Quantificazione dei parametri Spatiotemporal dell'esocitosi cellulare nelle cellule micromodellate

Riepilogo

L'imaging vivo dell'esocitosi lisosomica sulle cellule micromodelle consente una quantificazione spaziale di questo processo. La normalizzazione della morfologia tramite micromodelli è uno strumento eccezionale per scoprire le regole generali sulla distribuzione spaziale dei processi cellulari.

Abstract

L'imaging dal vivo della proteina di membrana associata alla vescicola 7 (VAMP7) con etichetta Soluble N-ethylmaleimide-sensitive Attachment protein REceptor (v-SNARE) Proteina della membrana associata alla vescicolo 7 (VAMP7) dalla microscopia a fluorescenza a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM) è un modo semplice per esplorare la secrezione dal compartimento lisosomiale. Sfruttando la coltura cellulare su superfici micromodellate per normalizzare la forma cellulare, sono stati impiegati una varietà di strumenti statistici per eseguire un'analisi spaziale dei modelli secretori. Utilizzando la funzione K di Ripley e un test statistico basato sulla distanza vicina più vicina (NND), abbiamo confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processo casuale, ma mostra un clustering significativo. Da notare, la nostra analisi ha rivelato che gli eventi di esocitosi sono raggruppati anche in aree non di aesione, indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che possono indurre punti caldi secretori alla membrana plasmatica. Tuttavia, abbiamo scoperto che l'adesione cellulare migliora il clustering. Oltre alle aree adesive e non aesive definite con precisione, la geometria circolare di questi micromodelli consente l'uso di coordinate polari, semplificando le analisi. Abbiamo usato la stima della densità del kernel (KDE) e la funzione di distribuzione cumulativa sulle coordinate polari degli eventi di esocitosi per identificare le aree arricchite di esocitosi. Nelle cellule a micromodello ad anello, il clustering si è verificato al confine tra le aree adesive e non aesive. La nostra analisi illustra come gli strumenti statistici possono essere impiegati per studiare le distribuzioni spaziali di diversi processi biologici.

Introduzione

L'esocitosi è un processo cellulare universale in cui una vescica si fonde con la membrana plasmatica e rilascia il suo contenuto. La vescicola può fondersi totalmente con la membrana plasmatica (fusione completa) o creare un poro di fusione che rimane aperto durante un tempo limitato (bacio e corsa)¹. Per esempio, le proteine appena sintetizzate vengono rilasciate nel mezzo extracellulare dalle vesicelle che provengono dal complesso Golgi. Questa via biosintetica e anterograda è primordiale, soprattutto negli organismi multicellulari, per seceare peptidi di segnalazione (ad esempio, ormoni, neurotrasmettitori) e componenti a matrice extracellulare (ad esempio, collagene), così come per il traffico di proteine transmembrane alla membrana plasmatica. Inoltre, le secrezioni possono verificarsi da diversi endsomes: 1) riciclare endosomi al fine di riutilizzare le proteine transmembrane; 2) corpi multiversicolari (MVB) per rilasciare esosomi; e 3) lisosomi per il rilascio di enzimi proteolitici. La secrezione endosomica ha dimostrato di essere importante per la crescita dei neuriti, la formazione di pseudopodi, la riparazione della membrana plasmatica e la segnalazione dipendente^{dall'ATP 2}.

Per studiare l'esocitosi a livello di singola cellula, sono state impiegate diverse tecniche. Patch-clamp consente il rilevamento di singoli eventi di esocitosi con un'alta risoluzione temporale in una vasta gamma di cellule viventi³. Tuttavia, questo metodo non fornisce informazioni sulla localizzazione degli eventi di esocitosi, né dal raggruppamento che si verifica. La microscopia elettronica consente la visualizzazione diretta di eventi esoctici ad alta risoluzione spaziale, e in combinazione con l'immunoetichettazione fornisce informazioni sulla specificità dei compartimenti e delle molecole coinvolte. Uno svantaggio di questo approccio è la mancanza di informazioni sulle dinamiche del processo, nonché la sua incapacità di eseguire studi ad alto rendimento. Approcci di microscopia leggera come la microscopia a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM), che sfrutta il campo evanescente per illuminare i fluorofori nelle vicinanze del cos coverslip (100 nm), fornisce una buona risoluzione temporale e spaziale per studiare gli eventi di esocitosi. Tuttavia, questo metodo è compatibile solo con le cellule aderenti e può essere applicato solo alla parte ventrale / inferiore delle cellule.

