כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned

Summary

הדמיה חיה של אקסוציטוזיס ליזומלי על תאים מיקרו-פטרניים מאפשרת כימות מרחבית של תהליך זה. נורמליזציה מורפולוגית באמצעות מיקרו-פטרנים היא כלי יוצא מן הכלל לחשיפת כללים כלליים לגבי ההפצה המרחבית של תהליכים סלולריים.

Abstract

הדמיה חיה של pHluorin מתויג מסיס N-ethylmaleimide-רגיש-גורם חיבור חלבון REceptor (v-SNARE) Vesicle הקשורים קרום חלבון 7 (VAMP7) על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) היא דרך פשוטה לחקור הפרשה מהתא lysosomal. ניצול של תרבות התא על משטחים micropatterned כדי לנרמל את צורת התא, מגוון רחב של כלים סטטיסטיים הועסקו כדי לבצע ניתוח מרחבי של דפוסי הפרשה. באמצעות פונקציית K של ריפלי ומבחן סטטיסטי המבוסס על מרחק השכן הקרוב ביותר (NND), אישרנו כי הפרשה מlysosomes אינה תהליך אקראי, אבל מראה קיבוץ באשכולות משמעותי. שימו לב, הניתוח שלנו גילה כי אירועי אקסוציטוזיס מקובצים גם באזורים שאינם הדבקה, המציין כי מולקולות הדבקה אינן המבנים היחידים שיכולים לגרום לנקודות חמות הפרשה על קרום הפלזמה. ובכל זאת, מצאנו שהדבקת תאים משפרת את התקבצות האשכולות. בנוסף לאזורים דביקים ולא דביקים מוגדרים במדויק, הגיאומטריה המעגלית של מיקרו-פטרנים אלה מאפשרת שימוש בקואורדינטות קוטביות, ומפשטת את הניתוחים. השתמשנו הערכת צפיפות ליבה (KDE) ואת פונקציית ההתפלגות המצטברת על קואורדינטות קוטביות של אירועי אקסוציטוזיס כדי לזהות אזורים מועשרים של אקסוציטוזיס. בתאי מיקרו-פטרן בצורת טבעת, התקבצות אירעה בגבול בין האזורים הדביקים לאזורים שאינם דביקים. הניתוח שלנו ממחיש כיצד ניתן להשתמש בכלים סטטיסטיים כדי לחקור הפצות מרחביות של תהליכים ביולוגיים מגוונים.

Introduction

אקסוציטוזיס הוא תהליך תאי אוניברסלי שבו שלוק מתפתל עם קרום הפלזמה ומשחרר את תכולתו. שלבית יכול להתמזג לחלוטין עם קרום פלזמה (היתוך מלא) או ליצור נקבובית היתוך שנשאר פתוח בזמן מוגבל (נשיקה וריצה)¹. לדוגמה, חלבונים מסונתזים חדשים משתחררים למדיום החוץ-תאי מהשלוקים שהגיעו ממתחם Golgi. מסלול זה biosynthetic, anterograde הוא קדמוני, במיוחד אורגניזמים רב תאיים, כדי להפריס פפטידים איתות (למשל, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים) ורכיבי מטריצה חוץ תאית (למשל, קולגן), כמו גם את התנועה חלבוני טרנסמברנה לממברנה פלזמה. בנוסף, הפרשות יכולות להתרחש אנדוזומים שונים: 1) מיחזור אנדוזומים על מנת לעשות שימוש חוזר חלבונים transmembrane; 2) גופים רב-ווריקולריים (MVBs) לשחרור אקסוזומים; ו-3) ליזומה לשחרור אנזימים פרוטאוליטיים. הפרשה אנדו-פלומטית כבר הראה להיות חשוב עבור גידול נורייט, היווצרות פסאודופודיה, תיקון קרום פלזמה, ואיתות תלוי ATP².

