiyon karışımı ekledikten sonra orta 4 saat değiştirin.
   5. Sonraki 24-48 saat boyunca deneyler için hücreleri kullanın.
2. Mikrodesen hazırlama (fotolitografi yöntemi)
   1. Kapakları (25 mm çapında) etanolde yıkayın ve 5 dakika kurutun.
   2. 5 dakika boyunca derin UV altında aydınlatma tarafından coverlips etkinleştirin.
   3. Bir parafin filminin yerleştirildiği kağıt havluyu iyice nemlendirerek nemli bir oda oluşturun. Poli-Lizin-greft-Polietilen Glikol (PLL-g-PEG) çözeltisi (0.1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH = 7.4) damla (22 mm coverslip için 30 μL) ekleyin ve üzerlerinde aktif yüzey bulunan kapakları yerleştirin. 1 saat boyunca bir üst ve kuluçka kapakları ile nemli oda kapatın.
   4. Kapakları PBS'de 2 x, distile suda 1 kat layın ve kurutun.
   5. Kuvars fotokopisini distile suyla ve ardından etanol veya propanol ile yıkayın. Fotomaskeyi filtrelenmiş hava akışı yla kurulayın.
      NOT: Kuvars fotomaske mikro desenler şeklinde delikler içeren antiyansıtıcı krom ile bir tarafta kaplanır. Bu protokolde 37 μm'lik halka şeklinde mikro desenler içeren bir fotomaske kullanılır. Derin UV fotomaske üzerinde parlatıcı olduğunda, ışık sadece bu deliklerden geçebilir¹².
   6. Yüzeyi temizlemek için fotomaskeyi (krom kaplı tarafı) 5 dakika boyunca derin UV'ye maruz bırakın.
   7. Fotoğraf maskesinin krom kaplı tarafına küçük su damlaları (20 mm coverslip için 10 l) ekleyin. Kapak kapağını PLL-g-PEG ile işlenmiş yanlarıyla birlikte damlaya yerleştirin ve ekstra suyu kurulayın. Maske ve kapaklar arasında hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun.
      NOT: Suyun kılcal kuvveti kapakları hareketsiz hale getirecektir.
   8. Fotomaskeyi krom kaplı olmayan kenarı yukarı (kapaklar alt yüzeye takılı) ile 5 dakika boyunca derin UV'ye maruz bırakın.
      NOT: Işık sadece deliklerden geçebilir ve fotomaskenin altındaki kapak kapaklarının PLL-g-PEG ile işlenmiş yüzeyini değiştirebilir.
   9. Fazla su ekleyerek kapakdudaklarını fotoğraf maskesinden çıkarın.
      NOT: Kapaklar hızlı bir şekilde süzülmelidir.
   10. Kapakçıkları, kontaminasyonu önlemek için 1 saat boyunca nemli bir odada (1.2.3 adımda olduğu gibi) parafin filminde hücre dışı matriks proteinlerinin (fibronektin 50 g/mL'si, suda seyreltilmiş 5 g/mL floresan fibrinojen) çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
       NOT: Deney, kapak kapakları nın PBS'de 4 °C'de saklanması yla bu noktada duraklatılabilir.
3. Mikro desenli yüzeylerde hücre tohumlama
   1. Kapakları takmak için mikro desenli kapak dudaklarının boyutuna uyan manyetik bir kapak tutucu kullanın. Satın alma gününde, sonraki adımlarsırasında hücreler için termal şoku önlemek için kapak tutucuyu 37 °C'ye ısıtın.
   2. DMEM/F12 ortamını 20 mM HEPES ve penisilin/streptomisinin %2'sini tamamlayarak desen ortamını hazırlayın.
   3. Kapakları mikro desenli tarafı yukarı ile tutucuya yerleştirin ve kapak tabanına girer girmez desen ortamı ekleyin. Mührü ekleyin ve manyetik cihaz ile hareketsiz hale getirin. Kapak tutucuyu desen ortasıyla doldurun ve cam kapakla kapatın.
      NOT: Kapak kaymasının kurumasını sağlamak için hızlı olun. Kapak tutucuyu deneyler arasında etanolle yıkamayın, çünkü mühür PLL-g-PEG ile reaksiyona girebilen ve hücre stresine neden olabilecek bazı etanolleri koruyabilir. Kapak tutucuyu sadece sabunlu suyla yıkayın. Ayrıca, eklem kalıntı ürünü seyreltmek için 37 °C'de 1 saat boyunca desen lisenin içinde kuluçkaya yayılabilir.
   4. Transekse hTERT-RPE1 hücrelerini tripsinizasyon (bir 12 kuyu plakası için 0,5 mL) toplayın ve 1 mL %10 FBS DMEM/F12 ortamı ekleyin.
   5. Kapak tutucuya 0,5 x 10⁶ transfected hTERT-RPE1 hücreleri ekleyin ve yeniden kapatın. Kuluçka makinesinde 10 dakika kuluçka.
   6. Bir pipet le desen orta ekleyerek ve bir yıkama akışı oluşturmak için başka bir pipet ile orta aspire ederek, bağlı olmayan hücreleri ve artık FBS kaldırmak için desen orta ile coverslip tutucu 5x yıkayın. Mikro desenli kapaktaki hücrelerin kurumasını önlemek için kapak tutucuda her zaman küçük bir hacimli desen liyakatı saklayın, bu da hücre ölümüne yol açacaktır.
   7. Tam hücre yayılmasını sağlamak için 3 saat için kuluçka.