Da notare, la membrana plasmatica rivela una significativa eterogeneità basata su complessi adesivi che sono presenti solo in aree ristrette. Questa eterogeneità limita, ad esempio, l'adozione di diversi ligandi⁴. Allo stesso modo, è stato recentemente riferito che la secrezione dal complesso di Golgi è concentrata in "punti caldi" nella membrana^{plasmatica 5}. Inoltre, è noto che alcuni carichi sono secreti attraverso l'esocitosi associata all'adesione focale⁶. Pertanto, si dovrebbe prestare particolare attenzione alla questione se gli eventi di esocitosi siano distribuiti casualmente nello spazio o se siano concentrati in aree specifiche della membrana plasmatica. Diversi strumenti statistici basati sulla funzione K di Ripley sono stati proposti per esplorare queste^{domande 7,8,9}. Il nostro approccio combina questi strumenti con micromodello per controllare la forma delle cellule e l'eterogeneità della membrana plasmatica. Oltre a fornire un mezzo per distinguere tra aree adesive e non analizzate, questa tecnica consente anche il confronto tra diverse cellule e condizioni e aumenta la potenza delle analisi statistiche.

Qui impieghiamo una varietà di strumenti statistici per studiare la distribuzione spaziale degli eventi di esocitosi dal compartimento lisosomiale monitorato dall'imaging cellulare vivo TIRFM di VAMP7-pHluorin nelle cellule hTert-RPE1 normalizzate a micromodello ad anello. È stato confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processo^{casuale 8,9} e che gli eventi di esocitosi esibiscono il clustering. Da notare, abbiamo scoperto che gli eventi di esocitosi sono raggruppati anche in aree non aesive, indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che possono indurre punti caldi secretori alla membrana plasmatica. Tuttavia, l'adesione cellulare ha migliorato il clustering. Coerentemente, la nostra analisi ha identificato aree arricchite di esocitosi che si trovavano al confine tra le aree adesive e non aesive.