כדי ללמוד אקסוציטוזיס ברמת תא יחיד, מספר טכניקות הועסקו. מהדק תיקון מאפשר זיהוי של אירועי אקסוציטוזיס יחיד עם רזולוציה זמנית גבוהה במגוון רחב של תאים חיים³. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת מידע על התאמה למיקום אחר של אירועי אקסוציטוזיס, ולא מאיזה תא היא מתרחשת. מיקרוסקופאלקטרונים מאפשרת הדמיה ישירה של אירועים אקסוציטיים ברזולוציה מרחבית גבוהה, ובשילוב עם חיסונים מספקת מידע על הספציפיות של התאים והמולקולות המעורבים. חיסרון בגישה זו הוא חוסר המידע על הדינמיקה של התהליך, כמו גם חוסר יכולתו לבצע מחקרים בתפוקה גבוהה. גישות מיקרוסקופיות אור כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM), אשר מנצל את השדה evanescent כדי להאיר פלואורופורים בקרבת כיסוי (100 טנ"מ), מספק רזולוציה זמנית ומרחבית טובה כדי ללמוד אירועי אקסוציטוזיס. עם זאת, שיטה זו תואמת רק לתאים דבקים ותוחל רק על החלק האוורירי/נחות של התאים.

הערה, קרום הפלזמה חושף הטרוגניות משמעותית המבוססת על תסביכי דבק הנוכחיים רק באזורים מוגבלים. הטרוגניות זו מגבילה, למשל, את ספיגת ליגנדים^{שונים 4}. באופן דומה, לאחרונה דווח כי הפרשה ממתחם Golgi מרוכזת "נקודות חמות" קרום פלזמה⁵. יתר על כן, ידוע כי מטענים מסוימים מופרשים באמצעות exocytosis הקשורים למוקד^{הדבקה 6}. לכן, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולמת לשאלה אם אירועי אקסוציטוזיס מופצים באופן אקראי בחלל, או אם הם מרוכזים באזורים מסוימים של קרום הפלזמה. מספר כלים סטטיסטיים המבוססים על פונקציית K של ריפלי הוצעו לחקור את^{השאלות האלה 7,8,9}. הגישה שלנו משלבת כלים אלה עם micropatterning כדי לשלוט בצורת התא והטרוגניות קרום פלזמה. בנוסף למתן אמצעי להבחין בין אזורים דביקים ולא דביקים, טכניקה זו גם מאפשרת השוואה בין תאים ותנאים שונים ומגבירה את כוחם של ניתוחים סטטיסטיים.

כאן אנו מעסיקים מגוון של כלים סטטיסטיים כדי ללמוד את ההתפלגות המרחבית של אירועי אקסוציטוזיס מתא lysosomal בפיקוח TIRFM הדמיית תאים חיים של VAMP7-pHluorin בתאי hTert-RPE1 מיקרו-פטורן בצורת טבעת. אושר כי הפרשת ליזומים אינה תהליך אקראי⁸-^{,9, ושאירועי} אקסוציטוזיס מציגים קיבוץ באשכולות. שימו לב, מצאנו כי אירועי אקסוציטוזיס מקובצים גם באזורים לא דביקים, מה שמצביע על כך שמולקולות הדבקה אינן המבנים היחידים שיכולים לגרום לנקודות חמות של הפרשה בממברנה פלזמה. אף על פי כן, הדבקת תאים אכן שפרו את התקבצות האשכולות. באופן עקבי, הניתוח שלנו זיהה אזורים מועשרים של אקסוציטוזיס שהיו ממוקמים בגבול בין האזורים הדביקים ולא דבקים.