2. Eksoz verilerinin elde edilmesi

1. Eksoz olaylarının görüntülenmesi
   1. Bir TIRM altında kapak tutucu yerleştirin. Sinyal, mevcut en iyi görüntüleme formatına sahip hassas bir kamera tarafından algılanmalıdır.
      NOT: Bu deneyde, 160 nm piksel boyutuna yol açan 512 x 512 piksel algılama bölgesine sahip 100x lens hedefi ve Bir EMCCD kamera kullanılmıştır.
   2. Tam olarak yayılmış VAMP7-pHluorin ifade eden bir hücre arayın (Şekil 1A).
      NOT: VAMP7'yi ifade eden hücreler açıkça tanımlanabilir, çünkü yeşil bir sinyal sergilerler.
   3. VAMP7-pHluorin eksoz olaylarının görüntülenmesine olanak tanıyan TIRF açısına ulaşın. Mikroskop yazılımını kullanarak eksoz oranı ve zaman ölçeği (genellikle 3 Hz, Şekil 1D)ile uyumlu bir frekansta 5 dk'lık bir kazanım gerçekleştirin.
      NOT: hTERT-RPE1 hücrelerinin mikro desenlerde yaklaşık 0.3 Hz lik bir lisozomal salgı hızı vardır. Ksozomal ekzositozun tipik bir süresi 1 s. Bu bir üstel çürüme takip bir tepe yoğunluğu ile karakterizedir. Probun difüzyonu şu anda belirgin olmalıdır(Şekil 1B, C).
   4. Her hücre için, mikroskop yazılımı(Şekil 1A)kullanarak mikrodesen bir edinimi gerçekleştirmek.
2. Eksozis koordinatlarının alınması
   1. Satın alınan filmi ImageJ/FIJI ile açın. Dosyayı Kullan | İthalat | Görüntü Sırası. Eksozis olaylarını göz ile bulun. Eksozis olayı, dışa doğru yayılan parlak bir sinyalin görünümü ile karakterizedir (Şekil 1).
   2. Ekskositik olayın merkezini işaretlemek için nokta aracını kullanın. Analiz Kullan | X ve Y koordinatlarını ve zamansal koordinatı (dilim sayısını) ölçmek için ölçün. Filmin tüm eksozis olayları için bu ölçümleri gerçekleştirin.
   3. Sonuçları kaydet (Sonuçlar | Dosya | Olarak Kaydet). Bu sırada ki tüm eksozis olayları için dilim, X koordinatları ve Y koordinatlarını içeren "Sonuçlar(cell_name).txt" adlı her çözümlenmiş hücre için bir metin dosyası hazırlayın.
      