Protocollo

1. Preparazione di cellule micromodelli

1. Trasfezione delle cellule
   1. Un giorno prima della trasfezione, seme 2,5 x^{10 6} hTERT-RPE1 cellule in un pozzo di una piastra 12 pozzo (2 x 2 cm) in 1 mL di media.
   2. Il giorno della trasfezione, preparare la miscela di trasfezione con plasmide VAMP7-pHluorin (100 L di tampone, 0,8 g di DNA, 3 L di miscela di trasfezione). Incubare per 10 min.
      NOTA: VAMP7 è un lysosomal v-SNARE, fuso con un tag pHluorin luminale. La sonda pHluorin viene sfociata da un basso pH, ma durante l'esocitosi vengono rilasciati protoni e la pHluorina inizia a emettere un^{segnale 10,11}.
   3. Aggiungere il mix di trasfezione alle cellule nel loro mezzo.
   4. Cambiare il mezzo 4 h dopo aver aggiunto il mix di trasfezione sulle cellule.
   5. Utilizzare le cellule per gli esperimenti durante i prossimi 24-48 h.
2. Preparazione micromodello (metodo fotolitigrafico)
   1. Lavare le coperture (25 mm di diametro) in etanolo e lasciarle asciugare per 5 minuti.
   2. Attivare coverlips per illuminazione sotto UV profondo per 5 min.
   3. Creare una camera umida umidificando accuratamente un asciugamano di carta su cui è posizionata una pellicola di paraffina. Aggiungere le gocce (30 l per 22 mm) della soluzione Poly-L-Lysine-graft-Polyethylene Glycol (PLL-g-PEG) (0,1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH - 7,4) e posizionare i coperture con la superficie attivata su di essi. Chiudere la camera umida con una parte superiore e incubare coverslips per 1 h.
   4. Lavare i coperture 2x in PBS e 1x in acqua distillata e lasciarli asciugare.
   5. Lavare la fotomaschera al quarzo con acqua distillata e poi con etanolo o propanolo. Asciugare la fotomaschera con il flusso d'aria filtrato.
      NOTA: La fotomaschera al quarzo è rivestita su un lato con cromo antiriflesso che contiene fori sotto forma di micromodelli. In questo protocollo viene utilizzata una fotomaschera contenente micromodelli a forma di anello di 37 m. Quando i raggi UV profondi sono brillati sulla fotomaschera, la luce può passare solo attraverso questi fori¹².
   6. Esporre la fotomaschera (lato rivestito di cromo) ai raggi UV profondi per 5 minuti per pulire la superficie.
   7. Aggiungete piccole gocce d'acqua (10 L per un coperture da 20 mm) sul lato cromato della fotomaschera. Posizionare il con il lato trattato con PLL-g-PEG sulla goccia e asciugare l'acqua in più. Assicurarsi che non si formino bolle d'aria tra la maschera e le coperture.
      NOTA: La forza capillare dell'acqua immobilizza le coperture.
   8. Esporre la fotomaschera a raggi UV profondi per 5 minuti con il lato non rivestito di cromo verso l'alto (le copertine sono attaccate sulla superficie inferiore).
      NOTA: la luce può passare solo attraverso i fori e modificare la superficie trattata da PLL-g-PEG di coverlips sotto la fotomaschera.
   9. Rimuovere le copertine dalla fotomaschera aggiungendo acqua in eccesso.
      NOTA: Coverslips dovrebbe fluttuare rapidamente.
   10. Incubare le coperture in una soluzione di proteine a matrice extracellulare (50 g/mL di fibronectina, 5 g/mL di fibrinogeno fluorescente diluito in acqua) su pellicola di paraffina in una camera umida (come nel punto 1.2.3) per 1 h sotto una cappa di flusso laminare per evitare la contaminazione.
       NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa a questo punto memorizzando le coperture in PBS a 4 gradi centigradi.
3. Semina cellulare su superfici micromodellate
   1. Utilizzare un supporto di coperture magnetiche che si adatti alle dimensioni delle coperture micromodelle per montare le coperture. Il giorno dell'acquisizione, riscaldare il supporto di coperture a 37 gradi centigradi per evitare shock termici per le cellule durante le fasi successive.
   2. Preparare il modello medio integrando il supporto DMEM/F12 con 20 mM HEPES e il 2% di penicillina/streptomicina.
   3. Posizionare i coperture nel supporto con il lato micromodello verso l'alto e aggiungere il supporto del motivo non appena il coverslip è sulla base del supporto. Aggiungere la guarnizione e immobilizzare con il dispositivo magnetico. Riempire il supporto coverslip con il mezzo modello e chiuderlo con il coperchio di vetro.
      NOTA: Sii veloce, per non lasciare che il coverslip si asciughi. Non lavare il supporto di coperture con etanolo tra un esperimento e l'altro, perché la guarnizione potrebbe trattenere un po' di etanolo, che può reagire con PLL-g-PEG e provocare stress cellulare. Lavare il supporto per le coperture solo con acqua sapo impossibile. Inoltre, l'articolazione può essere incubata nel mezzo di riferimento a 37 gradi centigradi per 1 h per diluire il prodotto residuo.
   4. Raccogliere le cellule hTERT-RPE1 trasfettate mediante trypsinization (0,5 mL per una piastra di 12 ben) e aggiungere 1 mL del 10% di media FBS DMEM/F12.
   5. Aggiungere 0,5 x 10⁶ celle hTERT-RPE1 trasfettate al supporto della barra degli e riconorla. Incubare per 10 minuti nell'incubatrice.
   6. Lavare il supporto coverslip 5x con motivo medio per rimuovere le cellule non attaccate e l'FBS residuo aggiungendo il mezzo modello con una pipetta e aspirando il supporto con un'altra pipetta per creare un flusso di lavaggio. Mantenere sempre un piccolo volume di modello medio nel supporto di coverslip per evitare l'essiccazione delle cellule sul coperture micromodelli, che porterà alla morte cellulare.
   7. Incubare nell'incubatrice per 3 h per consentire la diffusione completa delle cellule.

2. Acquisizione dei dati di esocitosi

1. Imaging di eventi di esocitosi
   1. Posizionare il supporto per le coperture sotto un TIRM. Il segnale deve essere rilevato da una telecamera sensibile impostata con il miglior formato di imaging disponibile.
      NOTA: in questo esperimento, è stato utilizzato un obiettivo obiettivo obiettivo 100x e una fotocamera EMCCD con area di rilevamento 512 x 512 pixel, dando origine a una dimensione in pixel di 160 nm.
   2. Cercare una cella che esprima VAMP7-pHluorin completamente diffusa (Figura 1A).
      NOTA: Le celle che esprimono VAMP7 sono chiaramente identificabili, perché presentano un segnale verde.
   3. Modificare l'angolo del laser fino a raggiungere un angolo TIRF che consenta la visualizzazione degli eventi di esocitosi VAMP7-pHluorin. Eseguire un'acquisizione di 5 minuti a una frequenza compatibile con la frequenza di esocitosi e la scala temporale (in genere 3 Hz, Figura 1D) utilizzando il software al microscopio.
      NOTA: le cellule hTERT-RPE1 hanno una frequenza di secreria lisosomica di circa 0,3 Hz sui micromodelli. L'esocitosi lisosomica ha una durata tipica di 1 s. È caratterizzato da un'intensità di picco seguita da un decadimento esponenziale. La diffusione della sonda dovrebbe essere evidente in questo momento (Figura 1B, C).
   4. Per ogni cellula, eseguire anche un'acquisizione del micromodello utilizzando il software al microscopio (Figura 1A).
2. Acquisizione delle coordinate dell'esocitosi
   1. Aprire il filmato acquisito con ImageJ/FIJI. Utilizzo di File Proprietà Import . Sequenza immagine. Trova eventi di esocitosi a occhio. Un evento di esocitosi è caratterizzato dall'aspetto di un segnale luminoso che si diffonde verso l'esterno (Figura 1).
   2. Utilizzare lo strumento punto per contrassegnare il centro dell'evento esocitico. Utilizzare l'opzione Analizza Misurare per misurare le coordinate X e Y, nonché la coordinata temporale (numero di sezione). Eseguire queste misurazioni per tutti gli eventi di esocitosi del film.
   3. Salvare irisultati ( Risultati Proprietà File . Salva con nome). Preparare un file di testo per ogni cella analizzata denominata "Results(cell_name).txt" che contiene le coordinate slice, X e Y per tutti gli eventi di esocitosi in tale ordine.
      