Protocol

1. הכנת תאים מיקרו-פטרניים

1. תעבירת תאים
   1. יום אחד לפני transfection, זרע 2.5 x 10⁶ hTERT-RPE1 תאים לתוך באר אחת של 12 צלחת באר (2 x 2 ס"מ) ב 1 מ"ל של בינוני.
   2. ביום של transfection, להכין את תערובת transfection עם VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL של חוצץ, 0.8 μg של ה-DNA, 3 μL של תערובת טרנספד). דגירה במשך 10 דקות.
      הערה: VAMP7 הוא v-SNARE lysomal, התמזגו עם תג pHluorin זוהר. הגשושית pHluorin מרווה על ידי pH נמוך, אבל במהלך פרוטונים exocytosis משתחררים pHluorin מתחיל לפלוט^{אות 10,,11}.
   3. מוסיפים את תערובת הטרנס-פעולה לתאים במדיום שלהם.
   4. שנה את 4 השעות הבינוניות לאחר הוספת תערובת הטרנס-פעולה בתאים.
   5. השתמש בתאים לניסויים במהלך 24-48 השעות הבאות.
2. הכנת מיקרופטרן (שיטת פוטוליתוגרפיה)
   1. שוטפים את כיסויי הכיסוי (קוטר 25 מ"מ) באתנול ולתת להם להתייבש במשך 5 דקות.
   2. הפעל כיסויים על ידי תאורה תחת UV עמוק במשך 5 דקות.
   3. צור תא לח על-ידי לחות יסודית של מגבת נייר שעליה ממוקם סרט פרפין. להוסיף טיפות (30 μL עבור 22 מ"מ coverslip) של פולי-L-לייסין-שתל-פוליאתילן גליקול (PLL-g-PEG) פתרון (0.1 מ"ג / מ"ל, 10 mM HEPES, pH = 7.4) וכיסויי מקום עם המשטח מופעל עליהם. סגור את התא הלח עם החלק העליון ותרגם כיסויי במשך שעה אחת.
   4. לשטוף כיסויים 2x ב PBS ו 1x במים מזוקקים ולתת להם להתייבש.
   5. שוטפים את מסך הפוטו קוורץ במים מזוקקים ולאחר מכן עם אתנול או פרופנול. יבש את מסכה הצילום עם זרימת אוויר מסוננת.
      הערה: פוטו-מסכה קוורץ מצופה בצד אחד עם כרום אנטי-רפלקסיבי המכיל חורים בצורה של מיקרו-פטרנים. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במיקרו-פטרנים בצורת טבעת של 37 μm. כאשר UV עמוק הוא נוצץ על מסכה, האור יכול לעבור רק דרך חורים אלה^12.
   6. לחשוף את מסכה הצילום (בצד כרום מצופה) UV עמוק במשך 5 דקות כדי לנקות את פני השטח.
   7. הוסף טיפות מים קטנות (10 μL עבור כיסוי 20 מ"מ) בצד מצופה כרום של מסיכה. מניחים את כיסוי הכיסוי עם הצד PLL-g-PEG שטופלו על הטיפה ויבשו את המים הנוספים. ודא כי אין בועות אוויר טופס בין המסכה ואת כיסויי.
      הערה: כוח נימו של המים יהיה לשתק את כיסויי.
   8. לחשוף את מסיכה הצילום UV עמוק במשך 5 דקות עם הצד שאינו מצופה כרום למעלה (כיסויים מחוברים על פני השטח התחתון).
      הערה: האור יכול לעבור רק דרך החורים ולשנות את פני השטח שטופלו ב-PLL-g-PEG של כיסויים מתחת לסיכה.
   9. הסר את הכיסויים מהסיכה על-ידי הוספת עודפי מים.
      הערה: כיסויים אמורים לצוף במהירות.
   10. דגירה כיסויים בתמיסה של חלבוני מטריצה חוץ תאית (50 μg / מ"ל של פיברונקטין, 5 μg / מ"ל של פיברינוגן פלורסנט מדולל במים) על סרט פרפין בתא לח (כמו בשלב 1.2.3) עבור 1 שעה תחת מכסה המנוע זרימה למינאר כדי למנוע זיהום.
       הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה על-ידי אחסון הכיסויים ב- PBS ב- 4 °C.
3. זריעת תאים על משטחים מיקרו-פטרניים
   1. השתמש במחזיק כיסוי מגנטי שמתאים לגודל של כיסויי מיקרו-פטרונים כדי להרכיב את הכיסויים. ביום הרכישה, לחמם את מחזיק כיסוי ל 37 ° C כדי למנוע הלם תרמי עבור התאים במהלך השלבים הבאים.
   2. הכן את המדיום תבנית על ידי השלמת DMEM / F12 בינוני עם 20 mM HEPES ו 2% של פניצילין / סטרפטומיצין.
   3. המקום מכסה את המחזיק עם הצד micropatterned למעלה ולהוסיף תבנית בינונית ברגע כיסוי הוא על בסיס המחזיק. הוסף את החותם ושתק עם המכשיר המגנטי. ממלאים את מחזיק כיסויי הכיסוי בתבנית בינונית וסוו אותו עם מכסה הזכוכית.
      הערה: היה מהיר, כדי לא לאפשר כיסוי להתייבש. אין לשטוף את מחזיק כיסוי עם אתנול בין ניסויים, כי החותם עשוי לשמור על כמה אתנול, אשר יכול להגיב עם PLL-g-PEG ותוצאה של מתח התא. יש לשטוף את מחזיק כיסוי הכיסוי רק עם מי סבון. יתר על כן, המפרק יכול להיות דגירה במדיום דפוס ב 37 מעלות צלזיוס עבור 1 שעות כדי לדלל את המוצר שיורית.
   4. לאסוף תאי hTERT-RPE1 transfected על ידי trypsinization (0.5 מ"ל עבור לוח אחד 12 גם) ולהוסיף 1 מ"ל של 10% FBS DMEM / F12 בינוני.
   5. הוסף 0.5 x 10⁶ תאים hTERT-RPE1 transfected למחזיק כיסוי ולעקוף אותו מחדש. דגירה במשך 10 דקות באינקובטור.
   6. יש לשטוף את מחזיק כיסוי 5x עם תבנית בינונית כדי להסיר תאים שאינם מחוברים ושאריות FBS על ידי הוספת המדגם תבנית עם פיפטה אחת ושאף את המדיום עם פיפטה אחרת כדי ליצור זרימת כביסה. תמיד לשמור על נפח קטן של דפוס בינוני במחזיק כיסוי כדי למנוע ייבוש של התאים על כיסוי micropatterned, אשר יוביל למוות תא.
   7. דגירה באינקובטור במשך 3 שעות כדי לאפשר התפשטות תאים מלאה.