      Metin dosyasının aşağıdaki gibi görünmesi gerekir:
      ID X Y Feret'in çapı Yarıçapı
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      NOT: Tüm virgülleri puanlarla değiştirmeye dikkat edin.
   4. "Oval Alet" kullanarak her hücrenin merkezini ve çapını ölçün. Mükemmel bir daire sığdırın (oval kullanmayın) ve X ve Y koordinatlarını ve Feret'in çapını elde etmek için "Ölçü" kullanın. Her hücrenin kimliğini (kimliği), X ve Y koordinatlarını, Feret'in çapını ve yarıçapını (çap/2) "Küresel parametre.txt" adlı bir metin dosyasına kaydedin.
      
      Metin dosyasının aşağıdaki gibi görünmesi gerekir:
      ID X Y Feret'in çapı Yarıçapı
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      NOT: Tüm virgülleri puanlarla değiştirmeye dikkat edin.
   5. Mikro desen halkasının (yapışma uzunluğu) kalınlığını düz bir araçla ölçün ve hücre kimliğini, hücre yarıçapını (dosyadan: "Küresel parametre.txt") ve "Desen parametresi.txt" adlı bir metin dosyasında yapışma uzunluğunu kaydedin. Yapışma uzunluğunu hücre yarıçapına bölerek normalleştirilmiş yapışma uzunluğunu hesaplayın.
      NOT: Tüm virgülleri puanla değiştirmeye dikkat edin.
      
      Dosya aşağıdaki gibi görünmelidir:
      ID Hücre yarıçapı adezyon uzunluğu Normalleştirilmiş yapışma uzunluğu
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826

3. Tek hücreli uzamsal analiz

1. R paketi ve montajı
   NOT: Bu analiz için R paketi, iki boyutlu (2D) yoğunluğu nu ve Ripley'in K işlevini hesaplamak için Spatstat paketi^13'ten yararlanır. Kod açık kaynak kodludur ve daha önce açıklanan metin dosyalarını kullanır.
   1. https://www.r-project.org/'dan R'yi indirin ve yükleyin (sürüm 3.5.2 bu analizde kullanılmıştır).
   2. Paketi (ve demo veri kümesini) şu gönderenlerden indirin: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
   3. Paketi R Studio'da "Tools" kullanarak "Install Packages" kullanarak yükleyin. "Paket Arşiv Dosyası (.zip; .tar.gz)" kategorisi için "Install from:" seçeneğini belirleyin ve paket dosyasını seçin. Basın "Install".
   4. Paketi R stüdyosuna bu komutu yazarak ve "Enter" tuşuna basarak "library("ExocytosisSpatialAnalysis")" işleviile yükleyin.
   5. Paketi "ESA()" işlevi ile r stüdyosuna bu komutu yazarak ve "Enter" tuşuna basarak çalıştırın.
      NOT: Bir kullanıcı arabirimi açılır.
   6. Veri kümesi (.txt dosyaları) dizini ve çıktı çizimleri için bir dizini seçin.
      NOT: Analiz parametreleri (aşağıdaki metne bakın) bir kullanıcı arabirimi üzerinden değiştirilebilir.
   7. Bu komut dosyası otomatik olarak başlatılacak ve çözümleme gerçekleştirecek. Sayısal sonuçlar içeren ilgili çizimlerin ve .txt dosyalarının .pdf dosyalarını sağlar.

Sonuçlar

Ekzositoz olaylarının spatiotemporal özellikleri VAMP7-pHluorin^10,11 hTert-RPE1 hücrelerinde görüntülenen lizozomlardan analiz edildi. hTert-RPE1 hücreleri mikro desenleme iyi benimsemek ve yaygın önceki mikrodesen tabanlı çalışmalarda kullanılmıştır dönüştürülmemiş hücrelerdir^4,14. VAMP7, N-terminus'unda süper ekliptik pHluorin ile etiketlenmiş ve lizoomun lümeninde bulunan bi...

Tartışmalar

Ring şeklindeki mikrodesen-normalleşmiş hücrelerde VAMP7-pHluorin'in TIRFM canlı hücre görüntülemesi ile lisozomal kompartmandan ekzositoz olaylarını izledik ve ekzositoz olaylarının uzamsal parametrelerinin titiz bir istatistiksel analizini yaptık. Dönüştürülmüş Ripley's K fonksiyonu ve en yakın komşu mesafesine göre istatistiksel bir test istihdam, biz lizozomlardan salgı rastgele bir işlem⁸olmadığını doğruladı^{8 ,9}. Her iki istat...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.