      Il file di testo dovrebbe essere simile al seguente:
      ID X X Raggio del diametro di Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      NOTA: fare attenzione a sostituire tutte le virgole con punti.
   4. Misurare il centro e il diametro di ogni cella utilizzando lo "Strumento Ovale". Adattare un cerchio perfetto (non usare un ovale) e utilizzare "Misura" per ottenere le coordinate X e Y e il diametro di Feret. Salvare l'identità di ogni cella (ID), le coordinate X e Y, il diametro di Feret e il raggio (diametro/2) in un file di testo denominato "Spherical parameter.txt".
      
      Il file di testo dovrebbe essere simile al seguente:
      ID X X Raggio del diametro di Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      NOTA: fare attenzione a sostituire tutte le virgole con punti.
   5. Misurare lo spessore dell'anello di micromodello (lunghezza di adesione) con lo strumento dritto e salvare l'ID della cella, il raggio della cella (dal file: "Spherical parameter.txt") e la lunghezza dell'adesione in un file di testo denominato "Pattern parameter.txt". Calcolare la lunghezza dell'adesione normalizzata dividendo la lunghezza dell'adesione per il raggio della cella.
      NOTA: Fare attenzione a sostituire tutte le virgole con punti.
      
      Il file dovrebbe essere simile al:
      ID Lunghezza di adesione del raggio della cella Lunghezza di adesione normalizzata
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. Analisi spaziale a singola cellula

1. Pacchetto R e installazione
   NOTA: il pacchetto R per questa analisi sfrutta il pacchetto Spatstat¹³ per calcolare la densità bidimensionale (2D) e la funzione K di Ripley. Il codice è open source e utilizza file di testo descritti in precedenza.
   1. Scaricare e installare R da https://www.r-project.org/ (è stata utilizzata la versione 3.5.2 in questa analisi).
   2. Scarica il pacchetto (e il set di dati demo) da: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
   3. Installare il pacchetto in R Studio utilizzando "Strumenti" utilizzando "Installa pacchetti". Selezionare "Package Archive File (.zip; .tar.gz)" per la categoria "Installa da:" e scegliere il file del pacchetto. Premere "Installa".
   4. Caricare il pacchetto con la funzione "library("ExocytosisSpatialAnalysis")" scrivendo questo comando in R studio e premendo "Invio".
   5. Eseguire il pacchetto con la funzione "ESA()" scrivendo questo comando in R studio e premendo "Invio".
      NOTA: si aprirà un'interfaccia utente.
   6. Selezionare la directory per il set di dati (file con estensione txt) e una directory per i grafici di output.
      NOTA: i parametri dell'analisi (vedere il testo riportato di seguito) possono essere modificati tramite un'interfaccia utente.
   7. Questo script verrà avviato automaticamente ed eseguito l'analisi. Fornisce file .pdf di grafici corrispondenti e file .txt contenenti risultati numerici.

Risultati

Le caratteristiche spatiotemporal degli eventi di esocitosi sono state analizzate dai lisosomi visualizzati da VAMP7-pHluorin^10,11 nelle cellule hTert-RPE1. Le cellule hTert-RPE1 sono cellule nontransformed che adottano bene al micromodello e sono state ampiamente utilizzate nei precedenti studi basati su^{micromodello 4,14}. VAMP7 è un lisosomico v-SNARE¹⁵ che è stato etichettato c...

Discussione

Abbiamo monitorato gli eventi di estosi dal compartimento lisosomiale dall'imaging cellulare live TIRFM di VAMP7-pHluorin in cellule normalizzate a micromodello a forma di anello ed abbiamo eseguito una rigorosa analisi statistica dei parametri spaziali degli eventi di esocitosi. Impiegando la funzione K di Ripley trasformata e un test statistico basato sulla distanza vicina più vicina, abbiamo confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processo^{casuale 8,9}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.