2. רכישת נתוני אקסוציטוזיס

1. הדמיה של אירועי אקסוציטוזיס
   1. מחזיק כיסוי מקום מתחת ל-TIRM. יש לזהות את האות על-ידי מצלמה רגישה עם תבנית ההדמיה הטובה ביותר הזמינה.
      הערה: בניסוי זה, מטרת עדשה 100x ומצלמת EMCCD עם 512 x 512 פיקסלים אזור זיהוי שימש להולידה גודל פיקסל של 160 נארם.
   2. חפש תא המביע VAMP7-pHluorin כי הוא מופץ באופן מלא (איור 1A).
      הערה: תאים המביעים VAMP7 ניתנים לזיהוי בבירור, מכיוון שהם מציגים אות ירוק.
   3. שנה את זווית הלייזר עד לזווית TIRF המאפשרת הדמיה של אירועי אקסוציטוזיס VAMP7-pHluorin. בצע רכישה של 5 דקות בתדר התואם לקצב האקסוציטוזיס ולעוות הזמן (בדרך כלל 3 הרץ, איור 1D)באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.
      הערה: לתאי hTERT-RPE1 יש קצב הפרשה lysomal של כ- 0.3 הרץ במיקרו-פטרנים. אקסוציטוזיס Lysosomal יש משך אופייני של 1 s. הוא מאופיין בעוצמת שיא ואחריו ריקבון אקספוננציאלי. דיפוזיה של הגשוש צריך להיות ברור בשלב זה(איור 1B, ג).
   4. עבור כל תא, לבצע גם רכישה של micropattern באמצעות תוכנת מיקרוסקופ(איור 1A).
2. רכישת קואורדינטות אקסוציטוזיס
   1. פתח את הסרט שנרכש עם ImageJ/FIJI. השתמש בקובץ | יבוא | רצף תמונות. מצא אירועי אקסוציטוזיס בעין. אירוע אקסוציטוזיס מאופיין במראה של אות בהיר ההתפשטות כלפי חוץ(איור 1).
   2. השתמש בכלי הנקודה כדי לסמן את מרכז האירוע האקסוצ'ית. השתמש ב'ניתוח' | למדוד כדי למדוד קואורדינטות X ו- Y, כמו גם את קואורדינטת הזמן (מספר פרוסה). בצע מדידות אלה עבור כל אירועי האקסוציטוזיס של הסרט.
   3. שמור את התוצאות (תוצאות | קובץ | שמירה בשם). הכן קובץ טקסט עבור כל תא מנותח בשם "Results(cell_name).txt" המכיל את נקודות הציון של הפרוסה, קואורדינטות X ו- Y עבור כל אירועי האקסוציטוזיס בסדר זה.
      
      קובץ הטקסט אמור להיראות כך:
      רדיוס קוטר של מזהה X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      הערה: הקפד להחליף את כל פסיקים בנקודות.
   4. מדוד את המרכז והקטר של כל תא באמצעות "הכלי הסגלגל". התאימו מעגל מושלם (אל תשתמשו בסגלגל) והשתמשו ב "מדידה" כדי להשיג את קואורדינטות X ו-Y וקוטרו של פרט. שמור את זהותו של כל תא (מזהה), קואורדינטות X ו- Y, קוטר ורדיוס של Feret (קוטר/2) בקובץ טקסט בשם "spherical parameter.txt".
      
      קובץ הטקסט אמור להיראות כך:
      רדיוס קוטר של מזהה X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      הערה: הקפד להחליף את כל פסיקים בנקודות.
   5. מדוד את עובי טבעת המיקרו-פפטרן (אורך ההדבקה) בעזרת הכלי הישר ושמור את מזהה התא, רדיוס התא (מהקובץ: "פרמטר כדורי.txt") ואורך הדבקה בקובץ טקסט בשם "Pattern parameter.txt". חשב את אורך ההדבקה המנורמל על-ידי חלוקת אורך ההדבקה לפי רדיוס התא.
      הערה: הקפד להחליף את כל פסיקים לפי נקודות.
      
      הקובץ אמור להיראות כך:
      אורך הדבקת רדיוס תא מזהה אורך הדבקה מנורמל
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. ניתוח מרחבי של תא יחיד

1. חבילת R והתקנה
   הערה: חבילת R עבור ניתוח זה מנצלת את חבילת Spatstat^{13 כדי} לחשב את הצפיפות הדו-ממדית (2D) ואת פונקציית K של ריפלי. הקוד הוא קוד פתוח ומשתמש בקבצי טקסט שתוארו בעבר.
   1. הורד והתקן R https://www.r-project.org/ (גירסה 3.5.2 שימש בניתוח זה).
   2. הורד את החבילה (ואת ערכת הנתונים הדגמה) מ: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
   3. התקן את החבילה ב- R Studio באמצעות "כלים" באמצעות "התקנת חבילות". בחר "קובץ ארכיון החבילה ( .zip; .tar.gz)" עבור הקטגוריה "התקן מ:" ובחר את קובץ החבילה. לחץ על "התקן".
   4. טען את החבילה עם הפונקציה "ספריה ("ExocytosisSpatialAnalysis") " על-ידיכתיבת פקודה זו בסטודיו R והקשה על "Enter".
   5. הפעל את החבילה עם הפונקציה "ESA()" על-ידי כתיבת פקודה זו בסטודיו R והקשה על "Enter".
      הערה: ממשק משתמש ייפתח.
   6. בחר את הספריה עבור ערכת הנתונים (קבצי .txt) ובסי ספריה עבור קווי פלט.
      הערה: ניתן לשנות פרמטרים של הניתוח (ראה טקסט להלן) באמצעות ממשק משתמש.
   7. קובץ Script זה יתחיל ויבצע את הניתוח באופן אוטומטי. הוא מספק קבצי .pdf של קוויווים תואמים וקבצי .txt המכילים תוצאות מספריות.

תוצאות

המאפיינים spatiotemporal של אירועי אקסוציטוזיס נותחו lysosomes חזותי על ידי VAMP7-pHluorin^10,,11 בתאי hTert-RPE1. hTert-RPE1 תאים הם תאים לא טרנספורמיים לאמץ היטב micropatterning, שימשו בהרחבה במחקרים מבוססי^{מיקרו-פטרן קודמים 4,14}. VAMP7 הוא lysomal v-SNARE¹⁵ כי ...

Discussion

עקבנו אחר אירועי אקסוציטוזיס מהתא הליזומלי על ידי TIRFM הדמיית תאים חיים של VAMP7-pHluorin בתאים מיקרו-פטרן בצורת טבעת מנורמל וביצע ניתוח סטטיסטי קפדני של הפרמטרים המרחביים של אירועי אקסוציטוזיס. מתוך שימוש בתפקוד ה-K של ריפלי ומבחן סטטיסטי המבוסס על מרחק השכן הקרוב ביותר, אישרנו כי הפרשה מlysosomes אי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.